基于不确定性的模型驱动搜索方法在液相色谱法方法开发中的应用

《Journal of Chromatography A》：Uncertainty-driven Model-based Search Methods for Method Development in Liquid Chromatography

　　**莱昂·E·尼岑 | 迪尔德丽·卡布特 | 格特·德斯梅特**
布鲁塞尔自由大学，化学工程系，Pleinlaan 2，1050 布鲁塞尔，比利时

**摘要**
经验保留模型建立是一种经过验证的方法开发方法，它使用有限的初始“扫描”实验来构建分析物保留模型，并从预测的色谱响应函数（CRF）表面预测最佳实验条件。一旦初始模型建立完成，文献表明可以利用智能算法在寻找最佳分离条件的过程中进一步更新该表面。在这项研究中，使用122个随机混合样品在计算机模拟中比较了几种搜索策略。每种策略都在不同的峰检测能力水平下进行了评估。评估了三种主要策略：
(i) 经典的CRF驱动方法，即在具有最高估计CRF值的工作点进行新的搜索运行；
(ii) 一种新的全局不确定性驱动策略，旨在首先同时改进所有初始模型，然后再尝试最大化目标；
(iii) 第二种策略的针对每个分析物的变体。
研究发现，一旦峰检测受到阻碍（由于峰重叠），不确定性驱动策略的表现优于传统的CRF驱动搜索。例如，当需要分辨率为Rs=0.5才能正确识别和跟踪峰时，不确定性驱动搜索仅在第122个样品中有1个失败（0.8%），而CRF驱动搜索则有14%的失败率。当需要Rs=1.0时，最佳不确定性驱动方法的失败率上升到4%，而传统CRF驱动方法的失败率则高达42%，尽管保留时间参数的估计是使用与生成模拟色谱图中保留时间数据相同的模型进行的。总之，我们的结果显示，在当前设置下，不确定性驱动策略在确定所需分离效果方面比CRF驱动方法具有更高的准确性。这种改进的代价是分析总时间的增加，因为算法收集了更丰富的保留时间信息。

**引言**
尽管液相色谱（LC）能够实现卓越的分离能力，但优化LC方法仍然需要大量的人工时间和成本。每个新样品都需要确定合适的流动相和固定相条件组合，并且还需要调整多个其他实验参数，如柱子和粒子的尺寸、温度、流速、溶剂组成和注射体积[1],[2],[3],[4],[5],[6],[7],[8]。为了便于分析化学性质多样的化合物，实际上需要使用梯度洗脱，这进一步增加了方法优化的复杂性，引入了额外的因素。对于大多数典型的梯度程序，这包括决定使用的线性段数量以及每个段的持续时间和斜率。需要注意的是，实验参数的搜索本质上是主观的，因为它取决于用户在开发方法时定义的目标。在色谱学中，这个目标通常被称为色谱响应函数（CRF）。关于可以定义的许多不同CRF的概述可以在[9],[10],[11],[12]中找到。根据样品的复杂性，某些CRF可能比其他CRF更受欢迎，例如，在搜索仍在进行时，某些目标将导致更具有信息量的数据。例如，发现新化合物显然应该优先于仅仅提高所有化合物之间的平均分辨率。

**寻找最佳方法参数的方法**
可以考虑不同的策略。传统的优化方法严重依赖于分析师通过实验试错的经验。然而，这种方法极其耗时且成本高昂，尤其是在需要优化多个参数时（如多段或二维LC[13,14]）。为了克服这个问题，可以使用多种计算机辅助方法[10],[15],[16],[17],[18],[19],[20],[21],[22],[23]。无疑，最常采用的计算机辅助方法开发方法是由Lloyd Snyder提出的[15,24]。这种方法使用经验分析保留模型，即将化合物的保留时间与一个或多个实验参数（如流动相组成或温度[19],[25],[26],[27],[28],[29],[30],[31],[32]）相关联。该方法首先根据选定的实验设计进行一系列初始实验。之后，根据化合物的身份将可用的实验保留时间数据与之匹配。然后将数据拟合到上述分析保留模型中，或输入多项式拟合方案中，以便在不同实验条件下预测每个化合物的保留时间。大多数现有文献描述了流动相组成的影响建模，因为这个参数通常对化合物的保留时间影响最大，并且易于在广泛的组成范围内进行实验变化。通过引入额外的假设，预测的保留因子也可用于预测等速洗脱和梯度洗脱实验中的峰宽[7,8,33,34]。这些预测可以一起用来找到用户定义的目标下的最佳实验条件。商业软件包如DryLab、AutoChrom和Chromsword可用于简化这一过程[35],[36],[37],[38]。

**保留模型建立的局限性**
尽管保留模型建立可以表现得非常好，但它可能会因几个不同的原因而失败：
(i) 实验数据产生条件不良或约束不足的模型，其外推能力有限；
(ii) 测量的保留数据可能被错误地分配给每个化合物；
(iii) 真实的保留行为可能无法被任何常用的分析模型充分捕捉（例如线性-溶剂强度模型、Neue-Kuss模型或二次模型）。

**随机样品注入**
在这项工作中，我们假设每次试验都注入整个样品而不是单独注入化合物。在这种情况下，从实验中获得的有用信息量存在固有限制，因为很难在合适的流动相组成范围内洗脱每个化合物，从而建立一个良好的保留模型，同时确保化合物不会被掩盖。当色谱图无法反卷积时，这两个挑战会显著加剧。因此，对于某些混合物，可能不存在能够充分确定所有分析物保留模型的可行实验集。

**即使没有上述问题导致保留模型建立失败**，仍有可能现有的保留模型无法准确表示组分保留时间随梯度参数的变化情况。这并不令人意外，因为色谱保留是一个非常复杂的过程，除非采用特定策略来启用，否则不太可能被单一分析模型完全捕捉。一个例子是使用多层模型框架，其中包含用于正则化的群体级参数分布[39,40]。

**无模型搜索方法**
为了克服这个问题，提出了一系列无模型搜索方法，通过进行一系列连续实验来尝试充分近似真实的CRF（超）表面，最终达到CRF最大的条件。在这里，我们使用“无模型”一词来表示不使用预定义分析保留模型的方法，但可能依赖于完全从数据构建的统计模型。虽然这些策略可能更准确地说应该是“保留模型自由搜索”，但在这项工作中我们选择了前一种称呼。这类方法的第一个是Simplex方法，它在第一个计算机辅助建模方法提出时被引入[41,42]。近年来，机器学习技术如进化策略和遗传算法[17,18,43,44]、贝叶斯优化[16,22,23]或强化学习代理[20,21,45]在无模型搜索方法方面取得了重大进展。尽管这些新技术非常强大且很有前景，尤其是在高维搜索空间（如多段梯度或多维LC优化[10,16,18]）的背景下，它们通常仍然需要多次尝试才能找到最优解。这主要是因为色谱分离的CRF景观高度依赖于样品，并且通常非常不规则，实验条件的微小变化可能会导致局部CRF值的剧烈变化。这使得在学习（在强化学习的情况下）或重建真实CRF（超）表面变得非常具有挑战性。

**其他混合方法**
其他无模型或依赖模型的方法，如实验设计（DoE）[46],[47],[48]或预测性洗脱窗口移动和拉伸[49]，更具混合性质。然而，这些方法也面临着需要大量实验才能足够准确地重建真实CRF表面的问题。因此，仍然值得最大限度地利用分析保留时间模型的帮助。尽管它们在忠实表示给定化合物的保留时间特性方面存在局限性，但它们应该足够精确，以引导搜索过程朝着正确的方向发展，并帮助将CRF表面的重建更接近真实表面。为了实现这一目标，可以对上述“Snyder”方法[16,19,[24],[25],[26],[27],[28],[29],[30],[31]进行明显扩展，即在重新构建的CRF表面（有意义地）发生变化时进行额外的建模运行。最近在[16]中展示了这一概念的实用性。在该方法中，在重建的CRF表面最大值位置进行新的试验运行，以保持搜索在正确解附近。

**讨论**
可以认为，这种CRF驱动的搜索有可能遗漏描述真实CRF表面所需的关键保留信息，因此可能会提前收敛，特别是在初始数据有限的情况下。在这种情况下，首先专注于选择旨在消除保留时间和峰宽预测不确定性的试验运行似乎更有效和稳健，从而也消除了CRF表面的不确定性。总体而言，任务是通过依次选择实验来找到最佳且特定于样品的实验设计。对于个别或始终可检测的化合物，可以根据经典的I-、D-或G-最优性标准[48]进行选择。对于个别分析物的可检测性可能有限的混合物，选择下一个实验时必须考虑所有化合物保留时间预测的不确定性，因为这会影响在下一个提议的试验运行中检测到分析物的概率。此外，保留时间预测的不确定性可能与CRF表面的不确定性相关联，因此不要浪费实验来改进那些预计不会显著影响目标的化合物模型。Wiczling等人[50]之前也探讨了类似的方法，他们评估了涉及一个、两个和三个分析物的基于贝叶斯的序列程序。

**当前研究**
本研究在一个简化的环境中探索了这一概念的特性和潜在优势，即假设所有化合物的保留时间依赖性可以由已知的分析模型（本例中为Neue-Kuss模型）准确表示。因此，在搜索过程中唯一的未知数是模型参数的值。我们还假设峰跟踪能够完美工作。然而，我们考虑了不同的峰检测情况：一种是峰始终可见的情况（即假设完美的反卷积；在论文中称为Rs,det=0情况），以及另外两种与UV检测相关的情况，我们假设只有当峰与其邻居的分辨率大于Rs,det=0.5或Rs,det=1.0时才能观察到峰，这是为了避免使用任何特定的峰检测算法（这些算法通常依赖于可调参数）。选择这两种情况是因为它们通过（在某些情况下极大地）限制了可用数据，从而显著增加了找到最佳模型参数的难度。

**两种主要的不确定性驱动策略**
研究考虑了两种主要的不确定性驱动策略。第一种策略是通过选择总体预测不确定性最大的实验来最小化所有拟合分析物模型的参数不确定性，同时期望检测到尽可能多化合物的概率也最高。因此，这种方法被称为“全局不确定性（GU）驱动”方法。第二种方法，进一步称为“选择性化合物不确定性（SCU）驱动”的方法，首先识别出根据现有模型信息及其不确定性预测会导致预测CRF分数最大增长的那一种化合物。然后在搜索网格中，选择该化合物的建模不确定性和预期可检测性最大的点进行下一次试验运行。这两种策略都与纯粹基于CRF驱动的搜索方法进行了比较，后者仅根据当前的CRF估计来选择实验，因此优先考虑效率。研究的可变条件包括上述的可检测性程度、优化目标本身（要么仅关注分离效果，要么还要将总方法时间作为标准），以及采用的收敛标准的严格性。为了能够基于统计上相关的搜索结果数量得出结论，所有数据都是通过典型RPLC分离的数值模拟生成的。CRF驱动和不确定性驱动的策略也都设计得无需事先知道样品化合物的数量。

理论及采用的数值程序
所有数值计算（包括数据可视化）都是使用内部编写的Python代码在HP Z2 Tower G9工作站（Windows 11 Pro）上执行的，该工作站配备了Intel? Core? i9-14900-K处理器和128 GB的RAM。所有计算都是并行进行的。

搜索方法的定性描述与比较
图1比较了在搜索过程中，对于CRF2情况（分辨率和时间都很重要）的一个样品，其估计的CRF表面是如何变化的。为了简洁起见，仅展示了CRF驱动和SCU驱动的搜索方法，因为GU驱动算法的定性讨论与SCU驱动算法相同（更多全面的比较包括GU驱动搜索，请参见补充材料（SM）中的图S3）。请注意，虽然对于...

结论
获得的结果足以鼓励我们进一步研究目前提出的基于模型的、但由不确定性驱动的优化方法组合，而不是仅关注当前一代纯粹基于CRF驱动的模型搜索方法。尽管不确定性的使用通常与贝叶斯优化搜索相关联，但本研究表明不确定性也可以被纳入基于模型的搜索中，从而从两个领域中获益。

利益冲突声明
所有作者均声明没有利益冲突。

致谢
作者贡献声明
Leon E. Niezen：写作——审阅与编辑、撰写初稿、可视化、软件开发、调查、数据分析、概念化。
Deirdre Cabooter：写作——审阅与编辑、监督、资源提供。
Gert Desmet：写作——审阅与编辑、撰写初稿、监督、资源提供、项目管理、概念化。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文报道的工作。