纳米花状钴金属-有机框架作为类似氧化酶的纳米酶，1,2-二氨基苯作为催化底物，用于创新前列腺特异性抗原的信号“开-关”适配体传感技术

《RSC Advances》：Nanoflower-shaped cobalt-metal–organic framework as an oxidase-like nanozyme and 1,2-diaminobenzene as a catalytic substrate for the innovative signal “off-on” aptamer sensing of prostate-specific antigen

　　开发简单、灵敏且可靠的前列腺特异性抗原（PSA）检测方法对于前列腺癌的早期筛查和诊断具有重要意义。在本研究中，首次构建了一种新颖的“开-关”信号电化学适配体（Apt）传感平台，用于检测PSA，该平台利用合成的纳米花状三维钴金属-有机框架（Co-MOF）作为模拟氧化酶的纳米酶，并使用1,2-二氨基苯作为催化底物。在这种设计中，Co-MOF纳米酶可以直接催化1,2-二氨基苯的氧化生成电活性物质二氨基吩嗪（DAP），而无需H2O2。然而，当制备的Co-MOF纳米酶与PSA特异性适配体结合时，由于活性位点被适配体阻塞，其酶样活性受到抑制，导致对应于“关”状态的DAP电流消失。值得注意的是，在PSA存在的情况下，Co-MOF的催化活性得以恢复，因为Apt与PSA之间的特异性结合使Apt从Co-MOF表面脱落，从而恢复DAP电流，使信号切换到“开”状态。在优化了关键实验参数后，所提出的基于“开-关”纳米酶的电化学适配体传感器表现出优异的PSA检测性能。此外，该平台通过简单替换相应的适配体，可能为检测多种生物标志物提供一种新颖、简单且可靠的策略。

1. 引言

前列腺特异性抗原（PSA）是早期诊断和后续管理前列腺癌的关键生物标志物。其灵敏有效的测定对于早期临床筛查、疾病预防以及病理进展的监测至关重要。通常，健康人体内的PSA浓度低于4 ng mL?1。因此，已经开发了多种具有高选择性和灵敏度的分析技术，包括荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定、表面等离子体共振分析、荧光免疫测定和表面增强拉曼散射。然而，这些方法通常需要专业操作人员和昂贵的仪器，并且操作复杂且耗时。因此，以简单性、快速性和成本效益著称的电化学和比色方法受到越来越多的关注。事实上，最近设计了几种用于PSA检测的创新电化学传感平台，但这些平台涉及复杂的信号标记和抗体、DNA和适配体等识别元件的固定过程。近年来，纳米酶的出现为电化学传感开辟了动态研究前沿。与天然酶不同，人工纳米酶具有易于获得、稳定性强和成本低等优点，从而使基于纳米酶的电化学传感器在食品安全、环境监测和疾病诊断方面具有广阔的应用前景。最近，采用模拟过氧化物酶（POD）的纳米酶的适配体调控“开-关”传感策略引起了极大兴趣，因为它们消除了复杂的标记和受体固定步骤的需求。然而，这类类似POD的纳米酶系统在催化过程中仍然依赖于过氧化氢（H2O2）的存在，这引入了安全问题并限制了其实际应用。相比之下，模拟氧化酶（OXD）的纳米酶能够利用环境中的氧气而不是H2O2来催化底物氧化，为生物传感、抗炎和抗菌应用提供了更安全、更方便的替代方案。因此，基于类似OXD的纳米酶的“开-关”传感平台的进步对于设计创新传感器系统具有重要意义。在本研究中，首次通过简单的溶剂热方法合成了纳米花状三维钴金属-有机框架（Co-MOF）。表征结果表明，所得到的Co-MOF纳米酶表现出显著的类似氧化酶的催化活性，能够催化1,2-二氨基苯（OPD）的氧化生成二氨基吩嗪（DAP），而无需H2O2。将PSA特异性适配体固定在Co-MOF表面后，由于活性位点被阻塞，OXD样的活性被有效抑制，导致DAP氧化峰消失——对应于“关”状态。值得注意的是，在PSA存在的情况下，随着Apt与PSA之间的特异性结合，Apt从Co-MOF表面脱落，从而恢复DAP电流，使信号切换到“开”状态。利用这一机制，开发了一种基于这种纳米酶的新型“开-关”电化学适配体传感器，用于简单灵敏地检测PSA（图1）。

2. 实验部分

2.1 试剂和设备

PSA购自Sigma-Aldrich（中国），而牛血清白蛋白（BSA）、溶菌酶（Lys）、谷胱甘肽（GSH）和凝血酶（TB）来自Sangon Biotech Inc。Co(NO3)2·6H2O、2-甲基咪唑（2-MI）和OPD来自Sinopharm Chemical Reagent有限公司，甲醇（MeOH）由上海Macklin生化技术有限公司提供。PSA特异性适配体购自Sangon Biotech有限公司（上海，中国）。所有试剂均为分析级，按收到时状态使用。电化学测量是在CHI600F电化学工作站（中国）上进行的。

2.2 Co-MOF的合成

Co-MOF的合成按照先前报道的程序进行。简而言之，将1.5 mM Co(NO3)2·6H2O溶解在30 mL MeOH中，并进行5分钟磁力搅拌。随后，在连续磁力搅拌下逐滴加入含有3 mM 2-MI的10 mL MeOH溶液，再搅拌5分钟。将所得混合物转移到75 mL Teflon内衬高压釜中，在120 °C下加热12小时，然后自然冷却至室温。最后，将获得的Co-MOF依次用乙醇和去离子水洗涤，并在60 °C下过夜干燥。

2.3 适配体传感器的制备和PSA检测

首先用10 μL Co-MOF纳米酶悬浮液（0.5 mg mL?1）修饰抛光玻璃碳电极（GCE）。然后将所得到的Co-MOF/GCE浸入适配体溶液中，使适配体吸附在表面形成Apt/Co-MOF/GCE。随后，将Apt/Co-MOF/GCE与不同浓度的PSA溶液（50 μL）共同孵育，并在含有OPD的饱和氧醋酸缓冲液（0.1 M）中使用差分脉冲伏安法（DPV）测试最终电极。

3. 结果和讨论

3.1 Co-MOF的表征

Co-MOF纳米杂化物是通过含有2-MI和Co(NO3)2·6H2O的混合物进行水热处理合成的，如图S1所示。通过SEM和TEM（图1）表征了所得材料的形态和结构。SEM图像清晰显示，合成的Co-MOF具有由二维纳米片组装而成的三维纳米花状结构，平均直径约为3 μm，这与TEM观察结果一致。能量色散X射线光谱（EDS）元素映射进一步证实了Co、N、O和C在整个材料中的均匀分布（图S1）。通过粉末X射线衍射（PXRD）检查了Co-MOF的晶相，显示出约10.42°的特征峰（图S2），这与该材料的典型衍射模式相符。傅里叶变换红外（FTIR）光谱用于研究分子结构和化学组成。如图S3所示，2823和2926 cm?1处的峰对应于C–H伸缩振动，而3465 cm?1处的带与表面羟基（–OH）相关。此外，1350和1632 cm?1处的峰归因于Co–O键。这些发现与先前报道的数据一致，证实了Co-MOF的成功合成。此外，通过电子显微镜表征了制备的Co-MOF/GCE，图S4显示有大量的Co-MOF纳米杂化物分散在GCE表面，证实了纳米酶在GCE表面的成功固定。

3.2 检测原理和可行性

检测原理可总结如下：(a) Co-MOF纳米酶表现出显著的OXD型催化活性，能够氧化OPD生成DAP，从而产生可检测的电流信号。(b) 通过简单的吸附和静电相互作用将PSA相关的适配体固定在Co-MOF表面后，纳米酶活性被抑制，导致DAP峰消失（信号“关”）。(c) 基于PSA的引入，Apt/Co-MOF的催化活性得到恢复，DAP电流相应增加（信号“开”）。图2显示了在含有饱和氧的缓冲液中不同电极的DPV响应。在裸露的GCE上，在扫描电位范围内未观察到DAP氧化峰，表明GCE本身不催化OPD氧化生成DAP。相比之下，合成的Co-MOF在大约?0.41 V处显示出明显的还原峰，表明Co-MOF纳米酶具有显著的OXD样活性，可以在没有H2O2的情况下催化OPD氧化。当适配体吸附在Co-MOF表面形成Apt/Co-MOF/GCE时，催化活性被抑制，导致DAP电流丧失（信号“关”）。值得注意的是，在加入PSA后，这种活性得到恢复，还原峰重新出现。这种恢复归因于Apt与PSA之间的特异性结合，导致适配体从纳米酶表面脱落。通过电化学阻抗谱表征了传感原理。如图S5所示，电荷转移电阻（Rct）由Nyquist图中的半圆直径表示。将EIS数据拟合到等效电路后，发现Co-MOF/GCE的Rct值相对较小，而Apt/Co-MOF/GCE的Rct值显著增加。这种电阻的增加可归因于适配体的通常较低导电性。在PSA存在的情况下，Rct值降低，从而证实了Apt/Co-MOF传感器的成功构建。基于这种行为，使用Co-MOF作为类似OXD的纳米酶和OPD作为催化底物，开发了一种用于PSA的“开-关”电化学适配体传感器。

3.3 PSA检测

在定量检测PSA之前，优化了几项关键实验条件以提高检测灵敏度，包括Co-MOF的量、OPD的浓度以及Apt和PSA的孵育时间。PSA添加前后DAP电流（ΔI）的差异被视为分析信号。如图3所示，最佳参数确定为：Co-MOF的量为10 μL；OPD浓度为1.5 mM；Apt孵育时间为16分钟；PSA孵育时间为20分钟。随后使用这种控制的“Apt-开-关”传感器检测不同浓度的PSA。如图4a所示，DAP电流随着PSA水平的增加而逐渐增加，表明PSA可以恢复Co-MOF纳米酶的OXD样催化活性。在80至10,000 pg mL?1的范围内，ΔI值与PSA浓度的对数之间存在线性关系。相应的回归方程为y = ?0.5645 ? 0.0012x（R2 = 0.9963）（图4b），计算出的检测限（LOD）为20 pg mL?1（S/N = 3）。与之前报道的电化学PSA传感器（表1）相比，本研究开发的平台具有可比或更低的LOD以及更宽的线性范围。这种优异的检测性能可归因于Co-MOF纳米酶的卓越OXD样活性。值得注意的是，“开-关”传感设计消除了复杂标记和受体固定步骤的需要，从而简化了整体检测过程并提高了操作便捷性。

3.4 实验条件的优化：对于PSA检测的影响包括(a) Co-MOF纳米酶的量、(b) OPD浓度和(c) Apt以及(d) PSA的孵育时间。图4

(a) 基于Apt/Co-MOF/GCE对不同浓度PSA的DAP电流的DPV响应(b) 以及相应的PSA检测线性关系。表1

比较了所开发的Apt/Co-MOF传感器与之前报道的电化学PSA传感器的性能。Ab/HO-BN/COOH-CDs@AuNPs
DPV
1–3.5 × 10^4
0.136
26



Apt/GA/AuNPs/Nafion
DPV
50–5 × 10^4
30.6
27



Ab/AuNPs/rGO
安培法
0.1–1 × 10^7
30
28



Ab/AuNRs/rGO
DPV
100–1.5 × 10^4
16
29



Ab/Cys-AuNP
DPV
5 × 10^3–2.5 × 10^5
470
30



Ab/APBA/6-PICA
SWV
500–1 × 10^5
110
31



在退火金岛上的AuNPs
DPV
50–3 × 10^4
5.7
28



Apt/Co-MOF
DPV
80–10^4
20



本研究



为了评估所开发的“开-关”传感平台的选择性和特异性，其响应被测量了针对PSA以及潜在的干扰物质，包括Lys、TB、BSA、GSH和AA（图5a）。结果表明，只有PSA（0.4 ng/mL）引起了电流信号的显著下降，而其他物质即使在PSA浓度的六倍时，ΔI的变化也微不足道。此外，在PSA与这些干扰物混合存在的情况下也进行了电化学响应测试，未观察到DAP信号的显著变化。这些发现证实了“开-关”传感器的高选择性和特异性。为了评估重复性，使用了九个独立制备的Apt/Co-MOF/GCE传感器来测量与0.4 ng/mL PSA孵育后的DAP电流响应。如图5b所示，ΔI值的相对标准偏差（RSD）仅为4.37%，表明了出色的重复性。传感器的稳定性也得到了研究。储存35天后，传感器仍保留了初始电流响应的90.2%（图5c），显示出令人满意的长期稳定性。图5



（a）设计的Apt/Co-MOF传感器的特异性，（b）重复性和（c）稳定性。“开-关”传感器的实际应用性是通过使用南京医科大学第一附属医院提供的人类血清来验证的，结果发现无法检测到初始浓度的PSA。因此，引入了标准添加方法来确认其实际应用性。具体来说，将不同浓度的PSA加入血清样本中，并记录相应的电化学响应以确定PSA水平。同时，通过将提出的方法的结果与ELISA技术的结果进行比较来验证其准确性。如表S1所示，回收率范围为92.7–96.5%，RSD值在2.64%到3.24%之间，这两种方法得到的结果是一致的。这些发现表明，所开发的“开-关”传感器适合用于检测实际生物样本中的PSA。最后，为了研究传感平台的通用性，通过改变相应的Apt，使用所设计的“开-关”传感器来检测癌胚抗原（CEA）。如图S6所示，使用Apt/Co-MOF/GCE得到的DAP电流下降幅度小于使用Co-MOF/GCE的情况。加入CEA目标后，响应增加。这些发现表明，这种传感策略适合使用不同的Apt来检测其他生物标志物。



4. 结论



在这项工作中，开发了一种基于Co-MOF纳米杂化的OXD类纳米酶活性的创新“开-关”传感策略，用于检测PSA。制备的Co-MOF纳米酶能够直接催化OPD的氧化生成DAP，从而消除了POD类纳米酶系统中通常需要的H2O2。当Apt固定在Co-MOF表面形成Apt/Co-MOF传感界面时，OXD类活性被显著抑制，导致DAP峰值电流下降（信号“关”状态）。引入PSA后，催化活性恢复，产生的DAP信号随PSA浓度线性增加，对应于信号“开”状态。在优化关键实验条件后，所提出的“开-关”传感器表现出优异的PSA检测性能，最低检测浓度（LOD）为20 pg/mL，线性范围为80–10000 pg/mL。这种简单的、模仿OXD的纳米酶基“开-关”传感平台为PSA和其他生物标志物的电化学检测提供了一种有前景的新方法，显示出在实际应用中的巨大潜力。利益冲突



没有需要声明的利益冲突。数据可用性



数据将根据请求提供。补充信息（SI）可供查阅。见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra01552b。致谢



本研究得到了福建省科技创新联合基金（授权号：2025Y9566）的财政支持。参考文献
脚注



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这些作者是共同第一作者。