综述：用于防治虾类疾病的生物控制方法：综合综述及一种细菌性疾病的生物控制实践

《Reviews in Aquaculture》：Biocontrol for Shrimp Disease: Comprehensive Review and a Bacterial Disease Biocontrol Practice

　　**摘要**

生物防治是疾病控制的关键策略，因为它环保且适用范围广泛。本综述详细介绍了在水产养殖中的生物防治方法，特别是在养虾业中的应用。养虾中的生物防治主要依赖于四种策略：（i）通过Bdellovibrio或噬菌体直接杀死病原体；（ii）利用益生菌抑制肠道病原体；（iii）通过益生菌、生物絮凝或双壳类动物和鱼类减少环境中的病原体；（iv）利用捕食性鱼类阻断病原体的传播。“虾鱼混养”系统作为一种方便、有效且经济可行的疾病防治方法，重点在于阻断病原体的传播途径。该方法对白斑综合征病毒（WSSV）的防治效果已经得到了充分证实。然而，其在其他虾类疾病中的应用尚不广泛。本文设计并验证了一种“虾鱼混养”生物防治方案，对抗Vibrio harveyi的效果显著。这些发现成功扩展了“虾鱼混养”系统在控制虾类细菌性疾病中的应用，为防治多种虾类病原体引起的疾病提供了新的视角和方法。

**1 引言**

养虾在水产养殖领域占据重要地位。由于其高经济价值和高效的蛋白质转化率，它不仅满足了全球对优质蛋白质的需求[1-3]，还成为许多国家经济发展的关键驱动力，帮助数百万人摆脱贫困[4-6]。尽管养虾业在技术上取得了进展，但疾病仍然是生产的主要限制因素[7, 8]。养虾仍然频繁遭受病原体的侵袭，例如白斑综合征病毒（WSSV）、十足目荧光病毒1（DIV1）、Vibrio属细菌以及Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）[9-12]。这些病原体的高毒力和传播性，加上传统控制措施的效果有限，导致严重的生产损失，包括生长受阻和死亡率上升[7, 13]。这些损失每年高达数十亿美元，严重影响了养虾业的稳定性和增长[14]。传统的疾病控制方法依赖抗生素和化学药剂，但这些方法因导致药物残留、促进抗菌素耐药性和污染环境而受到越来越多的批评[15-17]。建立基于生态调节的生物防治系统对于确保养虾业的绿色、健康和可持续发展至关重要[18, 19]。本综述概述了养虾中的潜在生物防治技术。

**2 生物防治**

**2.1 什么是生物防治**

生物防治是一种利用生物体来管理害虫和疾病的长期且历史悠久的策略[20]。早期的例子可以追溯到几个世纪前，例如中国古代在柑橘园中使用捕食性蚂蚁（Oecophylla smaragdina）来控制毛虫和大甲虫[21-23]。如今，生物防治的范围已显著扩大，广泛应用于人类健康、环境保护、农业、畜牧和渔业[20, 24, 25]。从科学角度来看，生物防治是指利用天敌或生物防治生物（脊椎动物或无脊椎动物、植物、微生物或病毒）来控制目标生物的种群[20, 26-28]。

**2.2 生物防治的重要性**

生物防治对人类健康和生物基产业至关重要，是实现“同一健康”目标的关键策略[29-31]。与传统有害生物的控制方法相比，生物防治具有四个主要优势。首先，它提升了公共卫生和安全性。通过减少对传统化学药剂的依赖，生物防治减少了工人和消费者的毒性暴露[32, 33]。其次，它有利于环境保护和生物多样性。由于其高度的靶向性，生物防治避免了广谱杀虫剂对有益生物的伤害，从而保持了生态平衡和生物多样性[25]。第三，它确保了有害生物控制的可持续性。与通常会导致病原体快速进化的化学处理方法不同，生物防治通过多种作用机制（如捕食、竞争和诱导抗性）共同抑制病原体的抗性发展[34-36]。生物防治剂还具有更持久的保护效果，因为一旦建立，它们能够在环境中存活并繁殖，提供长期的自我维持保护[20, 37]。第四，它带来了显著的经济和社会效益。采用这些方法生产的产品能够进入高端有机市场，并满足严格的国际标准。虽然初期实施可能需要较高的投资，但长期减少对化学药剂的需求可以降低生产成本，并减轻疾病爆发带来的经济损失[38, 39]。

**2.3 生物防治策略**

生物防治的基本策略是利用生物体直接抑制目标生物（如害虫、病原体或入侵物种），或打破其传播链中的关键环节[40-42]（图1）。例如，通过饲料颗粒施用的Monacrosporium sinense和Pochonia chlamydosporia真菌组合对放牧行业中寄生性胃肠道线虫的感染幼虫有效[44]。人工饲养的Aphidius gifuensis蜂已被广泛且有效地用于控制蚜虫种群，从而限制了蚜虫对作物的损害[25, 52]。自20世纪60年代末以来，大量释放Anastatus japonicus成功控制了荔枝蝽（Tessaratoma papillosa，半翅目： Pentatomidae）[53]。利用大斑啄木鸟（Dendrocopos major）作为天然捕食者，可以有效控制蛀木害虫Anoplophora glabripennis[47]。在这些方法中，生物体被用来直接抑制病原体或害虫。Wolbachia内共生细菌被引入Aedes aegypti种群，以减少寨卡病毒、登革热和基孔肯雅病毒等通过蚊子传播的疾病[48, 49]。Metarhizium通过寄生其主要媒介——松锯甲虫（Monochamus alternatus）来降低松树林萎蔫病[54]。在古巴，使用竞争性蜗牛显著减少了Galba cubensis的密度，后者是肝片虫的主要中间宿主[50]。捕食者如美洲狮和灰狼通过选择患病个体，减少了鹿和麋鹿慢性消耗病（CWD）的爆发[51]。这些方法通过阻断病原体的传播途径（例如抑制媒介或减少感染个体数量）来实现有效的疾病控制。

**3 水产养殖中的生物防治**

生物防治在水产养殖中被广泛应用以控制疾病。在鱼类疾病控制方面，清洁鱼（如Labrus bergylta、Cyclopterus lumpus）和虾（如Lysmata amboinensis和L. vittata）为鲑鱼养殖提供了可行的非化学管理方法[55, 56]。Imsland等人报告称，在引入C. lumpus 54天后，成年雌性海虱的清除率超过93%[57]。迄今为止，清洁鱼的应用已成为全球水产养殖中大规模的生物防治措施[58, 59]。对于细菌性疾病，Bdellovibrio、噬菌体和益生菌是有效的生物防治剂，可对抗如Aeromonas、Salmonella和Vibrio等病原体[60-64]。Guo等人报告称，Bdellovibrio sp. FSBD5将感染Aeromonas hydrophila的美洲鳗鱼（Anguilla rostrata）的死亡率从87.6%降低到35.7%[65]。Dang等人显示，phage PVN02将感染A. hydrophila的条纹鲶鱼的死亡率从68.3%降至8.33%[66]。Guimar?es等人证明，Bacillus subtilis和Lactobacillus plantarum与疫苗结合使用，可将感染Streptococcus agalactiae的尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）的死亡率从60.0%降低到3.0%[67]。由于贝类缺乏适应性免疫系统，生物防治策略对于贝类疾病管理至关重要。生物防治主要利用益生菌来缓解细菌爆发，尤其是在易感的幼体阶段[68]。例如，Hesser等人显示，使用新型益生菌组合可提高感染Vibrio coralliilyticus的太平洋牡蛎幼体的存活率达82%[69]。生物防治策略在甲壳类养殖中也非常重要。对于细菌性疾病，广泛使用Bdellovibrio、噬菌体和益生菌进行控制[70-72]。对于难以直接针对的病毒性疾病，阻断传播途径是控制虾类疾病的有效方法。使用捕食性鱼类选择性地清除患病虾已被证明可以有效控制WSSV，从而减少感染个体数量并遏制病毒传播[38, 73]。以下部分将具体介绍这些生物防治生物在养虾中的应用。

**4 养虾中的生物防治**

在养虾中，病原体的爆发受到养殖环境、宿主易感性和病原体特性的复杂相互作用的影响。生物防治在此利用病原体的特性来选择功能性的生物群，直接杀死病原体、抑制肠道病原体或阻断传播途径（图2）。以下讨论详细介绍了从微生物拮抗剂和益生菌调节到使用特定鱼类清除患病个体的各种实际应用。这些策略共同旨在建立一个多维度、综合性的生物安全框架，以管理虾类疾病。**图2**显示了养虾中的生物防治策略：杀死病原体（绿色）、抑制肠道病原体（蓝色）、减少环境中的病原体（棕色）和阻断病原体的传播途径（红色）。

**4.1 直接杀死病原体**

生物防治生物，如噬菌体和Bdellovibrio，提供了针对病原细菌的定向、非抗生素控制，尤其是对抗多重耐药（MDR）革兰氏阴性病原体。噬菌体会裂解特定的宿主，而Bdellovibrio则会侵入并消耗细菌，为克服抗性和减少生物膜提供了有希望的替代方案[74]。噬菌体是感染并在细菌细胞内复制的病毒[43]。在养虾中，噬菌体提供了一种管理目标细菌的方法，同时不会伤害非致病菌株[43]。Vibrio疾病是养虾中的主要死亡原因之一[8]。已经发现并使用多种噬菌体来治疗虾的弧菌病。Fu等人从虾养殖废水中共分离出噬菌体vB_ValM_PVA8，证明其能够裂解V. alginolyticus和V. parahaemolyticus，并进一步证实其在治疗V. parahaemolyticus感染虾中的有效性[75]。Nattan Stalin等人从印度东南部的沿海水域中分离出新的噬菌体（VHM1、VHM2和VHS1），证明噬菌体处理显著提高了感染V. harveyi的Penaeus monodon幼体的存活率，支持了基于噬菌体的生物防治潜力[76]。噬菌体在塑造微生物群落和调节生态系统中的细菌种群方面也起着关键作用[77]。在养虾中，噬菌体可以改变虾养殖环境和肠道中的微生物组成，从而减少病原体的传播[43]。Dongdong Song等人分离出一种裂解V. parahaemolyticus的噬菌体，并表明噬菌体处理不仅增强了感染虾的非特异性免疫反应，还恢复了肠道微生物多样性，有助于修复肠道菌群失调[78]。尽管有这些优势，噬菌体疗法仍面临若干挑战。一方面，溶原性噬菌体可能将其DNA整合到细菌基因组中，从而增加细菌的毒性[79]；另一方面，在缺乏噬菌体检测手段的情况下，细菌裂解可能导致内毒素释放，可能引发败血症[80]。因此，特定噬菌体的治疗使用需要对其本身及其易感宿主进行详细评估。此外，噬菌体的宿主特异性限制了其广谱应用，而目标细菌中出现抗性突变体可能会影响其长期治疗效果[81, 82]。噬菌体制剂的可持续性和应用方法仍需进一步研究。Bdellovibrio属于Bdellovibrio-and-like-organisms（BALOs）类群，这类革兰氏阴性细菌以捕食其他革兰氏阴性细菌为生[45]。Bdellovibrio作为生物防治剂的潜力源于其独特的捕食生命周期：它在一种称为bdelloplast的特殊结构内复制，最终裂解释放后代以寻找新的细菌[45]。在养虾中，Bdellovibrio已被用于对抗Proteus penneri[83]、V. alginolyticus[84]、V. cholerae[71]、V. parahaemolyticus[85, 86]和其他Vibrio物种。与噬菌体类似，Bdellovibrio也显示出治疗细菌性疾病[84]以及改善虾肠道[37]和养殖环境[87]中微生物群的潜力。与噬菌体相比，Bdellovibrio的捕食范围更广[88]。为了有效地将其开发为生物控制剂，需要更多的研究来了解其在目标环境中的捕食范围和捕食机制[88]。




4.2 抑制肠道病原体

肠道微生物群的失调和机会性病原体的增殖是导致虾疾病爆发的关键因素之一[89]。因此，通过有益微生物抑制病原体在虾肠道内的定植和生长是疾病管理的关键策略。这些益生菌可以通过饲料、直接投水或使用生物絮体技术（BFT）[90]进行现场富集来应用。以下部分详细介绍了这些功能性益生菌及其在提高虾疾病抵抗力方面的作用。益生菌是基于细菌的产品，利用有益细菌来促进健康、预防多种疾病并抑制水产养殖中的病原体生长[70]。益生菌通过多种机制发挥作用，例如增强免疫反应、产生抗菌化合物、调节肠道微生物群、竞争营养物质和结合位点以及促进酶活性[91-93]。通过与病原细菌的竞争排除，通过干扰和利用，可以提高益生菌在虾体内的效率[94]，并支持疾病生物控制的概念。乳酸菌（LAB）作为有效的虾益生菌，通过产生抗菌化合物和竞争排除来抑制病原菌[19]，已在单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、弧菌属（Vibrio spp.）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等物种中显示出有效性[95]。同样，芽孢杆菌属（Bacillus）也是很有前途的虾益生菌候选者，因为它们已被证明对食品使用是安全的，并且能够产生多种抗菌化合物。例如，Bacillus pumilus H2产生阿米库马克辛A（amicoumacin A），可以破坏弧菌的细胞膜[96]。Bacillus sp. NFMI-C产生群体感应抑制剂（quorum-quenching enzymes），从而破坏AHL信号，防止弧菌致病[97, 98]。此外，属于弧菌属[99-101]、假单胞菌属[102, 103]、伪变单胞菌属[104, 105]、窄芽孢杆菌属[106]和链霉菌属[107-109]的细菌也被证明对致病性弧菌具有拮抗作用，尽管具体的机制尚未完全阐明。然而，尽管有这些好处，严格的菌株特定安全性评估仍然是必不可少的。例如，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）与斑节对虾（Penaeus monodon）的大规模死亡[110]和凡纳梅虾（L. vannamei）的白斑病[111]有关。因此，选择用于生物控制的益生菌菌株应进一步研究菌株的特定特性、益生菌的竞争生存策略以及其在体内的效果验证[94]。




4.3 减少环境病原体

水环境是生产的基本介质，其稳定性和健康状况直接影响养殖虾的生长和健康[112]。越来越多地考虑使用生物控制策略来管理养殖水中的病原体负荷。直接应用于水产养殖水的益生菌可以有效控制弧菌并稳定水质。生物絮体技术（BFT）通过微生物群落管理来调节水质。滤食性动物的整合利用它们固有的过滤能力减少悬浮颗粒物，包括潜在的病原体。这种基于生态系统的方法优化了碳源的利用并增加了养殖系统内的生物多样性，从而提高了系统稳定性，减少了环境病原体，并防止了疾病爆发。因此，这些策略为虾养殖提供了一种有前景的方法。益生菌已经超越了简单的肠道调节功能，扩展到了水质管理和虾类水产养殖中病原体控制等更广泛的应用[113]。与在肠道中的作用类似，如芽孢杆菌这样的益生菌通过生物拮抗和环境操控来抑制有害细菌和真菌[114, 115]。主要机制包括竞争排除、产生抗菌物质（例如细菌素）和群体感应抑制[114-116]。此外，光合细菌和硝化细菌可以通过捕获氨氮和亚硝酸盐、分解有机物以及稳定藻类组成来提高水质，从而减少虾类疾病的发生[117-119]。生物絮体是由悬浮在水柱中的微生物（细菌、微藻、真菌和浮游动物）和其他有机颗粒组成的聚集物[120]。BFT是一种通过应用微生物生物技术来提高饲料效率和利用度的水产养殖系统[121]。在BFT中，微生物不仅通过氮控制来调节水质，为水产养殖物种提供营养来源的微生物蛋白，还在生物安全方面发挥重要作用，通过抑制病原微生物的生长[122]。与益生菌类似，BFT中的这些微生物通过竞争排除病原细菌来实现疾病控制。生物絮体可以产生破坏群体感应（QS）活性的细胞外化合物，从而降低细菌的毒性[123, 124]。研究还表明，生物絮体可以减少细菌密度和生物膜活性，并增强白虾对副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）感染的抵抗力[125, 126]。此外，BFT可以通过减少废水污染来保证水质清洁并增强生物安全性，同时降低引入和传播疾病和病原体的风险[127]。然而，BFT也有一些缺点，包括需要大量的能源用于曝气和搅拌，由于氧气消耗可能导致响应时间缩短，以及由于季节性光照变化而导致性能不稳定[121, 128]。这些问题，加上需要频繁维护，使得该系统的运营成本可能较高[74]。鱼类和双壳类动物因其高效的生理过滤能力而被用来直接减轻有害病原体的环境负荷[129, 130]。在虾类养殖中，引入滤食性鱼类（例如银 carp和鳙 carp）可以从源头有效抑制微生物爆发[131, 132]。通过消耗有机碎屑、剩余饲料和过量的浮游植物（如蓝藻），它们消除了异养病原体繁殖所需的营养基质[132, 133]。在循环水产养殖系统（RAS）中，在指定区域或封闭笼养中部署这些鱼类可以防止不同物种之间对饲料的竞争，同时利用它们的自然过滤能力净化循环水[134]。此外，研究表明，滤食性双壳类动物可以有效降低水柱中的弧菌和特定病毒的浓度[135]。这些生物通过物理隔离和消化失活的组合方式中断了虾之间的粪-口传播途径。在 Integrated Multi-Trophic Aquaculture (IMTA) 系统中，像扇贝这样的双壳类动物被战略性地布置在虾和鱼笼的下游进行有针对性的生物修复[136]。然而，这种生物控制的效力受到其过滤特性的限制，这意味着不同微生物类群的病原体去除效率会有显著差异[136]。
4.4 阻断病原体的传播

目前，关于通过阻断传播途径进行生物控制的研究报告在虾养殖领域相对有限。在我们之前的研究中，我们将特定鱼类引入虾养殖系统，以阻断WSSV的传播途径，建立了一个“虾-鱼共生”生物控制系统[38, 137]。这种方法利用鱼类的选择性捕食行为来识别和消耗患病及死亡的虾，避免健康虾的自相残杀。选定的鱼类作为“生物过滤器”，具有高度的选择性，优先摄食患病虾并通过消化作用中和病原体[56]。所选鱼类应满足以下标准：确保环境耐受性和生物安全性，使用无病原体的本地物种；捕食者大小与虾的发育阶段精确匹配，以实现有效清除；量化密度并建立预测模型，使捕食能力与虾的生物量相匹配[38]。这样，鱼类就中断了水平传播途径，特别是感染途径，防止小规模感染发展成灾难性爆发。这种方法还通过减少死亡虾产生的有害物质来提高池塘的整体生态稳定性[38]。目前，小型养殖户占水产养殖行业的80%以上，其中大多数仍然使用传统池塘[138, 139]。与其他生物控制方法相比，这种虾-鱼共生系统方便、有效且经济实惠。然而，这种生物控制策略的成功取决于养殖条件、病原体传播方式以及鱼类功能特性的匹配，以破坏通过捕食者-猎物动态进行的水平病毒传播。缺乏一个健全的实施方案可能会危及产量。到目前为止，“虾-鱼共生”生物控制系统尚未广泛应用于其他虾类疾病的控制中。在这里，我们尝试使用这种方法来控制虾类的细菌性疾病。



5 案例报告：通过“虾-鱼共生”生物控制系统控制虾白肌肉病（WMD）

为了证明虾-鱼共生生物控制系统对其他疾病的适用性，我们尝试使用它来控制凡纳梅虾（L. vannamei）的白肌肉病（WMD）。该案例的实验方法可以在支持信息中的“材料与方法”部分找到。


5.1 识别病原体

2023年，在中国广东湛江养殖的凡纳梅虾中爆发了白肌肉病（WMD），导致了60%的死亡率。WMD虾的临床症状表现为白色坏死肌肉（图3A-I–A-V），活动能力和摄食活力下降。进行了组织病理学检查，WMD虾的肌肉纤维显示出肌肉间的空腔、组织紊乱和坏死，以及血细胞浸润（图3A-VI），肠道则表现为上皮细胞脱落、微绒毛减少或消失（图3A-VII）。WMD虾的肝胰腺没有观察到病理变化（图3A-VIII）。WMD虾的肌肉被匀浆并离心以提取样本。提取物通过0.22微米的膜进行过滤。未过滤或过滤后的提取物被肌肉注射到健康虾体内。健康虾的肌肉也经过相同处理以获得对照提取物。所有注射未过滤提取物的虾在10小时后死亡，并表现出典型的WMD症状。而注射过滤提取物或健康虾肌肉提取物的虾没有死亡或典型症状（图3B）。此外，在HE染色肌肉切片中未观察到寄生虫（图S1A-I）。从WMD虾中分离出细菌，并通过16S rRNA测序进行了鉴定，包括V. harveyi、V. hepatarius、V. neocaledonicus、V. alginolyticus和V. sagamiensis（图3C,D, S1B,C）。只有V. harveyi从所有WMD虾中被分离出来，而其他细菌则仅从部分WMD虾样本中分离出来（表S1）。五种细菌通过肌肉注射被用来挑战虾。所有感染V. harveyi的虾在9小时后都出现了腹部肌肉坏死，并且100%死亡。V. harveyi始终从所有受影响的个体中重新分离出来。V. harveyi感染肌肉的组织病理学检查显示肌肉间的空腔、组织紊乱和坏死，以及血细胞浸润（图3G-II）。感染V. alginolyticus、V. sagamiensis、V. hepatarius和V. neocaledonicus的虾没有表现出典型的WMD临床症状（图S1D），死亡率分别为50%、40%、25%和20%（图3E,F）。这些结果证实了2023年中国广东湛江WMD的病原体是V. harveyi。图3 在图示查看器中打开
识别和表征导致WMD的弧菌。（A）健康个体（I–IV）和WMD受影响个体（V–VIII）的比较宏观形态和组织学。（I, V）外部外观。箭头指示肌肉坏死区域。条形：1厘米。II, VI：H&E染色的肌肉切片；肌原纤维坏死（a）和血细胞浸润（b）（直径：60微米）。III, VII：H&E染色的肠道切片；显示绒毛高度（VH）、刷状缘（BB）的侵蚀，星号（*）标记脱落的上皮细胞，以及肠道基底膜（IBM）（直径：60微米）。IV, VIII：H&E染色的肝胰腺切片（直径：100微米）。（B）根据大小推断的病原体类型。注射WMD虾未过滤提取物、0.22微米过滤WMD提取物以及未过滤与过滤健康虾提取物的虾的累积死亡率（对照1和对照2）。（C）细菌分离和纯化。从自然感染的虾中通过划线平板纯化后，在TCBS琼脂上分离出的优势菌株的典型菌落形态。（D）从患病个体中分离出的16S rRNA基因的系统发育分析（颜色突出显示），确认其属于弧菌属，以Listonella anguillarum菌株NCIMB作为外群。表S2列出了所用细菌菌株的16S rRNA基因序列的GenBank访问编号。（E）注射五种纯化分离的弧菌或PBS后的虾的累积死亡率曲线。（F）肌肉注射五种纯化细菌分离物或PBS（对照）后的虾的临床症状。箭头指示肌肉坏死区域。（G）注射PBS（I）或V. harveyi（II）后虾的组织病理学确认；肌原纤维坏死（a）和血细胞浸润（b）（直径：60微米）。




5.2 调查传播途径

为了研究V. harveyi的传播途径，我们通过喂食感染、浸染感染、直接接触和间接接触进行了实验（图4A）。在喂食挑战组中，虾在2天 dpi时开始表现出WMD的症状，7天 dpi时的累积死亡率为63.5%（图4B）。浸染感染组的累积死亡率为3.3%；对照组中没有任何死亡虾。在直接接触共栖情况下，虾在3天 dpi时开始显示出WMD的症状，7天 dpi时的累积死亡率为64.4%（图4B）。在感染期间，健康的共栖虾吃了患有WMD的虾，这表明发生了喂食感染。相比之下，间接接触共栖组的死亡率为1.7%（图4B）。浸染组和间接接触共栖组观察到的最低死亡率可能是由于通过浸染途径感染了V. harveyi。为了进一步确认V. harveyi的浸染途径，将虾暴露在含有V. harveyi的水中48小时，浓度分别为1 × 10^2、1 × 10^3、1 × 10^4、5 × 10^4和1 × 10^5 CFU/mL。相应的死亡率分别为0%、0%、0%、3%和19%（图4C）。当细菌浓度低于1 × 10^4 CFU/mL时，没有发生死亡。这些结果表明，喂食感染是WMD传播的主要途径。尽管V. harveyi可以通过浸染途径感染，但通过这种方式它的传染性较低。为了确定水中V. harveyi的主要来源，本研究调查了水中的细菌负载与虾死亡率之间的相关性。在整个感染试验过程中都测量了水中的V. harveyi水平（图4D）。有趣的是，在高死亡率组（喂食感染和直接接触）中观察到细菌负载显著增加，在4天 dpi时达到1.2 × 10^4 CFU/mL，在5天 dpi时达到1.5 × 10^4 CFU/mL；相比之下，低死亡率组（浸染感染和间接接触）的细菌负载始终保持在2 × 10^3 CFU/mL以下。这些结果表明，水中的V. harveyi浓度与虾的死亡率直接相关。为了进一步研究WMD感染虾释放V. harveyi的细节，量化了水中的V. harveyi水平。如图4E所示，在注射后50小时内，V. harveyi的水平较低（< 50 CFU/mL）；在此期间受感染的虾没有死亡。当受感染的虾死亡且虾尸体受损时，54小时时V. harveyi的浓度达到2.23 × 10^3 CFU/mL，在84小时时达到更高的水平1.87 × 10^4 CFU/mL。这些结果表明，将患病虾从养殖系统中移除对于控制细菌性疾病至关重要。

图4：打开图查看器 PowerPoint

**WMD传播途径和V. harveyi释放的研究。**(A) 不同传播途径的示意图。简而言之，健康虾通过喂食、与切碎的组织浸染（由穿孔隔板分隔）、直接共栖或间接共栖（由穿孔隔板分隔）接触到感染WMD的供体虾。(B) 不同传播途径的死亡率。(C) 通过浸染感染V. harveyi的虾的剂量依赖性死亡率。(D) (A)中传播实验期间水中的V. harveyi浓度。(E) 从含有活的受感染虾、未受损的死亡虾或人工受损的死亡虾的水池中测量水中的V. harveyi水平。含有健康虾的水池用作对照组。

5.3 生物控制计划
引入捕食者以切断传播途径是生物控制的重要方法。我们使用Clarias gariepinus作为捕食者来清除WMD患病和死亡的虾。通过肌肉注射感染V. harveyi的虾作为感染源。试验包括四个组，每组有三个重复池塘。每个池塘饲养700只健康虾。其中一个对照组C1的池塘引入了50只健康虾。另一个对照组C2的池塘引入了50只健康虾和一只C. gariepinus。一个感染组I的池塘引入了50只受感染的虾。一个生物控制组B的池塘引入了50只受感染的虾和一只C. gariepinus。在I组中，2天 dpi时首次观察到死亡虾，并被健康虾吃掉。12天 dpi时的存活率为23.35% ± 6.95%，患病虾显示出WMD的临床症状（图5A）。在B组中，存活率为76.3% ± 1.2%（图5A），整个试验期间没有观察到WMD的临床症状，也没有死亡虾。患病和死亡的虾被C. gariepinus吃掉。在C1组和C2组中，存活率分别为95.3% ± 0.3%和93.5% ± 1.1%（图5A）。没有发现带有临床症状的虾。我们使用qPCR在4天、8天和12天时量化了存活虾中的V. harveyi负载（图5B）。在C1组和C2组的虾中没有检测到V. harveyi。I组中虾的V. harveyi负载分别为2.07 × 10^4、3.96 × 10^3和2.27 × 10^3拷贝/克。B组中虾的V. harveyi负载在4天和8天时分别为1.33 × 10^3和1.61 × 10^3拷贝/克，并在12天时降至检测限以下。B组中虾的V. harveyi负载显著低于I组。这些结果表明，引入C. gariepinus有效地控制了WMD的爆发。

**使用Clarias gariepinus进行白肌病（WMD）的生物控制。**(A) 不同组在12天 dpi时的虾存活率。每个组包含三个饲养了700只健康虾的池塘：C1（对照组1）的每个池塘接受了50只健康虾；C2（对照组2）的每个池塘接受了50只健康虾加上一只Clarias gariepinus；I（感染）的每个池塘接受了50只受感染的虾；B（生物控制）的每个池塘接受了50只受感染的虾加上一只C. gariepinus。（***p < 0.001, **p < 0.01；ns，不显著。**(B) 不同组在4天、8天和12天时虾肌肉中的V. harveyi负载（***p < 0.001, **p < 0.01）。通过qPCR量化V. harveyi负载，并按组织重量（拷贝/克）进行归一化。检测限（LOD）为10^3拷贝/克。（C）生物控制原理的示意图。C. gariepinus作为捕食者，消耗了否则会被健康虾吃掉的患病虾，从而中断了WMD的传播途径。

6 结论
生物控制对于可持续发展至关重要，尤其是在面对抗生素抗性和化学试剂带来的重大挑战时。我们系统地在水产养殖中引入了生物控制的应用，特别是在虾养殖中。目前，虾养殖中的生物控制主要通过四种策略实施：(i) 使用Bdellovibrio或噬菌体直接杀死病原体；(ii) 使用益生菌抑制肠道病原体；(iii) 使用益生菌、生物絮状物或双壳类动物和鱼类减少环境中的病原体；(iv) 使用捕食性鱼类阻止病原体的传播。这些策略为虾病害的生物控制应用提供了指导。此外，“虾-鱼混养”生物控制系统利用捕食性鱼类控制WSSV，这种方法方便、有效且经济实惠；然而，其应用并不广泛。基于这种策略，我们成功设计了一个生物控制计划，并将其应用于控制由V. harveyi引起的WMD。这种生物控制策略显示出显著的发展潜力，可以应用于更广泛的疾病控制。

作者贡献
Xinyi He：撰写 - 原始草案、正式分析、调查。Jian He：撰写 - 原始草案、审阅和编辑。Minghong Liu：调查。Menghuang Xu：调查。Jianjun Jiang：调查。Minze Liao：调查。Chengcheng Wu：调查。Peiyun Han：调查。Long Zhang：软件。Shaoping Weng：监督。Zhixun Guo：监督。Jianguo He：撰写 - 审阅和编辑、撰写 - 原始草案、资源、监督、项目管理和资金获取。

**致谢**
本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFD2401202）和CARS-48专项基金的支持。

**利益冲突**
作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**
支持本研究发现的数据可在本文的支持信息中找到。