原位杂交链式反应显色mRNA检测的方法学框架

《Histochemistry and Cell Biology》：Methodological framework for chromogenic mRNA detection using in situ hybridization chain reaction

　　

摘要 原位杂交链式反应（HCR）是一种使用自组装发夹DNA对实现单分子信使RNA（mRNA）可视化的高灵敏度方法。然而，常规的原位HCR主要针对荧光检测进行优化，这限制了其在常规病理学以及具有强自发荧光的组织中的应用。在本研究中，研究人员建立了一种使用短发夹DNA的显色原位HCR方案，其灵敏度可与荧光原位HCR相媲美。为实现高效扩增并避免空间位阻，研究人员采用了一种间接标记策略，即通过酶联链霉亲和素或抗体检测与半抗原（生物素、地高辛或荧光素）偶联的发夹DNA。研究人员在多种小鼠组织（包括脑、肾、肝）以及玻片贴片和自由漂浮切片上验证了该方法。该方案能够清晰可视化低丰度转录本，如和。此外，研究人员通过执行针对两个mRNA靶标的双重复合显色染色，以及将原位HCR与免疫组织化学结合以同时可视化mRNA和蛋白质，证明了该方法的多样性。这种显色原位HCR保留了HCR的高灵敏度，并增加了明场检测的实用优势，从而扩展了原位HCR在组织学研究中的效用。

研究背景与问题

在生物医学研究中，精确可视化信使RNA（mRNA）在组织中的空间定位对于理解基因表达、细胞功能和疾病机制至关重要。原位杂交（ISH）是达成此目标的主要技术。然而，常规ISH方法在检测低丰度mRNA时存在灵敏度不足的挑战。为了增强信号，多种信号扩增技术被开发出来，包括杂交链式反应（HCR）、滚环扩增（RCA）和分支DNA技术。其中，原位HCR因其高灵敏度、简单的工作流程和成本效益而具有显著优势。它通过发夹DNA的自催化级联杂交，在目标mRNA上形成长双链DNA聚合物，从而实现信号放大。

尽管优势明显，但传统原位HCR主要针对荧光检测进行优化，这在实际应用中面临若干限制。首先，荧光检测依赖于复杂且昂贵的成像设备，不适用于常规病理学检查。其次，生物样本（尤其是某些固定组织）常存在自发荧光，这会严重干扰目标信号的清晰度，导致信噪比降低。此外，荧光染料存在光漂白问题，不利于样本的长期保存和观察。因此，开发一种基于HCR高灵敏度原理，但能适应常规明场显微镜观察的显色检测方法，对于扩展该技术在组织学（特别是临床病理和自身荧光强的组织）中的应用具有迫切需求。

研究目的与意义

本研究旨在建立并验证一种高灵敏度的显色原位HCR方案，以克服荧光原位HCR的上述局限性。核心目标是开发一种使用短发夹DNA和间接标记策略的方法，使其灵敏度达到与荧光版本相当的水平，并能在多种组织类型和切片制备方式中可靠地检测低丰度mRNA。此项研究若成功，将显著提升原位HCR的实用性和普及性，使其能够更广泛地应用于不需要荧光成像设备或受自身荧光困扰的研究场景，如常规病理诊断、教学以及资源有限实验室的基因表达分析。本研究最终成果以方法学论文形式发表在《Histochemistry and Cell Biology》期刊上。

关键技术方法概述

研究人员设计并实施了一套系统的实验方案来建立和验证显色原位HCR。研究使用C57BL/6J小鼠的多种组织（脑、胃、肝、肾、睾丸）作为样本。首先，针对不同靶基因mRNA（如、、、等），设计具有分裂引发序列的DNA探针，并使用BLASTn进行同源性搜索以最小化脱靶风险。关键步骤包括：1) 探针设计与标记：合成短发夹DNA，并通过化学方法在其5‘端连接半抗原分子（生物素、地高辛、荧光素）。2) 组织处理与杂交：对冻存组织进行切片（自由漂浮或贴片），经过预处理后，与特异性探针在严格条件下杂交过夜。3) HCR信号扩增：将杂交后的切片与经热变性的半抗原标记发夹DNA共孵育，触发HCR反应，在目标mRNA位点累积大量半抗原。4) 显色检测：通过免疫组织化学方法检测累积的半抗原，即使用酶（过氧化物酶POD或碱性磷酸酶AP）标记的链霉亲和素（针对生物素）或特异性抗体（针对地高辛或荧光素）进行结合，随后加入相应的酶底物（如DAB、Vector Red、BCIP/NBT）产生不溶性的有色沉淀，从而实现明场显微镜下的可视化。此外，研究还进行了多重染色（双靶标mRNA）以及原位HCR与免疫组化（IHC）的联合检测，以验证方法的兼容性和多功能性。

研究结果

1. 单重复合显色HCR染色

研究人员首先验证了显色HCR方案的可行性。他们测试了不同的半抗原（生物素、地高辛、荧光素）与检测酶（POD、AP）组合在检测小鼠脑组织 mRNA时的表现。结果表明，所有组合均能成功检测到 mRNA，其特异性表达于纹状体等脑区，与荧光HCR及文献报道一致。对照实验（无发夹DNA、无探针、使用不配对探针、RNase预处理）均未产生特异性信号，证实了染色特异性。在灵敏度比较中，生物素-链霉亲和素组合产生的信号最强，信噪比最高。地高辛和荧光素组合效果相当，但略逊于生物素组合。

随后，研究人员应用该方案检测了多个低丰度mRNA靶标。例如，在脑组织中，成功可视化了 mRNA在CA3区、外侧隔核等多个脑区的特异性表达颗粒，并且染色结果与荧光HCR在斑点计数/细胞上无显著差异。定量分析显示，产后母鼠内侧视前区的阳性细胞数和斑点数显著高于未交配雌鼠，表明该方法具有高定量性能。类似地， mRNA也在齿状回等脑区被清晰检测，其表达模式与已知分布一致。

研究人员还在贴片组织切片（如胃平滑肌、附睾管）中验证了该方案。成功检测到 mRNA在胃平滑肌特定细胞中的表达，以及 mRNA在附睾管上皮细胞中的弱表达。与对应荧光染色的比较显示，显色HCR能达到相似的颗粒密度和细胞形态分辨率，证明其灵敏度与荧光方法相当。

2. 双重复合显色HCR染色

为评估同时可视化两个mRNA靶标的能力，研究人员进行了双重复合显色HCR。在小鼠脑中，成功实现了（AP/VectorRed，红色）与（POD/DAB，棕色）或（POD/DAB，棕色）的同时检测。信号在各自预期脑区清晰可辨，且强度与单染相当。在肝脏中，利用生物素/POD-DAB（，棕色）和地高辛/AP-BCIP/NBT（，蓝紫色）的组合，成功显示了从门静脉到中央静脉区域的基因表达梯度，与已知分布和荧光结果一致。在肾脏中，由于存在内源性生物素背景，研究人员改用荧光素/AP和地高辛/POD系统，成功区分了近端小管标记物和远端小管标记物的互斥表达模式。研究也对比了不同AP底物（VectorRed和BCIP/NBT）的染色特性，前者产生颗粒状信号，后者产生弥散性胞质染色。

3. 原位HCR与免疫组织化学联合染色

最后，研究人员展示了将显色原位HCR与免疫组化（IHC）相结合，以同时检测mRNA和蛋白。在小鼠下丘脑中，利用生物素/POD-DAB系统检测 mRNA（棕色颗粒），随后用POD-VIP底物（紫色）检测其编码蛋白ERα的核免疫反应性。结果显示，在弓状核、腹内侧下丘脑腹外侧部等脑区， mRNA和ERα蛋白共定位，但单个细胞内mRNA斑点数量与蛋白免疫反应强度并不总是严格正相关。显色联合染色的灵敏度与荧光联合染色相当，证实了该方法在综合分子分析中的有效性。

讨论与结论

本研究成功建立并全面验证了一种基于短发夹DNA和间接标记策略的显色原位HCR方案。该方法的核心优势在于，它在保留HCR固有高灵敏度和单分子检测潜力的同时，成功适配了明场显微镜检测系统。

研究结论翻译：

这种显色原位HCR保留了HCR的高灵敏度，并增加了明场检测的实用优势，从而扩展了原位HCR在组织学研究中的效用。

在讨论中，研究人员比较了该显色HCR方案与主流商业平台（如RNAscope）的优劣。本方案的优点包括：1) 工作流程更简单：本研究条件下无需蛋白酶K消化，而RNAscope通常需要。2) 成本显著降低：试剂成本估算不到RNAscope的十分之一。3) 设备要求低：仅需标准实验室设备，无需专用仪器。4) 探针设计灵活：可针对任意已知序列设计探针。其局限性主要在于多重检测能力受限，明场下通常只能可靠区分两种颜色，且需要针对不同组织优化抗体/链霉亲和素检测条件。

研究人员指出，由于荧光和显色HCR共享相同的杂交与扩增机制，且荧光HCR已成功应用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织，因此预计本显色协议可直接扩展至FFPE样本，这为其在临床病理学中的应用奠定了良好基础。总之，该显色原位HCR方法为研究人员提供了一种高灵敏度、低成本、易于使用且与免疫染色兼容的mRNA可视化工具，尤其适用于常规病理学、自身荧光强的组织以及资源有限的研究环境，有效拓展了原位杂交技术的应用边界。