《Microchemical Journal》：An integrated one-pot CHA–CRISPR biosensor enabled by tFNA-based reaction confinement for miRNA-21 detection and cell-cycle-associated imaging
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王一鹏|姜萌|贾立冬|徐可佳|王静怡|颜文|金燕|郝冉|胡杰|袁虎芳|牛凌梅河北省医科大学公共卫生学院，石家庄 050017，中国摘要微小RNA-21（miRNA-21）是乳腺癌诊断和预后的重要生物标志物，但由于需要多步骤的操作流程、扩增动力学较慢以及探针稳定性有限，其超灵敏检测
王一鹏|姜萌|贾立冬|徐可佳|王静怡|颜文|金燕|郝冉|胡杰|袁虎芳|牛凌梅
河北省医科大学公共卫生学院，石家庄 050017，中国
摘要
微小RNA-21（miRNA-21）是乳腺癌诊断和预后的重要生物标志物，但由于需要多步骤的操作流程、扩增动力学较慢以及探针稳定性有限，其超灵敏检测和细胞内分析仍然具有挑战性。本文报道了一个集成的单锅生物传感平台，该平台结合了催化发夹组装（CHA）和CRISPR/Cas12a扩增技术，并使用四面体框架核酸（tFNA）作为刚性纳米级支架。
tFNA支架能够对CHA反应物和CRISPR底物进行空间组织，从而在简化的单锅操作条件下实现高效的级联信号放大。在优化条件下，该平台能够检测到0.5 pM至100 nM范围内的miRNA-21，检测限为36 fM（信噪比 = 3），并且与传统两步策略相比，反应时间缩短了40%以上。得益于tFNA良好的膜通透性和抗核酸酶能力，该生物传感器还能够在活细胞中实现对miRNA-21的荧光成像。使用同步的MDA-MB-231乳腺癌细胞，成功可视化了与不同细胞周期状态（G0/G1、S和G2/M）相关的miRNA-21表达。
这种结构整合的CHA–CRISPR生物传感策略降低了操作复杂性，提高了分析的稳健性，为miRNA检测和基于细胞的分析应用提供了可靠的工具。
引言
微小RNA（miRNAs）是长度为21–24个核苷酸的短内源性非编码RNA，它们调节转录后基因表达，在细胞增殖、分化和凋亡中发挥着重要作用[1]、[2]、[3]。由于miRNAs在组织和生物流体中的高稳定性和疾病特异性，它们已成为癌症诊断、治疗分层和预后预测的重要生物标志物[4]、[5]。例如，循环let-7b-5p和miRNA-210-3p已被确定为非侵入性的乳腺癌生物标志物[6]，而miRNA-9和miRNA-34a的差异表达可以区分恶性组织和健康组织[7]。其中，miRNA-21是最广泛研究的致癌miRNAs之一，它通过靶向肿瘤抑制基因促进乳腺癌的发作、进展和转移[8]、[9]。然而，其内源性丰度极低（通常为fM–pM），且存在核酸酶和复杂的细胞内干扰物，这使得准确、高灵敏度和稳定的检测尤为具有挑战性。这些限制了传统分析方法在动态生物学条件下监测miRNA-21表达变化的能力，凸显了需要能够实现高灵敏度、操作简单性和可靠细胞内性能的稳健生物传感平台的需求。
为了解决这些挑战，基于CRISPR的分子诊断技术因其可编程性、等温反应条件、简单的设计要求以及出色的检测特异性而成为miRNA-21分析的强大工具[10]。CRISPR诊断平台不断发展[11]、[12]，其强大的分子识别能力使得能够动态监测活细胞中的遗传过程[13]、[14]、[15]。在各种CRISPR系统中，CRISPR/Cas12a特别适用于生物传感应用，因为它只需要一个短的crRNA（约40个核苷酸），具有稳健的切割活性，并且在生理温度下高效运行[16]、[17]。尽管有这些优势，基于Cas12a的检测仍严重依赖于上游目标扩增以达到足够的灵敏度。常见的扩增策略包括重组酶聚合酶扩增（RPA）[18]、环介导的等温扩增（LAMP）[19]和滚环扩增（RCA）[20]，但这些方法引入了多步骤的操作流程，并增加了与酶不稳定性、操作错误和样品污染相关的风险[21]、[22]。催化发夹组装（CHA）是一种无酶的等温扩增方法，提供了一个有吸引力的替代方案。通过目标循环驱动的发夹杂交，CHA可以在不需要外源酶的情况下生成大量的双链DNA（dsDNA）激活剂，使其成为基于CRISPR的传感技术的有力工具[23]、[24]。
然而，CHA和CRISPR/Cas12a的传统整合面临三大挑战。首先，大多数现有系统采用“CHA预扩增→CRISPR切割”的顺序流程，这使操作过程复杂化，延长了反应时间，并增加了酶失活和样品污染的风险[25]。例如，在室温下2小时后，Cas12a的活性可能下降约30%，使得多步骤检测方法在大规模应用中不太可靠。其次，CHA的固有动力学较慢，因为发夹杂交依赖于溶液中的随机扩散；解离的发夹结构由于碰撞概率低而导致的反应时间延长超过1小时[26]、[27]、[28]，限制了实时检测性能。第三，细胞内报告探针的稳定性往往不足。传统的自由探针缺乏结构刚性，容易被核酸酶降解，导致读数不稳定和假阳性率较高。它们的血清半衰期通常低于6小时，因此不适合用于活细胞成像[29]、[30]。这些限制突显了需要一个能够加速扩增动力学、增强探针稳定性和支持单锅操作的集成生物传感框架的必要性。
为了克服这些挑战，我们引入了四面体框架核酸（tFNA）作为工程化生物传感架构中的多功能纳米载体。tFNA是一种由四个单链DNA分子自组装而成的刚性三维（3D）DNA纳米结构，顶点间距约为3.6纳米[31]、[32]。这种结构提供了出色的机械刚性和抗核酸酶能力，使细胞内存活时间超过12小时，使其成为构建生物传感器的理想支架。此外，tFNA表现出卓越的无载体细胞摄取效率[33]、[34]、[35]，其四个顶点可以精确地与核酸探针功能化。将发夹探针（H1和H2）固定在tFNA上会产生空间限制效应，使其局部有效浓度增加800倍以上，从而显著加速杂交动力学并提高Cas12a的激活效率[36]、[37]、[38]、[39]。这种受限的纳米结构还能稳定报告基因链，减少复杂细胞环境中的假阳性信号。
值得注意的是，虽然已有报道在溶液相检测中利用tFNA加速CHA，但尚未实现在真实单锅格式中将这种受限的CHA系统与CRISPR/Cas12a集成用于活细胞成像。关键障碍包括CHA和Cas12a在单锅条件下的动力学不匹配，以及缺乏用于细胞内级联传递的抗核酸酶支架。我们的工作通过（i）使用tFNA将CHA加速到Cas12a的稳定时间内，实现一步添加；（ii）利用tFNA的天然细胞摄取和抗核酸酶能力进行长时间活细胞成像；以及（iii）实现细胞周期分辨的miRNA分析（这是传统两步或依赖酶的扩增策略无法实现的）来克服这些障碍。
利用这些优势，我们通过在tFNA支架上修改H1、H2和荧光团/淬灭剂标记的报告基因链，设计了结构-功能-集成的生物传感平台，并将其与CRISPR/Cas12a集成在统一的单锅格式中。在miRNA-21存在的情况下，CHA在tFNA表面附近启动，生成含有PAM的双链DNA（dsDNA），激活Cas12a切割以产生荧光信号；而在目标不存在的情况下则不产生信号。综上所述，上述设计特点赋予了本文描述的独特分析能力。总体而言，这项工作推进了基于核酸纳米材料的生物传感技术，并为以miRNA为中心的乳腺癌诊断和转化应用提供了稳健的平台。
章节摘录
反应机制
CHA–CRISPR/Cas12a–tFNA（Cc-tFNA）探针是通过在95°C下退火四种单链DNA（ssDNAs）来形成tFNA结构制备的。然后，发夹DNA（H1和H2）在室温下与tFNA自组装，生成Cc-tFNA探针。tFNA的每个顶点携带两个发夹DNA和两个分别标记有荧光团和淬灭剂的单链DNA。在初始状态下，由于FAM荧光团和BHQ2淬灭剂相邻，荧光被淬灭。
结论
在这项研究中，我们开发了一个多功能生物传感平台，该平台将催化发夹组装（CHA）与CRISPR/Cas12a结合在四面体框架核酸（tFNA）支架上，实现了miRNA-21的超灵敏体外检测和动态细胞内成像。在优化条件下，该平台显示出从0.5 pM到100 nM的宽线性检测范围，检测限为36 fM（信噪比 = 3）。
CRediT作者贡献声明
王一鹏：撰写——原始稿件、软件、方法学、数据整理、概念构思。姜萌：方法学、研究、数据整理。贾立冬：正式分析、数据整理。徐可佳：正式分析、数据整理。王静怡：正式分析、数据整理。颜文：正式分析、数据整理。金燕：方法学、数据整理。郝冉：方法学、数据整理。胡杰：监督、方法学。袁虎芳：监督、软件、数据整理。牛凌梅：
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82073601）和河北省自然科学基金（编号：H2024206344）的支持。
