基于精油的纳米乳液微粒：用于储存式害虫控制的绿色创新技术，有效防治赤拟谷盗（Tribolium castaneum）

《RSC Advances》：Encapsulated essential oil-based nanoemulsion beads: a green innovation for storage pest control against Tribolium castaneum

　　精油纳米乳液配方为综合害虫管理提供了环保、更安全的替代品，可以替代合成杀虫剂，从而减少由像Tribolium castaneum这样的害虫侵扰造成的食物损失和经济损失。为了控制Tribolium castaneum的侵扰，我们制备了含有肉桂油、丁香油和纯化丁香酚的纳米乳液颗粒。最初，我们使用海藻酸钠制备了这些纳米乳液颗粒，并对其特性进行了表征，测试了它们对T. castaneum的驱虫、杀卵、熏蒸和杀幼虫效果，以分析精油的有效性。表征分析显示，制备的纳米乳液颗粒的粒径为1.34毫米，表面分析显示了吸附-解吸等温线，揭示了其多孔结构。此外，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）和气相色谱-质谱（GC-MS）分析证实了纳米乳液颗粒中确实含有精油。进一步的体外分析表明，这种纳米乳液在熏蒸活性方面表现出色，在36小时的暴露时间点上死亡率高达约8%。同时，它在杀卵和杀幼虫方面的效果也很显著。肉桂纳米乳液颗粒在98小时和30小时时间点的死亡率最高，其次是EGN和CLN颗粒。而在所有体外评估中，对照组的海藻酸钠颗粒没有显示出任何效果，表明其存在不会对Tribolium castaneum产生影响。基于这些体外评估结果，显然肉桂纳米乳液颗粒对Tribolium castaneum有显著效果，同时也证明了含有海藻酸钠的纳米乳液颗粒不会对昆虫产生任何毒性作用。总之，这项研究表明，精油纳米乳液的发展提高了其稳定性，并增强了颗粒的效果，为减少对储存谷物害虫的有害合成杀虫剂和农药的使用开辟了道路。

1. 引言

全球人口增长率约为1.5%，这对粮食供应构成了重大挑战，因为粮食供应占人类饮食的67-80%，而害虫则对储存的粮食造成了严重破坏。例如红粉甲虫等害虫的侵扰在储存期间导致大量的粮食损失，给发达国家和发展中国家带来经济损失。主要由于Tribolium castaneum（通常称为红粉甲虫）的存在，造成了严重的经济损失和品质下降，因此控制这种害虫在储存的谷物（如小麦粉）中是非常必要的。每年约有10-15%的小麦这种主要谷物因储存谷物害虫（主要是Tribolium castaneum）而损失，这是一个严重且普遍存在的问题。如今，精油由于其有效性、环保性和对可持续害虫管理的贡献，为控制Tribolium castaneum提供了强有力的、自然的解决方案。在高杀虫活性的情况下，像肉桂油和丁香油这样的精油已被证明对Tribolium castaneum的成虫和幼虫阶段都表现出很高的活性。许多精油还显示出显著的驱虫特性，通过防止害虫定殖和进食来减少甲虫的侵扰。薄荷油、薰衣草油、玫瑰油和茉莉油的精油在直接接触和熏蒸试验中都显示出了对红粉甲虫的毒性和驱虫效果。此外，精油还影响Tribolium castaneum的繁殖周期和发育，减少其蛹的形成和成虫的出现，有助于打破害虫的生命周期并长期降低种群数量。传统上，储存产品中的害虫主要通过化学熏蒸剂（主要是磷化氢和溴甲烷）进行控制，应用于大规模粮食、仓库和商品储存中。此外，还使用有机磷和合成拟除虫菊酯类杀虫剂作为粮食保护剂和结构喷雾来管理剩余的害虫侵扰。由于抗性的产生，频繁使用磷化氢导致了主要储存产品害虫的广泛抗性，导致多个地区的控制失败。接触性杀虫剂（有机磷和拟除虫菊酯）的抗性也被广泛记录下来，降低了传统控制方法的可靠性。使用杀虫剂的一些关键负面影响包括对人类健康的重大风险，因为像磷化氢和溴甲烷这样的有毒气体对工人和附近的人体构成急性及慢性风险。更广泛的杀虫剂使用与暴露人群中癌症风险和其他健康问题的增加有关。从环境角度来看，溴甲烷会破坏臭氧层，并在全球范围内受到限制，而其他杀虫剂则导致生物多样性的丧失。此外，熏蒸剂中的化学残留物引发食品安全问题，影响贸易和消费者接受度，尤其是在有严格最大残留限量的情况下。监管压力的增加导致了更严格的法规以及收获后系统中传统杀虫剂使用的减少。为了克服这些问题，我们开发了一种使用精油来控制储存谷物害虫的绿色方法。主要挑战包括挥发性、稳定性和可控释放。为了克服这些问题，在精油纳米系统的配方中使用了先进技术，以提高其在各种应用中的生物活性和功能性。纳米乳液能够有效地通过半透膜传输活性物质，由于其较大的表面积和小球状体积，提高了渗透性并防止了液滴聚集。通过调整配方或使用不同的精油，纳米乳液可以针对甲虫的特定生命阶段（如幼虫或成虫）进行设计。与传统杀虫剂相比，纳米乳液在控制害虫种群方面可能更有效，为综合害虫管理策略提供了有前景的替代方案。精油纳米乳液已被研究为一种新型的、生物合理的、有效的控制红粉甲虫（尤其是储存谷物产品的主要害虫Tribolium castaneum）的方法。几种精油，如洋甘菊油、孜然油、薄荷油、茴香油和丁香油已被制成纳米乳液，增强了杀虫效果、稳定性和油的输送能力。这些纳米乳液对红粉甲虫表现出致命和亚致死的毒性，损害了它们的进食、繁殖和生存能力，从而保护储存的粮食免受损害。丁香油纳米乳液对甲虫和幼虫具有高毒性，计算出的LC50值表明在低浓度下就具有很强的效果。通常在纳米范围内的液滴大小（约200-400纳米）提高了溶解度、扩散性和杀虫剂的输送能力。纳米乳液配方提供了环保、更安全的合成杀虫剂替代品，适用于针对储存产品害虫（如红粉甲虫）的综合害虫管理计划。封装技术，如微囊化和纳米囊化，解决了粮食储存、昆虫侵扰和营养损失的问题。它们延长了杀虫剂和农药的作用时间，提高了粮食的安全性，并促进了可持续的农业实践，确保了粮食的高质量标准。纳米乳液颗粒或配方由于其延长的生物活性和增强的效果，能够有效控制储存谷物中的害虫，如红粉甲虫和米象。这些纳米乳液需要较低的活性成分浓度，并且具有较低的环境毒性。然而，大规模商业应用和长期环境影响评估仍在进行中，需要进一步的研究和监管评估。根据文献综述，目前还没有针对特定害虫侵扰的纳米乳液颗粒的专门配方研究，但这些配方通常涉及使用表面活性剂（例如Tween 80）通过超声乳化等方法制备的水包油纳米乳液。这些配方可以调整成颗粒或颗粒状以便实际使用。文献表明，含有水包油纳米乳液的纳米乳液颗粒产品可以通过提高效果、减少剂量和保持粮食质量来有效控制储存产品中的红粉甲虫，具有作为生物杀虫剂的潜力。为了解决这一研究空白，我们制备了含有肉桂油、丁香油和纯化丁香酚的纳米乳液颗粒来治疗Tribolium castaneum。最初，我们使用海藻酸钠制备了这些纳米乳液颗粒，并使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和气相色谱-质谱（GC-MS）对其进行了表征分析。然后，测试了这些含有海藻酸钠的纳米乳液颗粒对T. castaneum的驱虫、杀卵、熏蒸和杀幼虫效果，以分析精油的有效性。

2. 材料与方法

2.1 研究地点

本研究于2024至2025年在Vellore理工学院Vellore分校的生物科学与技术学院进行，位于纳米技术研究中心实验室。

2.2 害虫饲养

Tribolium castaneum成虫从Thanjavur的印度食品加工技术研究所（IIFPT）购买。我们遵循了Sokoloff（1972年）和Goodman等人（2012年）描述的标准饲养程序。害虫在受控的实验室条件下（最佳温度范围为25-30°C，相对湿度约为70%）在无菌小麦粉中饲养。根据文献（Mamata和Kumar（2021年）的描述，区分了害虫的各个阶段。共鉴定出七个幼虫龄期，其特征为Campodeiform和slender型，背部有细小的刚毛。每个龄期的颜色和特征各不相同：第一龄期很小，呈象牙白色；第二龄期活动性强，呈亚麻白色；第三龄期丝状，略带黄色；第四龄期呈浅棕色；第五龄期未成熟，呈 tortilla色；第六龄期较大且凸起，呈浅棕色；第七龄期活动性强，呈黄褐色。蛹期包括三个阶段：前蛹期（浅黄色，较小，有细小刚毛并蜕皮）；蛹期（颜色更深，较短，有后肢和小眼点）；后蛹期（眼睛和后肢完全发育，呈深棕色）。蛹存在性别二态性，雌性的生殖乳头分叉较长，而雄性的较短。成虫呈深棕色，具有性别二态性，雄性的前腿上有刚毛斑块，而雌性则没有。在这项研究中，我们购买了成虫并将它们放入无菌小麦粉中，让它们产卵一天以获得同步的发育阶段。之后小心地用筛子移除成虫，以防止进一步产卵。使用相同的环境条件孵化获得的卵。根据Mamata和Kumar（2021年）的研究，从孵化当天开始测量幼虫的年龄，并在此阶段进行实验。本研究主要关注卵和幼虫阶段，同时在无菌条件下监测和处理个体以减少环境变化。本研究考虑了新孵化的雌雄个体。

2.3 化学化合物

丁香酚（纯度99%）和锡兰产的肉桂叶油（纯度99%）从Sigma-Aldrich（美国）购买，分析级甲醇（纯度99.8%）从S D Fine-Chem Limited（SDFCL）（古吉拉特）购买。丁香油（纯度99%）也从SDFCL（古吉拉特）购买。我们还从Sigma-Aldrich（美国）购买了Tween 20（聚乙二醇失水山梨醇单油酸酯）。

2.4 纳米乳液的制备与表征

三种精油（肉桂油、丁香油和丁香酚）的纳米乳液（NEs）使用高能技术制备，即超声乳化（150瓦，分别乳化5分钟、10分钟和15分钟）和均质化（四种不同的均质化压力，分别为5000、10000、15000和20000 psi，分别进行1次、2次和3次处理）。然后，将它们保存在不透明的瓶中并在室温下储存；为了检查NEs的长期储存稳定性，样品在4°C和25°C下保存了30天。为了制备NE颗粒，首先将精油纳米乳液缓慢加入海藻酸钠溶液中。然后，将此混合物倒入氯化钙溶液中，形成凝胶颗粒。这些凝胶颗粒静置20-30分钟使其硬化，然后用蒸馏水冲洗并在受控条件下干燥。对于大规模生产NE颗粒，我们使用了新型的颗粒封装器，并在60°C的热空气中干燥颗粒。使用螺旋笼测量了颗粒的大小，本研究考虑了平均直径为100颗颗粒。关于油纳米乳液的表征，进行了场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析、气相色谱-质谱（GC-MS）分析、傅里叶变换红外（FTIR）光谱（JASCO）和气相色谱分析。

2.4.1 纳米乳液颗粒的形态分析

通过结合形态成像和元素组成分析，使用FESEM和EDX分析了纳米乳液颗粒的全面特性。该分析在泰米尔纳德邦Coimbatore的Avinashilingam家政与高等教育学院的CNR Rao研究中心进行。纳米乳液珠的表面表征

使用了Brunauer–Emmett–Teller（BET）分析方法来确定纳米乳液珠的表面积，该方法通过在受控条件下测量吸附在表面上的气体量来进行测量。BET分析是在班加罗尔的材料分析与研究中心（MARC材料专家）进行的。

2.4.3. 三种必需精油的化学成分分析

为了分析纳米乳液珠中的化学成分，将珠子溶解在1毫升甲醇中并孵育1小时。随后以7000转/分钟的速度离心5分钟，取上清液用于GC-MS分析。使用HP Agilent 6890 plus气相色谱仪（GC）和HP-5MS色谱柱（长度：30米，内径：0.25毫米，膜厚：0.25毫米）对纳米乳液进行了分析。在60°C下孵育8分钟后，色谱柱温度以每分钟2°C的速度升高到250°C。进样器和检测器的温度分别保持在250°C和270°C。氦气作为载气，色谱柱的流速为0.5毫升/分钟，注射0.2微升的油样以设置分流比为5:1。我们使用运行在70 eV的四极质谱仪进行了GC/MS研究。色谱峰的面积用于计算纳米乳液化合物的含量。

2.4.4. 傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析

为了识别用于制备纳米乳液珠的每种材料中的官能团，将珠子溶解在1毫升甲醇中，孵育1小时，然后以7000转/分钟的速度离心5分钟，取上清液用于FT-IR分析。为了研究它们之间的相互作用，进行了傅里叶变换红外（FT-IR）光谱分析。样品在4000–500厘米^-1的扫描范围内使用FTIR光谱仪进行了扫描。

2.5 使用纳米乳液对Tribolium castaneum的体外研究

2.5.1. 驱虫活性的评估

在这项实验中，将纳米乳液珠置于培养皿的中心。使用如图2所示的50 × 12毫米的小培养皿和90 × 15毫米的大培养皿来检测驱虫活性。在培养皿周围放置大约20只幼虫。然后封闭整个培养皿，重复实验三次，并观察昆虫最多24小时。记录处理区和未处理区中的幼虫数量。根据处理区中幼虫的数量绘制成图表，以表示测试溶液的驱虫活性百分比。

2.5.2. 熏蒸活性的评估

使用以下方法评估T. castaneum的熏蒸活性。简而言之，将纳米乳液珠（肉桂油纳米乳液：CNN，丁香油纳米乳液：CLN，丁香酚纳米乳液：EGN）加入存储害虫控制装置中，如图1所示。然后用盖子紧紧拧紧每个含有大约20只T. castaneum幼虫的小瓶。观察昆虫最多36小时。颜色发生变化且停止移动的幼虫被视为死亡。对照组在相同条件下饲养，但不使用纳米乳液珠。实验重复三次。初始暴露后每12小时计算每个小瓶中的活虫和死虫数量，直至36小时。为了评估死亡率，每小时直接观察昆虫。

图1

存储害虫控制装置。(1) 样品盒：样品盒内含有生物杀虫剂，有助于生物杀虫剂的有效释放。样品盒的容量为2毫升，可以存储2毫升的液体体积和2克的生物杀虫剂固体体积。样品盒带有一个释放出口，用于释放生物杀虫剂。存储害虫控制装置的设计采用塑料制成。未来可以用不锈钢替换样品盒，并且样品盒的构造设计为不与存储箱内的产品接触。样品盒的上部设计成可开合的门式结构，以便装载生物杀虫剂。(2) 样品盒支架：该部件用于支撑装有生物杀虫剂的样品盒。样品盒支架的直径为10毫米。样品盒支架是防空气的，确保生物杀虫剂中的挥发性物质不会泄漏。(3) 样品盒释放出口：释放出口（孔洞）位于样品盒的侧面，以确保生物杀虫剂的有效释放。样品盒的四侧各设有大约20个释放出口，每个出口的直径为0.5毫米。(4) 存储箱：存储箱用于存放食品及其害虫。存储箱的体积为10毫升。

2.5.3. 杀卵活性的确定

使用具有高杀卵活性的纳米乳液珠（肉桂油纳米乳液：CNN，丁香油纳米乳液：CLN，丁香酚纳米乳液：EGN）可以有效地抑制成虫产卵。实验中，将大约24小时大的T. castaneum卵放入存储害虫控制装置的管子中（图1）。将纳米乳液珠单独放入多孔管中，这些管子位于大管内。取三种纳米乳液并按测试剂量施用于多孔管中。昆虫因此暴露在不同时间段的测试溶液中（26、50、74和98小时）。处理后，计数并记录死亡和活昆虫的数量。根据死亡昆虫的数量在图表中绘制死亡率百分比。

2.5.4. 幼虫杀活性的评估

使用T. castaneum的幼虫（16天大）在有无小麦粉作为培养基的情况下评估幼虫杀活性。将纳米乳液珠（肉桂油纳米乳液：CNN，丁香油纳米乳液：CLN，丁香酚纳米乳液：EGN）放入存储害虫控制装置的多孔管中（图1），并部分关闭管子以检查活性。昆虫幼虫暴露在不同的时间段（24、48、72和96小时）。每个暴露期后，取出管子并观察昆虫幼虫的死亡情况。死亡数据经过probit分析。

2.6 统计分析

使用双因素方差分析（two-way ANOVA）对肉桂油纳米乳液（CNN）、丁香油纳米乳液（CLN）和丁香酚纳米乳液（EGN）的活性进行了统计分析，显著性水平p ≤ 0.05，LD50浓度为0.5克。为了排除不准确性的可能性，每个结果进行了三次测量。使用GraphPad Prism 10软件进行计算和图表制作。

3. 结果与讨论

由于固有的局限性，必需精油纳米乳液对于处理小麦粉中的红粉甲虫（特别是Tribolium castaneum）非常重要。这些乳液提高了其效力和稳定性，防止了污染、经济损失、质量下降、霉菌生长和贸易问题。活甲虫的存在可能导致谷物被拒绝和饲料消耗减少。为了应对这些问题，研究人员探索了植物油作为纳米乳液的活性，使用肉桂、丁香和丁香酚精油作为天然替代品。在这方面，将纳米乳液封装在珠子内（例如，海藻酸钠珠子）可以实现活性化合物的缓慢和持续释放，从而通过控制释放提高其效果。与直接纳米乳液的快速蒸发或降解相比，这显著延长了杀虫或驱虫作用。控制释放降低了对非目标生物和环境的全天需求剂量。此外，纳米乳液珠提供了增强的杀虫性能、改进的稳定性和安全性，使其适用于长期害虫管理，例如处理谷物中的红粉甲虫。基于文献回顾，我们使用海藻酸钠和氯化钙将三种必需精油（肉桂油、丁香油和丁香酚油）制成纳米乳液珠。为了研究它们对红粉甲虫（特别是Tribolium castaneum）的活性，我们首先使用封装技术制备了海藻酸钠纳米乳液珠，并使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析、FT-IR光谱和GC-MS分析对其进行了表征。

3.1 必需精油珠的纳米乳液表征

3.1.1 场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析

进行了场发射扫描电子显微镜（FESEM）分析，以检查封装肉桂油纳米乳液、丁香油纳米乳液和丁香酚纳米乳液的海藻酸钠珠的表面形态和结构特征。FESEM还通过提供高分辨率的图像来表征海藻酸钠珠的表面形态、大小和结构。这些结果揭示了珠子的质地、大小和形状分布以及它们的结构完整性。FESEM在低电压下提供超高分辨率，最小化了对珠子的损伤或充电效应。它还产生类似3D的图像，允许详细可视化珠子的拓扑结构。对所有三种类型的纳米乳液载荷的海藻酸钠珠的FESEM分析显示，它们通常具有球形和多孔的表面结构，这是通过离子凝胶化方法制备的海藻酸盐基水凝胶珠的典型特征。孔隙率受到珠子形成过程中使用的海藻酸盐和氯化钙浓度的影响，较高浓度导致珠子更密集且孔径更小。这种多孔形态有助于必需油的封装和控制释放。使用螺旋测微计测量珠子的大小，平均珠子大小为1.34毫米（图3）。

图3

海藻酸钠珠的FESEM图像：(a–c) 作为对照的海藻酸钠珠，(d–f) 肉桂油纳米乳液珠，(g–i) 丁香油纳米乳液珠，以及(j–l) 丁香酚纳米乳液珠。所有样品都显示出一般呈球形至椭圆形的珠子，表面具有多孔或粗糙的特征，这是海藻酸盐基封装的典型特征。表面特征和孔隙率反映了配方参数和封装油的影响，支持有效的封装和潜在的控制释放。使用EDX（能量色散X射线）分析研究了纳米乳液珠的元素组成，以识别和量化元素组成。图4(a–i)显示了在不同能量水平（0.000 keV至9.00 keV）检测到的X射线强度。谱中的每个峰对应样本中存在的特定元素。峰的高度和面积与该元素的浓度成正比。显著的峰显示了碳（C）、钠（Na）、钙（Ca）和氯（Cl）的独特峰。标签“C”、“Na”、“Ca”和“Cl”分别与它们在样本中的存在相对应。这些峰在每个元素的特征能量水平处观察到，有助于识别它们。表1 represent 了谱中识别出的元素的定量分析及其浓度。识别出的元素包括CK（碳K-alpha）、OK（氧K-alpha）、NoK（氮K-alpha，尽管峰在图中没有明确标注，但已进行量化）、ClK（氯K-alpha）和CaK（钙K-alpha）。

3.1.2 纳米乳液珠的表面表征

基于吸附-解吸等温线进行了纳米乳液珠（肉桂油纳米乳液：CNN，丁香油纳米乳液：CLN，丁香酚纳米乳液：EGN）的表面表征，这些等温线用于表征材料的多孔结构。x轴表示在给定温度下吸附物的平衡压力（P）与饱和蒸气压（P0）的比率。这表示了孔隙的填充程度。y轴表示每单位质量吸附材料吸附的气体体积。这与材料吸附气体的能力有关。吸附曲线表示随着相对压力的增加而吸附的气体量，而解吸曲线则表示随着相对压力的降低而解吸的气体量。就滞后环而言，吸附曲线和解吸曲线之间的分离，在图5b–d中的图表中尤为明显，表明存在中孔（直径在2到50纳米之间的孔隙）。滞后环的形状指示了孔隙的几何结构。在某些平台区域的等温线（如图5a和可能的图5d）中，较高相对压力下的平台表明孔隙被完全填充或发生了多层吸附。NE珠子的解吸分析显示在表2中。表面积（m2/g）表示每克材料可用的总表面积。CNN珠子显示出最高的表面积（3.991 m2/g），表明与对照组（2.947 m2/g）和其他珠子相比，它的孔隙更多或结构更复杂。EGN珠子的表面积最低（1.124 m2/g），表明其结构较为不孔。就孔隙体积（cm3/g）而言，计算了每克材料内的总孔隙体积。对照样品具有最高的孔隙体积（0.026 cm3/g），而CLN和EGN珠子的孔隙体积显著较低（分别为0.002 cm3/g和0.001 cm3/g）。这表明尽管CNN珠子的表面积较高，但其整体孔隙体积低于对照组，表明尽管表面积增加，但孔隙较小或数量较少。孔径DV（d）（纳米）表示孔隙的平均直径。所有样品的孔径相对相似，从对照组的2.030纳米到CNN珠子的2.490纳米不等，这表明虽然孔隙的数量和表面积有所不同，但这些纳米乳液的孔隙平均大小仍然相似。图5

NE珠子的吸附-解吸特性。表2

纳米乳液珠子的解吸分析

珠子
表面积（m2/g）
孔隙体积（cm3/g）
孔径DV（d）（纳米）

对照
2.947
0.026
2.030

CNN珠子
3.991
0.006
2.490

CLN珠子
2.581
0.002
2.281

EGN珠子
1.124
0.001
2.246

FESEM提供了高分辨率的表面形貌图像，揭示了珠子的形状、大小、纹理和结构特征。EDX分析证实了元素组成，识别并量化了元素，并检测了污染。这种结合有助于将表面形貌与元素分布相关联，这对于理解包封效率、稳定性和释放特性至关重要。这对于优化药品、化妆品或食品应用中的配方和功能非常重要。NE珠子的元素组成通过EDX（能量色散X射线）分析进行了分析。不同能量水平下检测到的X射线对应于特定元素，其中碳、钠、钙和氯的峰特别明显。定量分析确定了如碳K-阿尔法、氧K-阿尔法、氮K-阿尔法和钙K-阿尔法等元素，并在表1中量化了它们的浓度。NE珠子的表面特性通过吸附-解吸等温线进行分析，以表征其多孔结构。吸附曲线和解吸曲线分别表示吸附和解吸的气体量。滞后环通过两者之间的分离来表征，特别是在图5b–d中尤为明显，表明存在中孔（直径在2到50纳米之间），这证实了NE珠子的特性。NE珠子的解吸分析显示在表2中。表面特性分析揭示了纳米乳液珠子的物理特性差异，CNN珠子表现出最大的表面积和孔径，而EGN珠子的表面积和孔隙体积最小。尽管对照样本的表面积低于CNN珠子，但它具有最高的孔隙体积（表2）。

3.1.3 傅里叶变换红外（FTIR）分析

肉桂油和丁香油都是丁香酚的丰富来源，它们的FTIR光谱与纯丁香酚非常相似，因为这种化合物在它们的化学成分中占主导地位。如图6所示，肉桂油纳米乳液珠子、丁香油纳米乳液珠子和丁香酚纳米乳液珠子的FTIR光谱都展示了归因于丁香酚的特征吸收带。这些基于精油的纳米乳液以及封装在海藻酸盐珠子中的丁香酚纳米乳液的FTIR光谱显示出与丁香酚和海藻酸盐基质相对应的显著峰。丁香酚纳米乳液珠子的FTIR光谱通常在720–1250 cm?1区域显示出强烈的峰，这些峰归因于C–O和C–H弯曲以及C–O–C伸缩振动，这是分子的指纹特征。此外，在大约1512–1637 cm?1区域出现了强烈的吸收带，对应于芳香环的CC伸缩振动，在3200到3600 cm?1区域则出现了宽的吸收带，表明酚基团的O–H伸缩。海藻酸盐珠子的特征是在3700–3000 cm?1范围内有宽的O–H伸缩带，在3000到2850 cm?1区间有C–H伸缩带，以及在1599 cm?1（不对称）和1416 cm?1（对称）附近有独特的羧酸酯（COO?）伸缩带，还有1081–1027 cm?1区域的C–O–C伸缩带。在封装了丁香酚的海藻酸盐珠子的FTIR光谱中，丁香酚的芳香和醚类峰的保留证实了包封的成功，没有显著的化学修饰。峰强度的轻微移动或变化，特别是在O–H和C–O–C区域，可能表明丁香酚与海藻酸盐基质之间存在物理相互作用，但通常观察不到表明强化学键合的新峰。这种光谱轮廓表明，丁香酚纳米乳液珠子和海藻酸盐珠子在纳米乳液系统中保持了它们的核心结构，FTIR分析提供了两种成分包封和兼容性的明确证据。图6

FTIR光谱显示了封装在海藻酸盐珠子中的肉桂油纳米乳液珠子（a）、丁香油纳米乳液珠子（b）和丁香酚纳米乳液珠子（c）的特征吸收带。图6还展示了对照海藻酸盐、单质油纳米乳液（肉桂油、丁香油和丁香酚）及其NE海藻酸盐珠子的FTIR光谱。该测试旨在从结构和功能上表征这些配方，以跟踪它们在制备成纳米乳液后与不同组分相互作用所导致的结构或功能变化。所有三种乳液在3000–2800 cm?1波长区域的较松弛带表明了组分的稳定性以及更好的H–OH相互作用。这也解释了NE配方中水含量的增加。从图6可以看出，肉桂油和丁香油是丁香酚的丰富来源，它们的FTIR光谱因其化学成分中丁香酚的主导地位而非常相似。肉桂油纳米乳液、丁香油纳米乳液和丁香酚纳米乳液珠子的FTIR光谱都展示了归因于丁香酚的特征吸收带。这些基于精油的纳米乳液珠子，以及封装在海藻酸盐珠子中的丁香酚纳米乳液，都显示了与丁香酚和海藻酸盐基质相对应的显著峰。丁香酚在720–1250 cm?1区域的强烈峰，C–O和C–H弯曲以及C–O–C伸缩振动，是该分子的指纹特征。海藻酸盐的特征是在3700–3000 cm?1范围内有宽的O–H伸缩带，在3000到2850 cm?1区间有C–H伸缩，在1599 cm?1（不对称）和1416 cm?1（对称）附近有独特的羧酸酯（COO?）伸缩带。封装了丁香酚的海藻酸盐珠子的FTIR光谱证实了成功的包封，没有显著的化学修饰。随后的FT-IR分析，图7–9显示了GC-MS分析，阐明在封装在海藻酸盐中的所有三种类型的纳米乳液珠子中都检测到了丁香酚。这表明丁香酚是封装系统中保留或释放的主要挥发性化合物，证实了其化学稳定性和成功包封。这对于丁香酚作为主要生物活性化合物的应用至关重要。图7

封装在海藻酸盐珠子中的肉桂油纳米乳液的GC-MS色谱图和质谱图。图8

封装在海藻酸盐珠子中的丁香油纳米乳液的GC-MS色谱图和质谱图。图9

封装在海藻酸盐珠子中的丁香酚纳米乳液的GC-MS色谱图和质谱图。在所有面板中，丁香酚都被检测为主要的和唯一的挥发性化合物，证实了其存在和化学稳定性在包封后的情况。没有观察到其他主要成分，表明了包封过程的特异性和效率。

3.1.4 GC-MS分析

GC-MS（气相色谱-质谱）分析提供了样品中存在挥发性化合物的详细化学谱型。在这种情况下，结果表明，在封装在海藻酸盐珠子中的所有三种类型的纳米乳液——肉桂油、丁香油和纯丁香酚——中，丁香酚是唯一可检测到的成分。这一发现表明，在实验条件下，丁香酚是封装系统中保留或释放的主要或唯一的挥发性化合物。这也意味着原始精油中存在的其他次要成分要么不存在，要么低于检测限，或者在纳米乳液的制备和包封过程中丢失了。在所有样品中仅检测到丁香酚，证实了其化学稳定性和成功包封，并支持FTIR结果，这些结果也表明丁香酚在海藻酸盐基质中的结构完整性得到了保持。这一结果对于丁香酚作为主要生物活性化合物的应用尤为重要，确保了包封产品的效力和目标释放。图7(a–c)显示了CNN中的丁香酚存在，保留时间为9.29和10.10。在CLN中，它同时含有丁香酚和香叶烯，保留时间分别为9.11、9.29、10.11、10.57和11.38（图8(a–d)）。EGN主要含有丁香酚，保留时间为9.02、9.15、9.30和11.48（图9(a–d)）。GC-MS色谱图的详细报告显示在表S5中。

3.2 使用纳米乳液精油珠子对Tribolium castaneum的体外研究

在对海藻酸盐纳米乳液珠子进行了表征之后，对其对Tribolium castaneum的活性进行了体外评估，以检查它们的驱虫、熏蒸、杀卵和杀幼虫活性。同时，研究了制备的纳米乳液在大约150小时内的释放动力学，其效率显示在SI（图S1）中。此外，每个纳米乳液珠子的释放动力学显示在表S2–S4中。此外，还优化了精油的致死浓度，并在表S1中显示出来，以确认它们的剂量效应。然后，将NE珠子的效果与对照海藻酸盐珠子进行了比较，以评估它们对Tribolium castaneum的潜力。需要对海藻酸盐纳米乳液珠子进行TG-AMS（或至少TGA/TG-MS）测试，以证明载体系统在热上稳定，成分定义明确，并且在结构上适合受控扩散驱动的释放，而不仅仅是报告一个未知基础材料行为的释放曲线。TGA量化了水分、溶剂和挥发性成分，并确定了海藻酸盐、药物和任何油/表面活性剂组分的降解温度，确保珠子在加工和储存条件下保持完整。在扩散研究中，这证实了释放曲线不会因过早的热/氧化降解或过量的残留挥发物而复杂化，这些挥发物可能会使基质塑化并改变扩散性。多步骤质量损失事件及其温度范围反映了交联密度、结合水与自由水以及额外有机相的存在；这些特征有助于解释系统是作为简单的Fickian扩散器、膨胀/侵蚀控制系统还是混合机制。TG-AMS曲线在空白珠子、负载纳米乳液的珠子以及不同交联的配方之间进行了比较，热稳定性和挥发性演变的改变与拟合的释放模型（例如，Higuchi、Korsmeyer–Peppas）相关联，为观察到的扩散系数提供了物理化学基础。热分析（TGA与DSC或MS结合使用）是预配方中的标准要求，以确认药物-聚合物的兼容性、没有意外的分解产物以及材料整体的完整性，这对于监管接受度和可控释放珠子的可重复性能至关重要。图7

封装在海藻酸盐珠子中的肉桂油纳米乳液的GC-MS色谱图和质谱图。图8

封装在海藻酸盐珠子中的丁香油纳米乳液的GC-MS色谱图和质谱图。图9

封装在海藻酸盐珠子中的丁香酚纳米乳液的GC-MS色谱图和质谱图。在所有图中，丁香酚被检测为主要的和唯一的挥发性化合物，证实了其在包封后的存在和化学稳定性。没有观察到其他主要成分，表明了包封过程的特异性和效率。

3.1.4 GC-MS分析

GC-MS（气相色谱-质谱）分析提供了样品中存在的挥发性化合物的详细化学谱型。在这种情况下，结果表明，在海藻酸盐珠子中封装后，丁香酚是所有三种类型的纳米乳液——肉桂油、丁香油和纯丁香酚——中唯一可检测到的成分。这一发现表明，在实验条件下，丁香酚是封装系统中保留或释放的主要或唯一挥发性化合物。这也意味着原始精油中存在的其他次要成分要么不存在，要么低于检测限，或者在纳米乳液的制备和包封过程中丢失了。在所有样品中仅检测到丁香酚，证实了其化学稳定性和成功包封，并支持了FTIR的结果，这些结果也表明丁香酚在海藻酸盐基质中的结构完整性得到了保持。这一结果对于丁香酚作为主要生物活性化合物的应用尤为重要，确保了包封产品的有效性和靶向释放。图7(a–c)显示了CNN中丁香酚的存在，保留时间为9.29和10.10。在CLN中，它同时含有丁香酚和香叶烯，保留时间分别为9.11、9.29、10.11、10.57和11.38（图8(a–d)）。EGN主要含有丁香酚，保留时间为9.02、9.15、9.30和11.48（图9(a–d)）。GC-MS色谱图的详细报告显示在表S5中。

3.2 使用纳米乳液精油的Tribolium castaneum的体外研究

在对海藻酸盐纳米乳液珠子进行了表征之后，对其活性进行了体外评估，以检查它们对Tribolium castaneum的驱虫、熏蒸、杀卵和杀幼虫效果。同时，研究了这些配方纳米乳液在大约150小时内的释放动力学，其效率显示在SI（图S1）中。此外，每个纳米乳液珠子的释放动力学显示在表S2–S4中。此外，还优化了精油的致死浓度，并在表S1中显示出来，以确认它们的剂量效应。然后，将NE珠子的效果与对照海藻酸盐珠子进行了比较，以评估它们对Tribolium castaneum的潜力。需要对海藻酸盐纳米乳液珠子进行TG-AMS（或至少TGA/TG-MS）测试，以证明载体系统在热上稳定，成分明确，并且在结构上适合受控扩散驱动的释放，而不仅仅是报告一个未知基础材料行为的释放曲线。TGA量化了水分、溶剂和挥发性成分，并确定了海藻酸盐、药物和任何油/表面活性剂成分的降解温度，确保珠子在处理和储存条件下保持完整。在扩散研究中，这证实了释放曲线没有受到提前热/氧化降解或过量残留挥发物的影响，这些挥发物可能会使基质塑化并改变扩散性。多步骤质量损失事件及其温度范围反映了交联密度、结合水与自由水，以及额外有机相的存在；这些特征有助于解释系统是作为简单的Fickian扩散器、膨胀/侵蚀控制系统还是混合机制。TG-AMS曲线在空白珠子、负载纳米乳液的珠子和不同交联的配方之间进行了比较，热稳定性和挥发性变化与拟合的释放模型（例如，Higuchi、Korsmeyer–Peppas）相关联，为观察到的扩散系数提供了物理化学基础。热分析（TGA与DSC或MS结合使用）是预配方中的标准要求，以确认药物-聚合物的兼容性、没有意外的分解产物以及材料整体的完整性，这些对于控制释放珠子的监管接受度和可重复性能至关重要。特别是对于海藻酸钠系统，基于热重（TG）的表征方法支持了关于改善稳定性、控制释放和珠剂配方稳健性的说法，而不是让扩散行为的机制和可靠性成为猜测。

3.2.1 驱避活性的评估

然后，基于抑制区大小测试了NE珠子（肉桂油纳米乳液：CNN、丁香油纳米乳液：CLN和丁香酚纳米乳液：EGN）的驱避活性。为了检查驱避活性，我们使用了20只幼虫与1克浓度的SA珠子和海藻酸钠NE珠子。图10显示，CNN珠子表现出最高的驱避活性，其次是EGN和CLN珠子，其p值小于0.01，表明了其显著性。在SA珠子中没有观察到驱避活性。

3.2.2 熏蒸活性的评估

为了检查熏蒸活性，将幼虫暴露于熏蒸剂中12小时、24小时和36小时。没有触角或腿部运动的昆虫被视为死亡。图11显示了对照SA珠子和NE珠子（肉桂油纳米乳液：CNN、丁香油纳米乳液：CLN和丁香酚纳米乳液：EGN）的熏蒸活性，结果表明在36小时时CNN珠子的死亡率最高，统计显著性p < 0.01。接着是EGN和CLN珠子，在1克浓度的NE珠子中也观察到了这种活性。

3.2.3 杀卵活性的确定

通过杀卵活性研究了抑制成虫从卵中发育和生长的效果。将昆虫幼虫用1克浓度的NE珠子（肉桂油纳米乳液：CNN、丁香油纳米乳液：CLN和丁香酚纳米乳液：EGN）处理不同时间段（26小时、50小时、74小时和98小时），并随着暴露时间的增加观察到毒性。图12解释了不同时间点NE珠子的杀卵活性，并基于死亡率进行测量。从这项分析中可以看出，CNN珠子在98小时时间点显示出最高的死亡率，其次是EGN和CLN珠子，其显著性p值小于0.01。然而，SA珠子没有显示出任何杀卵活性，表明其对卵无效。

3.2.4 幼虫杀活性的评估

在海藻酸钠和NE珠子（肉桂油纳米乳液：CNN、丁香油纳米乳液：CLN和丁香酚纳米乳液：EGN）的幼虫杀活活性方面， different time points up to 30 hours进行了测试。观察到T. castaneum幼虫的死亡率，图13显示CNN珠子在30小时的最大时间点实现了幼虫杀活活性。从这项分析中可以看出，幼虫杀活活性随着暴露时间的增加而增加。CNN珠子显示出更高的死亡率，其次是EGN和CLN，而对照SA珠子没有显示出活性，表明其无毒性质。

4. 结论

在这项研究中，我们证明了使用肉桂、丁香和丁香酚的纳米乳液珠剂配方对储粮主要害虫Tribolium castaneum表现出强烈的杀虫潜力。纳米乳液形式的增强稳定性、生物利用率和活性化合物的持续释放显著提高了它们的效果，与传统配方相比。在我们的研究中，在所制备的NE珠子中，CNN NE珠子在处理Tribolium castaneum方面具有显著效果，同时也证明了含有海藻酸钠的NE珠子对昆虫没有毒性效应。由于肉桂油纳米乳液的液滴尺寸更小且分散性更好，其对储藏害虫如Tribolium castaneum具有极强的毒性，即使在较低浓度下也能显示出最高的死亡率和驱避性，表明它作为一种高效的环保生物杀虫剂具有巨大潜力。这些发现突显了基于精油的纳米乳液珠剂作为合成杀虫剂可持续替代品的潜力，提供了有效的害虫管理方式，同时将环境和健康风险降到最低。本研究的局限性包括NE珠子的效果仅在一个害虫上进行了测试，其他害虫尚未测试。此外，未来需要将研究扩展到其他食物害虫和性别差异的实验上，还需要研究其生物降解性。然而，尚未进行全面的生态毒性评估，包括对非目标生物（如授粉者、自然捕食者和土壤微生物）的影响，这是下一步的重要工作。

本研究使用了根据适当的许可协议获得专利的新颖生物聚合物基生物杀虫剂，并遵守了机构和国际知识产权规定。生物聚合物基生物杀虫剂的专利号为：202541021057。研究还使用了根据适当的许可协议获得专利的新型珠子封装仪器，专利号为：202541021001。此外，我们使用了新型储藏害虫控制装置，该装置正在Vellore技术学院的申请下考虑专利。