用于分析接受局部糖皮质激素治疗的鼻息肉中炎症和免疫反应的FTIR微光谱技术

《Journal of Spectroscopy》：FTIR Microspectroscopy for the Analysis of Inflammatory and Immune Responses in Nasal Polyps Treated With Local Glucocorticoids

　　**摘要**


**引言**
鼻窦炎是一个重要的健康问题，其发病率与过敏性鼻炎的增加趋势相平行。本研究旨在利用傅里叶变换红外光谱（FTIRM）技术，探讨慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）患者在接受局部糖皮质激素（GC）治疗时的生化、炎症和免疫反应机制。

**方法**
我们使用FTIRM分析了健康个体（n=10）和被诊断为CRSwNP的患者（n=20）的鼻黏膜（NM）。为此，我们从鼻黏膜活检样本中制备了冷冻切片，并分别检测上皮组织和结缔组织，以识别与炎症和免疫反应相关的主要生物分子和成分。

**结果**
最常见的症状包括鼻塞、流鼻涕和前额头痛，其中过敏性鼻炎是最常见的合并症。FTIRM光谱显示，在上皮组织和结缔组织部分，CRSwNP组与健康组在结构或生化组成上没有统计学上的显著差异。值得注意的是，CRSwNP组的上皮区域中，与磷酸二酯键、磷酸化分子以及IL-6、IL-10和IFN-γ相关的吸收峰增强，表明炎症和免疫反应更活跃。相比之下，在结缔组织区域，除IL-6和IFN-γ外，大多数炎症相关物质的吸收峰较低，这揭示了生物分子反应的区域差异。

**结论**
TNF-α和IgA被确定为受GC治疗影响最大的生物标志物，这突显了它们作为治疗反应指标的潜力。

**1. 引言**
鼻窦炎（RS）是一个日益严重的健康问题，常常与过敏性鼻炎的发病率上升相伴而生。该疾病包括急性鼻窦炎（ARS）、慢性鼻窦炎（CRS）、伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎（CRSwNP）和不伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎（CRSsNP）[1]。鼻息肉（NPs）是鼻旁窦黏膜的炎症性增生，通常发生在中鼻甲和筛窦区域[2]。尽管鼻息肉与未来癌症风险之间的关联仍有争议，但Kim等人在2019年发现，50岁以上被诊断为鼻息肉的患者鼻咽癌的风险增加[3]。鉴于全球癌症监测机构（GLOBOCAN）2022年报告的全球鼻咽癌发病率达120,434例[4]，这一点尤为重要。鼻息肉的情况具有异质性：嗜酸性粒细胞炎症或2型炎症主导的息肉常伴随哮喘，而嗜酸性粒细胞炎症较低的息肉则通常不伴随哮喘[3]。然而，鼻息肉的炎症类型是否影响癌症风险仍不明确[3]。因此，需要更精确的组织水平表征或新的生物标志物研究。北美和欧洲国家的慢性鼻窦炎患病率在4.2%至12%之间[5, 6]。大约14%的成年人每年会出现鼻窦炎症状；在加拿大，男性患病率为3.4%，女性为5.7%[5, 6]。直接治疗费用平均为每位患者每年921加元，同时每年因缺勤造成的间接损失估计为128亿美元[7]。鼻息肉影响高达4%的成年人群，在所有鼻窦炎患者中，25%-30%患有CRSwNP[8]。此外，CRSwNP患者的生活质量下降，被认为是一种需要长期持续药物治疗（如糖皮质激素）和外科治疗的终身健康问题[9-11]。CRSwNP的特点是鼻窦上皮屏障功能受损，导致组织通透性增加、上皮抵抗力下降、上皮棘层增厚和棘层溶解。其具体原因尚不清楚[8]。诊断鼻窦炎需要两种或两种以上的症状：鼻塞、流鼻涕、面部疼痛或嗅觉丧失[8]。CRSwNP通过内镜观察鼻息肉进行诊断，而CRSsNP则在内镜下未见息肉时作出诊断[12, 13]。上皮细胞通过多种细胞因子和趋化因子支持先天性和获得性免疫系统。B细胞的局部激活及抗体产生在CRSwNP的发病机制中起重要作用，其特征是IL-4、IL-5和IL-13的水平升高[14]。此外，IL-4、IL-5、IL-13的升高还会导致肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的激活以及杯状细胞的增生[14-17]。最近的研究表明，IgE、IgG、IgA和IgD的局部转换也可能在鼻息肉的发病机制中起重要作用[14-17]。傅里叶变换红外光谱（FTIR）在生物样本研究中非常有用。该技术基于红外（IR）辐射被分子吸收时产生的能量变化，从而检测不同的生物分子（如脂质、蛋白质、碳水化合物和核酸）。通过将FTIR光谱与光学显微镜结合，FTIR微光谱（FTIRM）能够可视化并绘制功能基团和分子排列图谱[18]。FTIRM具有足够的灵敏度，可以确定成分的分布和取向，已被用于多种病理学研究[18]。该技术通过测量特定光谱峰下的面积及不同区域之间的比率来检测分子浓度[18]。鉴于此，CRSwNP的治疗重点在于减少组织嗜酸性粒细胞增多和纤维化，包括局部应用糖皮质激素、生理盐水冲洗和健康教育[17]。因此，本研究利用FTIRM分析了接受糖皮质激素治疗的CRSwNP患者及健康组的鼻黏膜（NM）的生化变化、炎症和免疫反应。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究对象与伦理标准**
2021年11月至2023年4月期间，我们从国防部（SEDENA）下属的中央军事医院的患者处获取了鼻黏膜活检样本，并获得了患者的知情同意。对照组包括10名接受鼻外科手术（鼻中隔成形术或鼻甲成形术）的健康志愿者的鼻黏膜样本。CRSwNP组包括20名接受内镜鼻窦手术的CRSwNP患者的鼻黏膜样本。这些患者在术前2个月内接受了糖皮质激素治疗和鼻腔冲洗。CRSwNP组的诊断标准遵循欧洲鼻窦炎和鼻息肉立场文件（EPOS）[15]。所有患者均接受了鼻窦CT扫描，根据Meltzer临床评分系统，其鼻息肉评分均高于3分[15]。纳入标准为年龄在18-65岁之间的患者；排除标准包括活检后超过24小时采集的样本、急性炎症病变、鼻腔或鼻旁窦连续性病变以及之前接受过鼻部或鼻窦手术的患者。研究方案和知情同意书得到了机构伦理委员会的批准，所有实验均符合1964年《赫尔辛基宣言》规定的伦理标准[16]。

**2.2. 鼻黏膜活检的获取**
根据Belmont报告的“人类受试者保护伦理原则和指南”，所有研究对象的样本均为自愿提供。为降低风险，我们采集了体积约为3 mm3的生物样本，并从中获取了三个组织切片。考虑到鼻息肉主要位于中鼻甲和筛窦区域（这些区域由嗅觉上皮覆盖），且鼻中隔也由同种上皮覆盖[19]，我们选择鼻中隔组织作为对照样本。活检在全身麻醉下进行。对于对照组（健康人），手术开始时在右侧鼻中隔黏膜交界处获取样本；对于CRSwNP组，则在内镜观察下使用30°镜头和活检钳从左侧中鼻甲息肉处取样。样本采集后立即置于低温储存环境中以备后续分析。

**2.3. 临床数据收集**
活检前一天，我们询问了与CRSwNP相关的主的症状，包括鼻塞、流鼻涕、前额头痛、后鼻滴漏、打喷嚏、嗅觉丧失、嗅觉减退、面部肿胀、黏膜充血、瘙痒、鼻甲肥大和打鼾等症状，并记录了患者的合并症情况。

**2.4. FTIRM分析**
生物样本被嵌入Tissue-Tek（Sakura，型号4583）中并冷冻保存。随后制备5 μm的冷冻切片，将其固定在镀金显微镜载玻片上（Aldrich，编号643246-5EA）。将上皮组织与结缔组织分开进行显微观察，重点分析组织结构最完整的区域以便进行精细的FTIRM分析。每个样本重复分析三次。组织样本使用Jasco IR-5200红外光谱仪（配备Jasco 6600傅里叶变换红外光谱仪）进行分析，光谱分辨率设为4 cm?1，扫描次数为120次，覆盖中红外范围（4000–4000 cm?1）。首先使用Unscrambler X Version 10.3（Camo Software AS）中的标准正常变量（SNV）方法对所有光谱进行归一化处理。然后计算各组的平均值，并分析组间差异。最终使用Origin 8.5软件绘制归一化和平均后的光谱图。

**2.5. 通过曲线下面积（AUC）分析主要生化成分**
在每个组中，计算了与黏蛋白（1760–1726, 1182–1144, 1040–1019 cm?1）、I型及III型胶原（1355–1323 cm?1）、I型胶原（1260–1219, 1182–1144 cm?1）、酰胺I（1690–1593 cm?1）、酰胺II（1586–1489 cm?1）、酰胺III（1355–1323, 1297–1269 cm?1）、脂质（1481–1425 cm?1）、蛋白质氨基酸链（1418–1364 cm?1）、磷酸化分子（1260–1219, 1115–1066 cm?1）和糖脂（1213–1199 cm?1）相关的区域的峰值位置和AUC。使用Origin 8.5软件进行AUC和曲线拟合分析。

**2.6. 与炎症和免疫反应相关的成分分析**
分析了TNF-α（300-01A，PreproTech，美国新泽西州Cranbury）、IL-6（900-M16，BioLegend，美国圣地亚哥）和IL-10（575809，BioLegend，美国加州圣地亚哥）在不同浓度（405 ng/μL、810 ng/μL、1215 ng/μL）下的纯形式，以确定其光谱特征。对于IFN-γ和IgA，则参考了先前的研究结果[20]。

**2.7. 统计分析**
所有数据均重复采集三次，AUC以“平均值±标准差（SD）”表示。根据数据的正态性，使用Mann–Whitney U检验或t检验进行数据分析。p值小于0.05被视为统计学上显著。统计分析使用IBM SPSS Statistics 25.0软件完成。

**3. 结果**
**3.1. 研究对象描述**
本研究利用FTIRM分析了CRSwNP患者鼻黏膜中的主要免疫和生化成分。健康组包括10名志愿者（60%为男性，40%为女性，平均年龄37±10.69岁）。CRSwNP组包括20名患者（65%为男性，35%为女性，平均年龄41.6±8.05岁）。两组的主要合并症进行了分析，发现CRSwNP组中最常见的合并症是过敏性鼻炎（40%），其次是哮喘（20%），而在健康组中未见哮喘[1]。同时分析了CRSwNP组的主要症状（表1和表2），其中鼻塞（65%）、流鼻涕（50%）和前额头痛（40%）最为常见，其次是后鼻滴漏（25%）。

**表1. 慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组的主要合并症**
| 组别 | 性别 | 合并症 |
|-----------|------------|-------------------------------------------|
| CRSwNP | 13（65%） | 过敏性鼻炎（40%） |
| | 7（35%） | 哮喘（20%） |
| | 1（5%） | |
| | 4（20%） | |
| 健康组 | 6（60%） | |
| | 4（40%） | |
| | 0 | |

**表2. 慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）组的症状**
| 症状 | 发生率（%） |
|-----------|------------|-------------------------------------------|
| 鼻塞 | 13（65%） |
| 流鼻涕 | 10（50%） |
| 前额头痛 | 8（40%） |
| 后鼻滴漏 | 5（25%） |
| 打喷嚏 | 3（15%） |
| 嗅觉丧失 | 2（10%） |
| 嗅觉减退 | 1（5%） |
| 面部肿胀 | 1（5%） |
| 黏膜充血 | 1（5%） |
| 黏膜水肿 | 2（10%） |
| 痒感 | 1（5%） |
| 鼻甲肥大 | 1（5%） |
| 打鼾 | 1（5%） |FTIRM分析

图1展示了两组研究对象（健康组和CRSwNP组）在生物指纹区域（1800–800 cm?1）的标准化和平均化FTIRM光谱，其中比较了上皮组织区域（图1(a)）和结缔组织区域（图1(b)）的生化成分。图1(c)显示了峰值[21–23]的生化成分分配。在图中观察到与生物样本相关的代表性谱带，如脂质、蛋白质、碳水化合物和核酸等，在两个分析的显微切片中，CRSwNP组与健康组在结构和生化组成上没有显著差异（表3）。

表3：生物指纹区域最具代表性的谱带的曲线下面积（AUC）。
| 谱带 | 健康组 | CRSwNP组 |
|------------|------------|------------|
| 1 | 1726.94 | 1726.94 |
| p | 0.95 | 0.606 |
| 2 | 1731.28 | 1739.89 |
| p | 0.73 | 17.55 |
| 3 | 1663.78 | 1663.95 |
| p | 0.53 | 298.84 |
| 4 | 1553.86 | 1655.59 |
| p | 0.76 | 296.94 |
| 5 | 1453.58 | 1453.65 |
| p | 0.18 | 55.18 |
| 6 | 1453.74 | 1453.10 |
| p | 0.69 | 195.28 |
| 7 | 1402.00 | 1402.48 |
| p | 0.37 | 47.36 |
| 8 | 1240.49 | 1240.00 |
| p | 0.14 | 20.42 |
| 9 | 1205.29 | 1205.29 |
| p | 0.84 | 2.41 |
| 10 | 1160.94 | 1163.99 |
| p | 0.88 | 4.61 |
| 11 | 1082.83 | 1082.99 |
| p | 0.53 | 23.83 |
| 12 | 1032.69 | 1031.89 |
| p | 0.37 | 8.43 |
| 13 | 1038.48 | 1035.04 |
| p | 5.17 | 7.63 |
| 14 | 1285.38 | 1239.68 |
| p | 0.138 | 4.25 |
| 15 | 1031.89 | 1163.83 |
| p | 0.366 | 4.61 |
| 16 | 1035.04 | 1163.42 |
| p | 0.731 | 5.63 |
| 17 | 1211.08 | 1207.91 |
| p | 2.41 | 5.65 |
| 18 | 1163.99 | 1181.11 |
| p | 0.88 | 4.61 |
| 19 | 1082.99 | 23.83 |
| p | 0.53 | 2.41 |
| 20 | 1160.94 | 1083.80 |
| p | 0.15 | 7.37 |
| 21 | 1205.29 | 1083.80 |
| p | 0.84 | 27.34 |
| 22 | 1032.69 | 1031.89 |
| p | 0.37 | 7.11 |
| 23 | 1207.91 | 1211.08 |
| p | 0.84 | 5.65 |
| 24 | 1163.42 | 1180.11 |
| p | 0.15 | 2.41 |
| 25 | 1082.99 | 23.83 |
| p | 0.53 | 0.84 |

然而，在CRSwNP组中，与酰胺I区域相对应的谱带发生了位移，这可能是由于蛋白质的构象变化所致。同样，蛋白质的酰胺III区域也观察到了更高的吸收度。

3.3. 与炎症和免疫反应相关的成分分析

分析了与炎症和免疫反应相关的成分，包括IFN-γ、IgA、TNF-α、IL-6和IL-10。IFN-γ（1061–1044和978-956 cm?1）和IgA（1285–1237 cm?1）已在另一项研究中被标准化[20]。TNF-α、IL-6和IL-10在不同的浓度（405、810和1215 ng/μL）下进行了分析，其谱带强度随浓度增加而增加（图2(a)、2(b)和2(c)）。同样，仅在某一成分中表达且在不同浓度下强度增加的谱带也被认为是该成分的（图2(d)）。因此，确定的成分分别为：TNF-α（1243–1217 cm?1）、IL-6（1393–1381和1181–1161 cm?1）和IL-10（1004–976 cm?1）。

图2显示了这些分子在上皮组织和结缔组织区域中的表达情况。可以观察到，与IL-6（1181–1161 cm?1）、IL-10（1004–976 cm?1）和IFN-γ（1061–1044和978-956 cm?1）相关的谱带在CRSwNP组中的表达量高于健康组。相比之下，在结缔组织区域，除了IL-6（1181–1161 cm?1）和IFN-γ（1061–1044 cm?1）外，大多数成分在CRSwNP组中的表达量较低。然而，需要注意的是，在计算这些成分的AUC时并未观察到统计显著性（表4）。

表4：与炎症和免疫反应相关的成分的曲线下面积（AUC）。
| 成分 | 健康组 | CRSwNP组 |
|--------------|-----------|-------------|
| IFN-γ (978–956 cm?1) | 7.50 ± 8.49 | 9.27 ± 12.62 |
| | 0.731 | 6.16 ± 5.81 |
| IFN-γ (1061–1044 cm?1) | 9.47 ± 6.93 | 10.52 ± 8.94 |
| | 0.628 | 7.18 ± 4.11 |
| TNF-α (1243–1217 cm?1) | 21.09 ± 6.31 | 19.26 ± 20.65 |
| | 0.181 | 17.60 ± 5.19 |
| IL-6 (1393–1381 cm?1) | 9.32 ± 1.60 | 9.62 ± 6.31 |
| | 0.366 | 9.49 ± 4.1 |
| IL-6 (1181–1161 cm?1) | 4.25 ± 4.31 | 4.25 ± 4.31 |
| | 0.731 | 5.63 ± 6.09 |
| IL-10 (1004–976 cm?1) | 7.63 ± 10.15 | 7.63 ± 10.15 |
| | 0.534 | 8.52 ± 14.02 |
| | 0.836 | 7.37 ± 7.14 |
| IgA (1285–1237 cm?1) | 38.81 ± 11.55 | 33.37 ± 38.68 |

4. 讨论

如前所述，本研究的主要目的是使用FTIRM技术探讨CRSwNP组鼻息肉（NP）中参与鼻黏膜（NM）炎症反应的生化 and 免疫成分。关于CRSwNP的患病情况，该病在男性中更为常见[24]。Raciborski等人指出，这种疾病通常影响中老年人；诊断时的平均年龄为40–60岁[11]。Hulse等人也提到，CRSwNP的发病率在45至65岁之间最高[25]。在本研究中，我们发现男性患者占比（65%）高于女性患者（35%），患者的平均年龄为41.6 ± 8.05岁，与上述数据一致。此外，一些研究表明支气管哮喘和鼻炎是常与CRSwNP共存的疾病[17, 26]，这与我们的研究结果一致，因为我们在CRSwNP组中观察到40%的患者患有过敏性鼻炎，20%的患者患有哮喘。在临床数据方面，CRSwNP患者最常见的症状是鼻塞（65%）、流鼻涕（50%）和前额头痛（40%），这些症状与Schleimer和Claeys等人的报告一致[27, 28]。他们还提到CRSwNP患者会出现鼻塞、面部疼痛或压迫感以及持续的鼻分泌物[27, 28]。在生化谱型分析方面，尽管两组之间没有观察到统计显著性，但对照组在与磷酸二酯键（图1，峰值5）和磷酸化分子（图1，峰值8）相关的谱带显示出更高的吸收度。众所周知，CpG-DNA中的天然磷酸二酯键可以上调促炎细胞因子的表达，从而具有免疫调节作用[29]。此外，据报道，鼻息肉中的eNOS磷酸化显著增加，从而增加了血管内皮细胞的通透性，促进了CRSwNP中的炎症[30]。然而，需要指出的是，在本研究中，CRSwNP患者接受了鼻 Voyager（GC）治疗，这种治疗可以上调多种抗炎介质。其中包含磷酸酶，这些磷酸酶可以失活MAPKs。在肥大细胞中，它们可能参与其他磷酸酶的诱导以及促炎信号通路的负调节[31]。这可能解释了为什么在CRSwNP组中磷酸化分子的表达量较低。尽管没有观察到统计显著性，但在CRSwNP组的上皮组织和结缔组织区域，与黏蛋白相关的谱带出现轻微增加。一些研究表明，黏蛋白是CRSwNP患者气道黏液的重要组成部分，影响了黏液的流变性。这归因于黏膜下腺体增生、气道杯状细胞数量增加和黏蛋白的过度分泌，尤其是MUC5AC和MUC5B[32]。在分子水平上，细胞因子通过两种机制发挥作用：一种是通过b-FGF、IGF-1、TGF-α和TGF-β刺激局部组织生长；另一种是通过IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6和IFN-γ等分子维持长期炎症状态[33]。因此，本研究通过测量TNF-α、IL-6、IL-10和IL-10的水平来评估长期炎症状态。如结果部分所述，两组之间没有观察到统计显著性。然而，在上皮组织区域，与IL-6（1181–1161 cm?1）、IL-10（1004–976 cm?1）和IFN-γ（1061–1044和978–956 cm?1）相关的谱带在CRSwNP组的吸收度略有增加。尽管如此，在结缔组织区域，大多数成分在CRSwNP组中的表达量较低。这可能是由于GC治疗的影响。据报道，GC可以抑制促炎细胞因子（包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、GM-CSF、TNF-α和IFN-γ）以及黏附分子（ICAM-1和E-selectin）的转录[33]。此外，构成鼻息肉炎症浸润的主要细胞是T淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞，它们主要产生IgA，这是本研究中分析的免疫球蛋白，表明浆细胞的活性依赖于IL-10和TNF-α[34]。如前所述，CRSwNP组在接受GC治疗后IgA的表达量降低，这调节了IL-10和TNF-α的水平以及嗜酸性粒细胞的分布，从而控制了局部IgA的合成[35]。尽管本研究的结果没有统计学意义，但我们展示了FTIRM在鼻组织分析中的潜力。因此，有必要继续进行此类研究，扩大研究人群，比较不同的治疗方法，并评估不同的药物给药方式或应用时机。

5. 结论

综上所述，可以确定TNF-α和IgA是CRSwNP组中受GC影响的主要生物标志物。然而，有必要通过检查未经GC治疗的CRSwNP患者的生化变化来继续这项研究，同时扩大研究人群，使用生化映射模式，比较不同时间点的变化，评估其他类型的治疗，并考虑从遗传或表型特征上描述分析组织的研究。此外，FTIRM作为一种转化技术，能够快速、无损地分析样本，在生化映射模式下，它可以补充或替代组织学或免疫表型技术。

作者贡献
Gustavo Jesus Vazquez-Zapien、Adriana Martinez-Cuazitl和Monica Maribel Mata-Miranda设计了项目，规划了实验并撰写了手稿。Izanami Tamaniz-Marcos、Maricruz Guerrero-Perez和Melissa Guerrero-Ruiz收集了鼻样本，进行了实验并进行了统计分析。Jose Ricardo Sanchez-Santa Ana、Eugenio Salas-Olvera和Francisco Garibay-Gonzalez获取了患者的鼻样本，并对手稿写作提供了重要建议。所有作者都审查了手稿。

致谢
作者感谢那些同意参与并提供生物样本的人。

资金
本研究未获得任何资助。

伦理声明
国防部中央军事医院的临床研究伦理委员会批准了该协议并获得了知情同意（C.INV.-09/2022）。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
本文包含了本研究生成的所有数据和分析结果。