关于一种新型高度均匀的粉末成型多孔Ti-5Cu合金的抗菌、骨生成和生物相容性研究，该合金是通过增材制造技术制备的

《Materials Today Advances》：Study on the antibacterial, osteogenic, and biocompatible properties of a novel highly homogeneous powder-forming porous Ti-5Cu alloy fabricated via additive manufacturing

　　王洪斌|王浩|王淑欣|潘丽萍|王岐伟|梁光辉|吴水林|朱马塔兰特|李绍富|曹永平
北京协和医院骨科，中国北京100034

**摘要**
引言
术后感染和骨再生不足仍然是关节置换手术中的关键挑战。

**方法**
通过溶胶-凝胶法制备出新型高均匀性的铜镀层钛粉，利用激光粉末床熔融（LPBF）技术制备出具有螺旋面结构的Ti-5Cu支架。对材料进行了表征、机械性能测试、铜离子释放分析；针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的抗微生物活性测试；通过MC3T3-E1细胞进行了细胞相容性和成骨分化的研究；并使用兔子感染模型、大鼠皮下植入模型和大鼠骨缺损模型进行了体内验证。

**结果**
所得Ti-Cu粉末具有均匀的铜分布、高球形度和良好的流动性。Ti-5Cu支架表现出最佳的结构参数（孔隙率为67.19%，孔径为506 μm），以及优异的机械性能（屈服强度为205.98 MPa，弹性模量为8.16 GPa）。该材料表现出持续的铜离子释放（28天内释放量为0.1–0.8 mg/L），强大的抗菌活性（对S. aureus和大肠杆菌的杀菌率高达99%），以及显著的抗生物膜形成能力，并在基因和蛋白质水平上促进了成骨分化。体内实验结果证实了其有效的感染控制能力、促进骨再生的效果以及优异的生物相容性，且无全身毒性。

**结论**
新型Ti-5Cu支架结合了最佳的结构设计和均匀的铜分布，同时具备抗菌效果、促进成骨作用和良好的生物相容性，为复杂的骨科重建病例提供了一种有前景的解决方案。

1. 引言
过去十年中，中国经历了前所未有的老龄化速度。65岁及以上的人口几乎翻了一番，从1.2亿增加到2.1亿[1]。快速老龄化导致对关节置换手术的需求大幅增加，术后并发症（如假体周围感染和无菌松动）也随之增加。预计到2030年，关节置换手术的数量将增加182%[2,3]。在关节置换手术中修复骨缺损是一个重大挑战。虽然自体骨移植被视为“黄金标准”，但其来源有限，并且容易导致供体部位的并发症。异体及异种骨移植存在免疫排斥、疾病传播和成骨能力不足的风险[4]。因此，金属多孔骨替代物已成为修复骨缺损的主要方法[5]。
钛合金因其低密度、高强度、优异的生物相容性和强耐腐蚀性而被广泛用于金属多孔支架[6]。然而，传统的Ti6Al4V合金缺乏固有的抗菌性能，使其容易受到术后细菌感染的影响，特别是金黄色葡萄球菌感染，这可能导致植入物失败甚至患者死亡[7]。为此，研究人员开发了表面抗菌涂层技术，如化学气相沉积和离子植入[8]。然而，这些涂层往往附着力差、容易剥落，并且长期抗菌效果有限，表明其耐用性需要显著改进[9,10]。
因此，开发在整个结构中都具备抗菌性能的金属材料至关重要。研究表明，向钛合金中添加Cu或Ag可以赋予其强大的抗菌效果和良好的生物相容性[11–13]。然而，传统的制备方法（如铸造和粉末冶金）存在复杂加工、微观结构不均匀、氧化和晶粒粗大等挑战[9,10,12,14]。
金属增材制造（3D打印）技术能够个性化制造促进骨整合的复杂多孔结构[15]。其中，三周期最小表面（TPMS）结构，特别是螺旋面类型，由于其仿生特性、优异的机械性能和高渗透性，在骨再生方面表现出显著优势[16–22]。然而，目前的研究主要集中在机械分析上[23]，导致其在骨再生中的功能性应用探索不足。
增材制造需要成分均匀且可塑性能好的粉末。目前商用钛粉主要通过气体雾化法生产，具有良好的流动性和低杂质含量；但这些粉末缺乏抗菌元素的添加，且容易发生成分偏析[24,25]。尽管机械混合或高能量球磨可以改善成分均匀性[26]，但这些方法往往会损害粉末的球形度和流动性，从而影响打印性能[27]。
为解决这些挑战，本研究制备了一种均匀的铜镀层钛粉。利用激光增材制造和螺旋面结构，成功制备出了多孔Ti-5Cu合金。这种材料结合了个性化定制、抗菌功能和促进成骨的优点。选择纯钛作为基质，以避免Al和V的毒性。添加5 wt%的Cu可在保持机械性能的同时提供强大的抗菌和成骨活性[10,14,28]。本文系统研究了该合金的微观结构、机械性能、离子释放行为、抗菌效果、成骨能力和生物相容性，为新型生物医用钛合金的设计提供了宝贵的见解和实用基础。

2. 材料与方法
2.1. 多孔Ti-5Cu合金支架的制备
铜镀层钛粉采用沉积-沉淀法制备，随后进行氢辅助热还原。使用Cu(NO3)2·3H2O作为铜源，溶解在去离子水中，然后在500 rpm的机械搅拌下加入Ti粉。再逐滴加入NH3·H2O，以诱导含铜前驱体在Ti粉表面沉淀。该过程可表示为：
(1) Cu(NO3)2 + 2NH3·H2O → Cu(OH)2↓ + 2NH4NO3
搅拌3小时后，将烧杯放入恒温水浴中继续搅拌，直至剩余液体完全蒸发。干燥后的前驱体涂层Ti粉转移到纯Cu坩埚中，在H2/Ar（300:300 mL/min）气体流动下、300°C下热还原120分钟，获得铜镀层钛粉。通过ICP-OES验证最终的铜含量，并对粉末的流动性进行表征。
设计的单元格尺寸为2 × 2 × 2 mm，支柱间距为0.31 mm，通过激光粉末床熔融（LPBF）制备出螺旋面结构的多孔Ti-5Cu支架（?5 × 10 mm）。打印样品经过电抛光去除附着颗粒，用Kroll试剂蚀刻，用乙醇和蒸馏水超声清洗后干燥备用。

2.2. 多孔Ti-5Cu合金支架的表征和机械分析
采用扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和能量分散谱（EDS）分析粉末和多孔Ti-5Cu合金的表面微观结构；使用X射线衍射（XRD）确定相组成。孔隙率通过阿基米德法测量。使用Instron-5569系统在1 mm/min的速率下测试打印支架（φ5 × 10 mm）的压缩性能，以多孔Ti6Al-4V作为对照（每组n = 3个样本）。根据ISO 13314标准，弹性模量定义为应力-应变曲线弹性区域的斜率；平台应力取20%至40%压缩应变区间内应力的算术平均值。压缩屈服强度由应力-应变曲线与平行于准弹性梯度线的交点确定。

2.3. 体外铜离子释放
多孔Ti-5Cu合金圆盘（φ10 × 2 mm）经过电抛光、Kroll试剂蚀刻和超声清洗后进行灭菌。根据ISO 10993-12标准，将样品浸入浓度为0.2 g/mL的模拟体液（SBF, Solarbio）中，在37°C下培养1–28天（每组n = 3个样本）。使用ICP-MS测量每个时间点的铜离子释放量。

2.4. 体外抗菌实验
2.4.1. 平板菌落计数
从北京协和医院微生物实验室获取的金黄色葡萄球菌ATCC 25923和大肠杆菌ATCC 25922菌株，在琼脂板上培养三代。收集菌落，悬浮在生理盐水中，调整浓度至0.5 McFarland（约1.5 × 10^8 CFU/mL），然后用Trypic Soy Broth（TSB, Solarbio）系列稀释至1.5 × 10^4 CFU/mL。Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、Kroll试剂蚀刻和超声清洗后进行灭菌。将它们放置在一个24孔板中，每个孔加入700 μL TSB培养基。然后加入50 μL细菌悬浮液（1.5 × 10^4 CFU/mL），在37°C下共培养24小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS, Solarbio）洗涤去除游离细菌。再清洗样品并超声处理（60 W，20 min）以脱除附着细菌。之后进行细菌悬液系列稀释、涂布并培养24小时，计算抗菌率（R）：
R = (CFU_Ti6Al4V ? CFU_Ti-5Cu) / CFU_Ti6Al4V × 100%
其中R表示抗菌率，CFU表示菌落形成单位。抗菌率R ≥ 99%表示强杀菌活性，R ≥ 90%表示有杀菌作用。

2.4.2. 抗生物膜实验
与平板菌落计数实验相同的材料共培养24小时后，用PBS冲洗样品以去除浮游细菌，空气干燥后固定在99%甲醇中15分钟。再用PBS轻轻洗涤两次并空气干燥，然后用0.1%结晶紫（Beyotime）染色（500 μL，10分钟），洗涤两次后再次空气干燥。用95%乙醇（500 μL）洗脱结合的染料，测量595 nm处的吸光度。

2.4.3. 细菌活力染色
Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、Kroll试剂蚀刻和超声清洗后进行灭菌。金黄色葡萄球菌悬浮液在相同条件下与支架共培养24小时。用L7007细菌活力试剂盒（Thermo Fisher）对支架进行染色，随后用荧光显微镜观察支架表面的细菌荧光。

2.5. 细胞毒性测试
2.5.1. 细胞和细胞培养
从中国科学院细胞库（上海）获取小鼠前成骨细胞MC3T3-E1亚克隆。细胞在α-最小必需培养基（Gibco）中培养，添加10%胎牛血清（Gibco）和1%青霉素/链霉素（Gibco），在37°C和5% CO2条件下培养4代后用于后续实验。

2.5.2. 材料提取物的制备
Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、Kroll试剂蚀刻和超声清洗后进行灭菌。根据ISO 10993-12标准，将支架浸入无血清的α-MEM中，比例为0.2 g/mL（支架质量与培养基体积比），在细胞培养箱中培养3天。之后，将提取物灭菌并添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，制备完整的培养基用于后续实验。

2.5.3. CCK-8测试
MC3T3-E1细胞与不同组别的材料提取物共培养1、3和5天。使用CCK-8试剂盒（Beyotime）测量450 nm波长下的细胞光密度（OD）值。根据以下公式计算相对生长率（RGR）：
RGR = (OD_samples ? OD_blank) / (OD_negative_control ? OD_blank) × 100%
其中OD_samples表示含有细胞、CCK-8溶液和测试材料的孔的吸光度；OD_blank表示含有培养基和CCK-8溶液但无细胞的孔的吸光度；OD_negative_control表示含有细胞和CCK-8溶液但无材料的孔的吸光度。

2.5.4. 活细胞/死细胞染色
MC3T3-E1细胞与不同组别的材料提取物共培养5天。使用Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染色试剂盒（Solarbio）进行染色，观察细胞的活力和形态。

2.6. 细胞粘附性测试
2.6.1. Phalloidin/DAPI
Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、Kroll试剂蚀刻和超声清洗后进行灭菌。将MC3T3-E1细胞接种在支架上培养5天。固定和膜通透化后，用Phalloidin/DAPI染色以观察细胞骨架和细胞核。

2.6.2. SEM
Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、Kroll试剂蚀刻和超声清洗后进行灭菌。将MC3T3-E1细胞接种在支架上培养5天。固定和脱水后，进行金溅射镀膜，用SEM观察细胞形态和在支架表面的扩散情况。

2.7. 细胞成骨性测试
2.7.1. 成骨诱导培养基的制备
按照上述方法制备Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架的材料提取物。为了制备完整的培养基，向提取物中添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素。另外分别制备50 mg/mL的抗坏血酸（Sigma）、1 mM甘油磷酸钠（Sigma）和100 mM地塞米松（TargetMol）。之后，向每1毫升含有提取物的完整培养基中加入10微升甘油磷酸钠、1微升抗坏血酸和1微升地塞米松，以获得成骨诱导培养基，该培养基在4°C下避光保存。2.7.2. 碱性磷酸酶（ALP）染色和定量将含有成骨诱导剂的材料提取物与MC3T3-E1细胞共培养7天和14天。每个细胞样本的一部分使用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒（Beyotime）进行染色。剩余细胞的ALP活性通过BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime）和ALP测定试剂盒（Beyotime）进行评估。2.7.3. 阿利津红S（ARS）染色和半定量将含有成骨诱导剂的材料提取物与MC3T3-E1细胞共培养21天。细胞用阿利津红S（Cyagen）染色，并在显微镜下观察和拍摄矿化结节。加入10%的氯化塞替吡啶（Solarbio）后，测量562纳米处的吸光度以量化矿化程度。2.7.4. ALP和OCN基因及蛋白表达的分析将MC3T3-E1细胞与含有成骨诱导剂的材料共培养7天和14天。我们进行了qRT-PCR来确定ALP和OCN的mRNA表达，并通过Western blotting来评估相应蛋白的水平。用于qPCR的引物列在表1中。表1. 定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）引物。基因名称正向引物序列反向引物序列GAPDHAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTGTAGACCATGTAGTTGAGGTCAAlplCCAACTCTTTTGTGCCAGAGAGGCTACATTGGTGTTGAGCTTTTOCNCAGAACAGACAAGTCCCACACAGTCAGCAGAGTGAGCAGAAAGAT2.8. 体内抗菌实验Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、用Kroll试剂蚀刻、超声波清洗和灭菌。在新西兰白兔的股骨滑车沟中制造了直径5毫米、深度10毫米的骨缺损。随后，将预先浸泡在金黄色葡萄球菌悬浮液（1.5×10^4 CFU/mL）中的Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架植入缺损处。术后监测兔子的体温和体重。分析包括外周血检测、放射学检查、细菌平板计数以及对植入物和周围骨骼的中性粒细胞浸润的病理评估。这项研究得到了北京大学第一医院实验动物中心的批准（伦理批准编号J2024099）。2.9. 体内生物相容性实验Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、用Kroll试剂蚀刻、超声波清洗和灭菌。在SD大鼠背部切开口后，分别植入Ti-5Cu支架或Ti-6Al-4V支架，或者不植入任何支架（空白对照组）。术后监测包括体重测量、外周血分析和植入物周围组织的组织病理学检查。这项研究得到了北京大学第一医院实验动物中心的批准（伦理批准编号J2024099）。2.10. 体内成骨实验Ti-5Cu和Ti-6Al-4V支架经过电抛光、用Kroll试剂蚀刻、超声波清洗和灭菌。在Sprague-Dawley（SD）大鼠的股骨外侧髁上钻出直径3毫米、深度2.5毫米的骨缺损。然后将Ti-5Cu支架或Ti-6Al-4V支架植入缺损处，或者不植入任何支架作为空白对照组。术后使用微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析对缺损部位进行评估。这项研究得到了北京大学第一医院实验动物中心的批准（伦理批准编号J2024099）。3. 统计分析使用SPSS 25.0版本进行统计分析。所有实验数据均以平均值±标准差（SD）表示。对于两组之间的比较，应用t检验；对于涉及多组的比较，使用单因素方差分析（ANOVA）。p值<0.05被认为具有统计显著性。4. 结果4.1. 特性和机械分析铜涂层钛粉具有高球形度（94.66±0.57%）、良好的流动性（40.86±0.51 s/50 g）以及5.13±0.32%的铜含量。Ti-5Cu支架的平均孔径为506±14微米，孔隙率为67.19±0.54%。如图1(a)(b)所示，铜在钛颗粒上均匀涂层。LPBF打印的螺旋结构Ti-5Cu支架（φ5×10毫米）显示出均匀且相互连接的多孔网络（图1(c)–(f)），其微凹结构有利于细胞附着。XRD（图2(a)）确认了α-Ti和Ti2Cu相的存在。如图2(b1–b3)所示，Ti2Cu沉淀物在Ti基体中均匀分布。EDS分析显示由于打印过程中铜的蒸发，Ti和Cu的含量略有减少（图2(b4)）。图2(c)的高倍SEM图像进一步显示，大多数Ti2Cu沉淀物位于α-Ti晶界的边缘，这与图2(d)的明场TEM图像一致。此外，Ti2Cu沉淀物呈颗粒状或杆状，并离散分布在α-Ti晶界上。结合高倍TEM图像和相应的EDS映射（图2(e1和e2)），估计Ti2Cu沉淀物的大小从几十纳米到几百纳米不等。这些观察结果表明，细小且离散的Ti2Cu沉淀物可能通过第二相强化效应增强Ti基体的强度，同时避免过度屈服。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图2. 打印后的Ti–5Cu样品的微观结构特征。(a) XRD图案显示Ti2Cu相的存在，(b1) SEM图像，(b2-b4) 相应的EDS图谱以及(b1)中标出区域的EDS光谱，(c) 高倍SEM图像，以及(d) 明场TEM图像显示Ti基体内Ti2Cu沉淀物的分布特征，(e1) 高倍TEM图像以及(e2) 用于识别Ti2Cu沉淀物粒度的相应EDS映射。如图3所示，所有支架的应力-应变曲线表现出三个典型阶段：弹性变形（应变达到约10%之前的线性增长）、屈服（以不规则的应力波动和快速应变增加为标志）和应变硬化（需要更多应力才能进一步变形）。计算出的机械性能总结在表2中。与多孔Ti-6Al-4V支架相比，多孔Ti-5Cu支架表现出显著更高的屈服强度（p<0.05）、弹性模量（p<0.01）和平台应力（p<0.01）。下载：下载高分辨率图像（338KB）下载：下载全尺寸图像图3. 多孔Ti-5Cu和Ti-6Al-4V合金的应力-应变曲线。表2. Ti-5Cu和Ti-6Al-4V合金的机械性能。支架弹性模量（GPa）屈服强度（MPa）平台应力（MPa）Ti-6Al-4V（螺旋形）6.40±0.28161.67±12.58164.04±12.53Ti-5Cu（螺旋形）8.16±0.52**205.98±20.71**241.67±7.64**与Ti-6Al-4V相比，**p<0.05，****p<0.01，n=3。4.2. 铜离子释放如图4所示，多孔Ti-5Cu支架在SBF中前3天内迅速释放铜离子，从0.1 mg/L增加到0.6 mg/L，之后释放速度减慢但持续释放。下载：下载高分辨率图像（231KB）下载：下载全尺寸图像图4. 3D打印多孔Ti-5Cu支架的体外铜离子释放曲线（n=3）。4.3. 体外抗菌活性图5(a–d)显示了24小时共培养后的细菌菌落和计数。附着在Ti-6Al-4V上的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落数量明显多于附着在Ti-5Cu上的菌落（p<0.01，n=3）。Ti-5Cu对这两种菌株均表现出99%的抗菌活性（R），表明其具有强抗菌作用。此外，两种菌株在Ti-6Al-4V上形成的生物膜量（图5(e和f)明显多于在Ti-5Cu上形成的量（p<0.01，n=3），说明Ti-5Cu也具有强力的抗菌膜抑制作用。活/死细胞染色（图5(g)显示Ti-6Al-4V上主要是活细菌（绿色），而Ti-5Cu上则有许多死细菌（红色）和严重的膜损伤。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图5. 对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌性能。(a, b) 与金黄色葡萄球菌共培养24小时后的菌落形成单位（CFU）计数（n=3，**p<0.01）；(c, d) 与大肠杆菌共培养24小时后的菌落形成单位（CFU）计数（n=3，**p<0.01）；(e,f) 材料抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌形成生物膜的能力；(g) 与金黄色葡萄球菌共培养24小时后的活/死细菌染色。4.4. 细胞毒性如图6(a)所示，CCK-8测定结果显示MC3T3-E1细胞在Ti-5Cu和Ti-6Al-4V提取物中的培养5天后均能增殖，OD值在第5天明显高于阴性对照组（p<0.05，n=3）。相比之下，阳性对照组生长极少（p<0.01，n=3）。两组细胞的相对生长率（RGR）均超过90%，证实了良好的生物相容性。活/死细胞染色（图6(b)显示5天后细胞主要为活细胞（绿色）且死亡细胞较少（红色），进一步支持了多孔Ti-5Cu的生物相容性。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图6. MC3T3-E1细胞的生物相容性和细胞反应。(a) 通过CCK-8测定测量的细胞在材料提取物中培养5天的OD值和相对生长率（RGR）（n=3，*p<0.05，**p<0.01，ns p>0.05）；(b) 细胞在材料提取物中培养5天后的活/死细胞染色；(c) 经过5天培养后，使用phalloidin/DAPI染色观察细胞骨架和细胞核形态；(d) 经过5天培养后，材料表面细胞的SEM观察。4.5. 细胞粘附如图6(c)(d)所示，MC3T3-E1细胞在Ti-5Cu和Ti-6Al-4V上培养5天后均能良好粘附和扩散。细胞呈现典型的纺锤形形态，胞质伸展，肌动蛋白网络组织良好。SEM观察确认两种材料上的细胞生长相似，具有延长的形状和短的延伸部分，表明生物相容性良好。4.6. 体外成骨活性与Ti-6Al-4V相比，Ti-5Cu提取物存在时骨生成分化检测显示出增强的活性。ALP染色和定量（图7(a)(b)，n=3）显示7天和14天时Ti-5Cu的表达显著更高（p<0.01和p<0.05）。21天后，阿利津红S染色（图7(c)(d)，n=3）显示Ti-5Cu中的矿化结节更多（p<0.01）。qRT-PCR（图7(e)(h)，n=3）证明7天和14天时Ti-5Cu中的Alpl和OCN mRNA上调（p<0.01）。Western blot分析确认7天时ALP蛋白水平升高（图7(f)(g)，n=3）（图7(i)(j)，n=3），14天时OCN水平也升高（p<0.01）（图7(i)(j)，n=3）。下载：下载高分辨率图像（995KB）下载：下载全尺寸图像图7. 在成骨条件下培养的MC3T3-E1细胞的成骨分化。(a,b) 7天和14天培养后的碱性磷酸酶（ALP）染色和定量分析（n=3，*p<0.05，**p<0.01）；(c,d) 21天培养后的阿利津红S染色和矿化结节半定量（n=3，**p<0.01）；(e-j) 7天和14天培养后的成骨基因和蛋白表达（n=3，*p<0.05，**p<0.01，ns p>0.05）。(e) 第7天的基因表达；(f,g) 第7天的蛋白表达和定量；(h) 第14天的蛋白表达和定量。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）4.7. 体内抗菌活性图8(a)显示两组动物的体温在第7天达到峰值，但Ti-5Cu组的体温明显较低（p<0.01），且恢复得也更快。体重下降（图8(a)，n=8）在Ti-5Cu组中较轻，最低体重更低（p<0.01）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图8. 使用新西兰白兔感染模型的体内评估。(a) 术后体温、体重和血液学参数（n=8，*p<0.05，**p<0.01）；(b) 术后14天的膝关节X光片（红色箭头指示植入物周围骨吸收）；(c,e) 术后14天在血液琼脂平板上培养24小时后的植入物超声处理液细菌培养和计数（n=8，**p<0.01）；(d,f) 术后14天在血液琼脂平板上培养24小时后的植入物周围组织匀浆的细菌培养和计数（n=8，**p<0.01）；(g) 术后14天植入物周围组织的H&E染色（400倍放大；红色箭头指示中性粒细胞）和中性粒细胞浸润的定量分析（n=8，**p<0.01）。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）血液学标志物（图8(a)，n=8）显示白细胞计数（WBC）在第七天达到峰值，但在Ti-5Cu组第7天和第14天显著较低（p<0.05）。C反应蛋白（CRP）水平在第5天达到峰值，在Ti-5Cu组第3天更低（p<0.05），第5天和第14天的差异更明显（p<0.01）。红细胞沉降率（ESR）在Ti-5Cu组第7天和第14天均较低（p<0.01和p<0.05），procalcitonin（PCT）水平也显著降低（p<0.05）。总体而言，Ti-5Cu组的炎症标志物水平显著较低。14天的X光片（图8(b)显示所有植入物均保持原位。Ti-6Al-4V植入物周围有新月形透射线区域（红色箭头），表明有骨吸收和可能的感染，而Ti-5Cu周围没有这些现象。细菌培养（图8(c–f)显示Ti-6Al-4V的超声处理液和组织匀浆中的金黄色葡萄球菌菌落明显多于Ti-5Cu（p<0.01，n=8）。H&E染色显示，Ti-6Al-4V组周围组织的中性粒细胞浸润严重（红色箭头），而Ti-5Cu组则仅有轻微浸润（p<0.01；n=8）。4.8. 体内生物相容性：所有组（Ti-5Cu、Ti-6Al-4V和空白组）的体重均稳定增加，无显著差异（p>0.05；n=6；图9(a)）。血液学和生化分析（图9(b)，n=6）显示，第3天白细胞数量短暂增加，Ti-5Cu组的白细胞水平低于Ti-6Al-4V组（p<0.05），之后恢复正常。其他参数（红细胞、血小板、ALT、AST和肌酐水平）均保持在正常范围内，组间无显著差异。在第7天、30天和90天进行安乐死时，未观察到皮下积液、发红或感染。植入物被软组织紧密包裹，内部有新生血管形成（图9(c)）。H&E染色显示，植入物周围组织中偶见散在的中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞，无显著浸润或坏死。主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织学检查正常，无病理异常（图9(e)），与空白对照组相当。下载：下载高分辨率图像（2MB）下载：下载全尺寸图像图9. SD大鼠体内的生物相容性评估。(a) 术后体重变化（n=6，p>0.05）；(b) 血液学参数（n=6，*p<0.05）；(c) 植入物周围皮下组织的代表性图像（黑色虚线范围内）；(d) 植入物周围组织的H&E染色（400倍）；红色箭头：中性粒细胞；蓝色箭头：淋巴细胞；绿色箭头：巨噬细胞；黑色箭头：退化或坏死细胞；(e) 术后7天、30天和90天主要器官的H&E染色（400倍）。（有关该图例中对颜色的引用解释，请参阅本文的网络版本。）4.9. 体内成骨活性如图10(a)所示，术后30天和90天，空白组仍存在明显的骨缺损，仅有有限的骨痂形成。术后30天，Ti-6Al-4V组和Ti-5Cu组都在支架内显示出新的骨生长，其中Ti-5Cu组的骨生长明显更多。到90天时，尽管两组植入物都显示出显著的骨填充，但Ti-5Cu组的植入物周围骨更多，残留缺陷更少。从微CT扫描中重建的感兴趣区域（ROI）的3D图像（图10(b)）直观证实，两个时间点Ti-5Cu组的骨形成更多，而空白组仅产生少量新骨。定量分析（图10(c)，n=6）显示，术后30天和90天Ti-6Al-4V组的骨体积分数（BV/TV）低于Ti-5Cu组（p<0.05），但两者均显著高于空白组（p<0.01）。Ti-6Al-4V组的骨小梁数量（Tb.N）在术后30天（p<0.05）和90天（p<0.01）均低于Ti-5Cu组；然而，Ti-6Al-4V组和Ti-5Cu组的骨小梁数量均高于空白组（p<0.01）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图10. SD大鼠股骨髁缺损模型中的骨再生评估。(a) 术后30天和90天的股骨髁微CT扫描（手术区域用白色虚线标出）；(b) 缺损区域新骨形成的3D重建；(c) 缺损区域骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）的定量分析（n=6，*p<0.05，***p<0.01）；(d) 术后30天和90天缺损区域的H&E染色和Masson染色（红色箭头表示新骨形成）。（关于该图例中对颜色的引用解释，请参阅本文的网络版本。）组织学切片（HE和Masson染色，图10(d)）显示，术后30天空白缺损主要由纤维组织和骨髓细胞填充，几乎没有骨形成。相比之下，两种材料组都显示出骨向孔隙内的生长（红色箭头）——在HE染色中呈现粉红色的骨小梁结构，在Masson染色中呈现蓝色——表明活跃的成骨作用。与Ti-6Al-4V组相比，Ti-5Cu组的骨覆盖范围更广。术后90天，空白缺损仍为纤维组织，骨含量较少，而植入物组的骨小梁更厚、更多，Ti-5Cu组再次显示出更大的骨覆盖范围。5. 讨论5.1. 材料特性铜和金属间化合物Ti2Cu的分布对多孔Ti-5Cu合金的机械性能、离子释放行为和抗菌性能起着关键作用。合金元素分布不均匀通常会导致机械和抗菌性能下降。正如Chen等人[29]所报道的，Ag在Ti-Ag合金中的聚集不仅降低了机械性能，还导致Ti2Ag相粗大且分布不均，从而减少了细菌接触的有效表面积，进而减弱了抗菌活性。类似地，Huang等人[30]通过机械混合和选择性激光熔化制备了Ti6Al4V-3Cu，但他们报告称Cu分布不均匀导致局部Cu富集或不足，从而影响了材料的机械和生物性能。在本研究中，使用溶胶-凝胶法制备的均匀镀铜钛粉显著提高了成分均匀性。这种方法最小化了成分偏差，确保了打印后的Ti2Cu相的细小且均匀的分布。该粉末具有优异的球形度和流动性，支持高质量的可加工性。体外离子释放试验进一步显示，前3天内释放迅速，随后进入持续释放阶段，表明其具有良好的生物性能。与多孔Ti6Al4V相比，多孔Ti-5Cu合金具有更高的屈服强度和弹性模量，表明其具有更好的承载能力和刚度调节能力。应力-应变响应表现出弹性变形、屈服和强化阶段，而没有灾难性失效，这对其临床应用具有关键优势。这种行为归因于优化的模量和扭球形结构，后者可以减轻应力集中[20]并提高刚度[22]。相比之下，Sun等人[31]报告称，孔隙率为75%的Ti6Al4V-6Cu支架在约275 MPa时发生坍塌，而Yang等人[32]报告称其他改性多孔钛合金在10%应变下发生脆性断裂。传统固体植入物的弹性模量较高（约114 GPa）[33]，限制了其与骨的匹配能力。多孔结构会降低模量和强度，但过度降低在临床上是不希望的。例如，Xu等人[34]报告74%孔隙率的CP-Ti的压力为176.96 MPa和7.84 GPa，Liu等人[35]报告75%孔隙率的Ti24Nb4Zr8Sn的压力为38 MPa和1.44 GPa。本研究中的Ti-5Cu支架提供了最佳的平衡，其模量接近骨的模量，并显著增强了强度，表明其在骨缺损修复方面具有巨大潜力。5.2. 抗菌活性Ti-Cu合金的抗菌性能主要归因于铜离子的释放和Ti2Cu相的沉淀[36],[37],[38]。当前共识认为，铜通过多种途径发挥抗菌作用[39,40]：它导致细菌膜去极化，从而导致泄漏或破裂，并促进细胞内活性氧（ROS）的生成，造成氧化损伤和DNA降解；Ti2Cu相的沉淀则在直接表面暴露时迅速“接触杀灭”细菌——在干燥条件下几分钟内，在潮湿环境中几小时内。虽然具体机制可能因细菌形态、湿度和培养基成分而异，但关键过程包括膜破坏、ROS积累和呼吸抑制。值得注意的是，有效的抗菌作用需要一定浓度的铜离子。Liu等人[38]报告称，释放的Cu2+浓度在0.69至0.83 mg/L之间时具有显著且一致的抗菌活性，而其他研究则建议有效范围为0.3–1.75 mg/L[41]。相比之下，Ti2Cu相通过接触介导的机制直接起作用。在本研究中，使用了金黄色葡萄球菌（一种革兰氏阳性细菌）和大肠杆菌（一种革兰氏阴性细菌）——这两种细菌在假体修复中很常见[7]——来评估抗菌性能。共培养24小时后，Ti-5Cu组的抗菌活性为99%，明显优于Ti-6Al-4V组，同时还表现出强大的抗生物膜活性。活/死染色显示，Ti-5Cu组在近红外光下有广泛的红色荧光（死亡细菌）。尽管24小时内的Cu2+释放水平（0.1 mg/L）低于报告的抗菌阈值，但明显的抗菌效果表明Ti2Cu相起主导作用，这与Zhang等人的研究结果一致[37]。然而，铜的具体抗菌机制仍需进一步阐明。为了进行体内评估，在新西兰兔的股骨滑车中建立了感染性骨缺损模型，以模拟临床修复情况。与Ti-6Al-4V组相比，Ti-5Cu组表现出更好的感染控制，表现为体温峰值较低、恢复更快、体重下降较轻以及体重低谷更高。炎症标志物（如白细胞、CRP、PCT）在Ti-5Cu组中也增加较少，并且更早恢复到基线水平，尽管两组中的ESR仍然升高，这与它的缓慢反应动力学一致[42]。这些系统结果证实了Ti-5Cu在体内的抗菌性能得到增强。虽然像白细胞、CRP和ESR这样的生物标志物用于评估假体周围关节感染（PJI），但它们的特异性较低，尤其是在抗生素治疗或低毒力感染的情况下[43,44]。尽管较新的标志物如PCT、IL-6、TNF-α和IFN-γ具有更好的敏感性，但它们仍然缺乏足够的特异性。放射学评估显示，Ti-6Al-4V植入物周围有明显的骨溶解吸收，而Ti-5Cu植入物仅显示轻微吸收，表明感染程度较低。微生物培养进一步证实，Ti-5Cu组的超声波处理液和组织匀浆中的金黄色葡萄球菌菌落数量显著减少。组织学分析显示，Ti-5Cu植入物周围的中性粒细胞浸润明显减少，支持其在减轻局部感染方面的有效性，尽管这些评估的敏感性（43%–100%）和特异性（81%–98%）存在差异[45]。总之，Ti-5Cu合金在体外和体内都表现出强烈的抗菌性能，使其成为降低骨科植入物感染风险的有希望的候选材料。5.3. 生物相容性铜是人类必不可少的微量元素；它参与铁的吸收、胆固醇和葡萄糖的代谢以及红细胞生成，并在蛋白质和酶的合成和释放中起关键作用。尽管铜离子可以穿过细胞膜并影响增殖和生理功能，但过量摄入可能导致胃肠道症状甚至组织损伤或疾病[38]。作为生物医学材料，钛合金必须满足基本的生物相容性要求。根据ISO 10993-5标准，相对生长率（RGR）超过75%表示没有细胞毒性。在本研究中，Ti-5Cu组、Ti-6Al-4V组和阴性对照组的MC3T3-E1细胞均强烈增殖，RGR值均超过90%。活/死染色显示Ti-5Cu组主要为绿色荧光，红色荧光很少。Phalloidin/DAPI染色和SEM进一步证实，细胞在Ti-5Cu支架上附着良好并正常扩散，不仅没有细胞毒性，还支持细胞粘附和生长。铜离子释放被认为是潜在细胞毒性的主要因素，其效应取决于浓度，并因细胞类型而异。Cao等人[46]报告L929小鼠成纤维细胞的LD50约为46 mg/L，在24小时后细胞死亡率为99%。Singh等人[47]报告外周血单核细胞的LD50为18.4 mg/L。在本研究中，Ti-5Cu在1–28天内释放的铜离子浓度在0.1至0.8 mg/L之间，远低于这些毒性阈值，这可能解释了MC3T3-E1细胞观察到的良好生物相容性。在体内，所有植入物均未引起过敏或排斥反应。有毒重金属通常会被全身吸收，在肝脏中代谢，并通过肾脏排泄，它们经常在器官中积累，导致慢性毒性，可能引起水肿、坏死或纤维化[48]。监测血液学和生化参数以评估全身效应。值得注意的是，Ti-5Cu组术后第3天的白细胞计数较低，表明可能具有抗炎作用。其他血液参数在各组中均保持在正常范围内。组织病理学检查显示，7天、30天和90天时，植入物周围组织中没有急性或慢性炎症细胞浸润，主要器官也未出现病理变化。这些结果证实了Ti-5Cu植入物在短期和长期使用中的良好生物相容性和安全性，没有明显的急性或慢性不良反应。5.4. 成骨活性许多研究表明，铜通过多种机制促进成骨作用，包括促进成骨细胞功能、抑制成骨细胞凋亡、抑制成骨前体细胞增殖以及促进成骨分化和矿化[49,50]。与这些报告一致，本研究中的Ti-5Cu组表现出更高的碱性磷酸酶（ALP）活性，矿化结节形成增加，以及ALP和骨钙素（OCN）在基因和蛋白质水平上的显著上调。ALP和OCN分别是早期和后期的成骨标志物[51]；这些结果证实了Ti-5Cu在整个骨骼形成过程中的促骨能力。理想的骨替代材料应能在骨骼生长和重塑过程中保持结构完整性[52]。植入后30天和90天的放射学和组织学评估显示，Ti-5Cu支架的外围和孔隙中的骨生长明显优于Ti-6Al-4V支架，而空白组则显示出较差的愈合情况。3D打印的Ti-5Cu支架的结构稳定性——这归因于铜添加带来的增强压缩强度以及螺状结构的应力分布特性[20,22]——支持了其促骨性能。孔径是影响成骨、细胞迁移和营养运输的关键参数[53,54]。研究表明，孔径约为500微米的结构比孔径较大的结构（700-1000微米）更有利于成骨活动，最佳范围在300至600微米之间[55]。孔隙率还深刻影响血管生成、细胞迁移和代谢交换。天然松质骨的孔隙率在50%到90%之间[56]。本研究开发的Ti-5Cu支架具有506±14微米的孔径和67.19±0.54%的孔隙率，这些参数均在推荐范围内（≥50%-65%[57,58]），并且符合FDA认可的钛植入物孔隙率标准（30%-70%[56]）。这些结构特性，加上螺状架构，为骨骼再生提供了有利的机械和生物学微环境。除了结构优势外，Ti-5Cu释放的铜离子进一步增强了其促骨效果。铜在骨免疫调节中的作用似乎是双重且依赖于浓度的。多项研究报告称，铜离子通过调节炎症反应来促进成骨——例如，通过增强IL-10和抑制IL-1β[59]或抑制TNF-α[60]。Huang等人[61]提出，从微纳米结构生物陶瓷释放的铜会促使巨噬细胞向促炎M1表型极化，从而可能促进成骨。相反，其他研究指出，高浓度的铜会诱导氧化应激并抑制TGF-β1/Smad3通路，导致成骨标志物（ALP、OCN和Col1）下调以及炎症细胞因子（IL-1、TNF-α和IL-6）的表达增加，最终损害成骨细胞功能[62]。总之，低浓度的铜离子具有有益的促骨效果，而高浓度则会导致细胞毒性并抑制骨骼形成。这种双重作用强调了在设计含铜钛合金时严格控制铜离子释放的重要性，以结合抗菌和促骨应用。

尽管如此，本研究仍存在一些局限性。首先，我们没有评估Ti-5Cu的长期性能，如持续的离子释放、机械稳定性或长期的抗菌效果。其次，不同铜离子浓度对抗菌活性和成骨作用的影响尚未探讨。最后，虽然我们评估了该合金在SD大鼠和新西兰白兔中的表现，但这些发现是否适用于其他动物种类尚不清楚。因此，未来的研究应调查Ti-5Cu的长期行为，例如浸泡3个月或6个月后的铜离子释放曲线和机械性能，以及相应的抗菌和成骨效果。此外，应建立不同的动物模型以提供其潜在应用的更多临床证据。我们还计划将其他抗菌和促骨成分加入粉末中，或与生物活性因子结合，通过增材制造方法制备多孔支架，从而进一步提高支架的整体性能。

结论：使用均匀涂覆铜的钛粉通过增材制造方法制备了具有螺状结构的Ti-5Cu支架。该支架具有优化的孔径特性、机械强度和持续的铜离子释放，表现出对金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）的优异抗菌效果，增强了成骨活性，并具有高生物相容性。这些特性使其成为骨科植入物的一个有希望的候选材料。

作者贡献声明：
- Hongbin Wang：方法学、初稿撰写、审阅与编辑
- Hao Wang：数据管理、方法学
- Shuxin Wang：方法学
- Liping Pan：数据管理
- Qiwei Wang：数据管理
- Guanghua Liang：方法学
- Shuilin Wu：审阅与编辑
- Talante Juma：资金获取
- Shaofu Li：方法学、审阅与编辑
- Yongping Cao：概念规划、资金获取、审阅与编辑

资助：
- Talante Juma：获得了北京自然科学基金（项目编号7254434）和中央高水平医院建设项目（项目编号2025CX08）的财政支持。
- Yongping Cao：获得了北京自然科学基金（项目编号L242040）的财政支持。