疫苗开发领域的进展：基于反向疫苗学技术的多表位免疫优势肽疫苗的全面设计——用于治疗凯亚苏努森林病

《The Open Biotechnology Journal》：Advancements in Vaccine Development: A Comprehensive Design of a Multi-Epitopic Immunodominant Peptide Vaccine Targeting Kyasanur Forest Disease via Reverse Vaccinology

　　萨拉伊卡·巴巴鲁拉詹·皮莱（Sarika Baburajan Pillai）、阿克沙伊·杰亚昌德兰（Akshay Jeyachandran）、纳西拉·卡南托迪·帕里亚普拉特（Naseera Kannanthodi Pariyapurath）、苏米塔·贾加迪巴布（Sumitha Jagadibabu）、帕拉马斯伊万·拉贾亚（Paramasivan Rajaiah）、拉朱·苏比亚（Raju Subbiah）、希瓦南达帕·库卡拉尔·钱纳帕（Shivanandappa Kukkaler Channappa）、拉胡尔·甘地·帕查穆图（Rahul Gandhi Pachamuthu）、阿南达·阿罗纳·普雷姆库马尔（Ananda Arona Premkumar）、塞尔瓦拉杰·贾加纳坦（Selvaraj Jagannathan）
印度塔米尔纳德邦尼尔吉里斯地区库努尔（Coonoor）巴斯德研究所（Pasteur Institute of India）生物技术系

**引言/目标**
基亚苏努尔森林病（Kyasanur Forest Disease, KFD）是由基亚苏努尔森林病病毒（Kyasanur Forest Disease Virus, KFDV）引起的蜱传出血热，主要发生在印度南部，并逐渐扩散到邻近地区。目前使用的福尔马林灭活鸡胚成纤维细胞（Chick Embryo Fibroblast, CEF）疫苗仅提供短期保护，需要多次接种且覆盖范围有限。本研究采用先进的免疫信息学和反向疫苗学方法，设计了一种安全、易于接种的疫苗，该疫苗针对KFDV的免疫优势E蛋白，能够预防寒战、发热和头痛等症状。

**方法**
从NCBI中检索了10株KFDV菌株（1962–2016年），并对它们的抗原性进行了筛查。使用IEDB、NetMHCpan和ABCPred工具筛选了选定菌株的E蛋白序列中的CTL、HTL和B细胞表位。预测的表位在所有候选菌株中进行了抗原性、致敏性、毒性和免疫原性的评估。将潜在表位与合适的连接子结合，构建了PKFDVac-I疫苗。通过Expasy ProtParam、PSIPRED、AlphaFold分子对接、TLR-4分子动力学模拟以及C-ImmSim免疫模拟等方法，评估了该疫苗的理化性质、结构稳定性和免疫原性潜力。

**结果**
共有16个表位（5个CTL表位、3个HTL表位和8个B细胞表位）通过了所有筛选标准，并被纳入PKFDVac-I疫苗中，该疫苗由279个氨基酸组成，分子量为29.16 kDa。实验表明，该疫苗具有高抗原性、非毒性、非致敏性、良好的溶解性和稳定性。分子对接结果显示其与TLR-4的结合亲和力为-1150.78 kcal/mol（Piper能量），并得到了387个非键合相互作用的支撑。100纳秒的分子动力学模拟验证了疫苗复合物的稳定性。免疫模拟预测其能够引发强烈的体液和细胞免疫反应，产生高水平的抗体，并促进记忆细胞的长期存活及显著的IFN-γ分泌。

**讨论**
PKFDVac-I在计算机模拟中表现出良好的免疫学特性。所选表位具有抗原性、安全性，并对1962年至2016年间印度的KFDV菌株均具有免疫原性，体现了其对不同菌株的广泛适应性。分子对接和模拟结果显示受体之间的相互作用稳定，免疫模拟预测该疫苗能诱导持久的适应性免疫反应。

**结论**
PKFDVac-I是一种针对基亚苏努尔森林病的多表位肽疫苗候选苗。将多种表位整合到一个统一的疫苗原型中，为定制合成和应用提供了有前景的方向。这一设计标志着KFD疫苗技术的重要进展，需进一步进行体外和体内验证。

**1. 引言**
基亚苏努尔森林病是一种由节肢动物（尤其是蜱虫）传播的虫媒病毒性疾病，会导致发热和出血。病毒性疾病是全球发病和死亡的重要原因，其中许多具有动物源性，最初在动物宿主体内感染后跨越物种屏障感染人类[1]。该病毒最初在印度卡纳塔克邦（1957年）被发现[3]。感染后3–8天会出现寒战、发热和头痛等症状，随后可能出现剧烈肌肉疼痛、呕吐、胃肠道紊乱和出血并发症[4]。研究表明，该疾病最初仅在卡纳塔克邦的希莫加（Shimoga）地区流行，近年已扩散至泰米尔纳德邦（尼尔吉里斯地区）、喀拉拉邦（瓦亚纳德和马拉普拉姆地区）、马哈拉施特拉邦（辛杜杜尔格地区）和果阿邦（帕利地区）[5]。1957年至2017年间，印度西海岸各地区共报告了约9,594例基亚苏努尔森林病病例；1957年至2020年间，约3,314只猴子因该病死亡[6]。每年大约记录160例人类病例，病死率为2.4%[7]。该病具有季节性特征，通常在12月至5月间爆发[8]。1962年对西孟加拉邦金高恩（Kingaon）、古吉拉特邦库奇（Kutch）和索拉什特拉（Saurashtra）地区的血清调查样本进行了研究，发现了KFDV的凝集抑制抗体[9]。中国研究者报道了由南 Jianyin 病毒引起的类似疾病[10]，沙特阿拉伯研究者自1995年起报告了Alkhurma 出血热（AHF）[11, 12]，主要发生在干旱季节。经常进入森林采集木柴、草料等产品的个体成为感染源[13]。蜱虫主要通过接触受感染者（如患病或已死亡的动物，如猴子）将病毒传播给人类[14]。目前尚未发现KFD的人际传播病例[15]。

除了现有的福尔马林灭活CEF疫苗外，还测试了多种疫苗。1990–1992年在卡纳塔克邦受影响地区进行的研究显示，单剂疫苗的有效率为79.3%，双剂疫苗的有效率为93.5%；2005–2010年的研究显示，两剂疫苗的有效率为62.4%，加强剂后的有效率为82.9%[17, 18]。一些研究人员认为，疫苗效力较低可能与当前流行的KFDV菌株与初始用于制剂的菌株存在差异有关，因此亟需进行详细研究并开发更有效的疫苗[19]。鉴于KFDV属于生物安全等级4（BSL-4）病原体，本研究采用了包括反向疫苗学和免疫信息学工具在内的先进方法，设计了一种多表位肽疫苗（MEPV）以诱导免疫反应。MEPV靶向病原体的特定表位，有望提高疫苗效果。针对多个表位的疫苗效果更好，因为它们降低了病毒产生逃逸突变体的可能性，且通常更安全。此外，这类疫苗具有高度适应性，可根据个体或群体的遗传差异进行定制。KFDV病毒直径约为25纳米，正链RNA基因组长度约为11个碱基对[20]。其翻译后产生Polyprotein，包括结构蛋白E、C和prM/M以及非结构蛋白（NS-1、NS-2a/b、NS-3、NS-4a/b和NS-5）[21]。KFDV的C蛋白在感染过程中起关键作用：它包裹病毒RNA以保护病毒，并与多种宿主蛋白相互作用促进病毒复制。非结构蛋白（NS-1、NS-2a、NS-3）可直接与C蛋白或结构蛋白相互作用，调节病毒组装和宿主细胞反应[22]。KFDV的免疫优势E蛋白与其他黄病毒E蛋白一样，有助于病毒与宿主细胞膜的融合[23]。研究表明，E蛋白在决定病毒毒力和组织亲和性方面起重要作用[24]。病毒感染后，病毒通过E蛋白附着在细胞表面，产生的中和抗体可识别黄病毒E蛋白上的表位[25]。计算研究表明，与其他黄病毒相比，E蛋白具有显著的免疫优势、较高的抗原性和较低的致敏性，使其成为创新疫苗开发的理想候选蛋白[26, 27]。

**2. 材料与方法**
2.1. 选择用于获取蛋白序列的KFD菌株
为确定适合本研究的菌株，从NCBI中检索并分析了1957年至2020年间分离和基因测序的KFDV菌株。数据表明，这些菌株来自人类、自然宿主、KFD病毒 reservoir 及媒介蜱虫（Haemaphysalis spp.）[28]。表1列出了本研究选用的KFDV菌株信息。
**表1. 用于研究的KFDV菌株**
| 序号 | 登录号 | 菌株 | 分离地点 | 分离年份 |
| --- | --- | --- | --- |
| 1 | KY779856.16 | 1962 | 卡纳塔克邦加达格（Gadag）Hillemarur | |
| 2 | KY779858.16 | 1967 | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga）Sagar | |
| 3 | KY779854.1NIV | 2012 | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga）Thirthahalli | |
| 4 | KY779863.1NIV | 1965 | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga） | |
| 5 | KY779855.1NIV | 2012 | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga） | |
| 6 | KY779859.1NIV | 2012 | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga） | |
| 7 | KP315947.1NIV | 2014 | 喀拉拉邦马拉普拉姆（Malappuram） | |
| 8 | ASF57827.1MCL-16-H-12 | 2016 | 果阿邦（Goa） | |
| 9 | MF186846.1MCL-16-H-8 | 2016 | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga） | |
| 10 | MF186845.1MCL-16-H-2 | | 卡纳塔克邦希莫加（Shimoga） | |

2.2. 选择合适的抗原性蛋白
抗原性是指外来物质或抗原被免疫反应产生的特异性抗体识别的能力。VaxiJen 2.0工具将KFD病毒蛋白的抗原性阈值设为0.4[29]。根据抗原性评分，选择并保存抗原性最高的蛋白FASTA序列。

2.3. 细胞毒性T细胞和辅助T细胞表位预测
抗体的产生依赖于T细胞受体与表位的结合。T细胞会引发适应性免疫反应。在诱导细胞毒性T细胞（CTL）反应时，抗原会在细胞内处理，线性表位是主要目标。人类白细胞抗原（HLA）在识别进入体内的细胞中起关键作用。为开发疫苗，其表位需与多个MHC等位基因结合，覆盖全球主要人群。基于HLA在印度人群中的高流行率，选择MHC I类HLA-A*24:02和MHC II类HLA-DRB1*15:01等位基因[30, 31]。使用IEDB MHC-I和NetMHCpan4.1等工具预测每个类别9个表的CTL表位，IEDB MHC-II工具预测HTL表位。预计百分位数小于10的15个表位具有较高亲和力[32]。

2.4. 线性B细胞表位预测
B细胞表位对于引发抗体介导的免疫防御至关重要，进而激活B细胞产生相应抗体。使用IEDB Analysis Resource中的ABCpred、BepiPred和Ellipro等工具进行预测[33-35]。更高的肽评分意味着更可能成为表位[36]。得分超过0.35阈值的残基被视为表位[35]。

2.5. 表位的抗原性预测
使用VaxiJen2.0工具（阈值0.4）确定表位的抗原性[29]。该工具用于评估预测的25个CTL表位和66个B细胞表位的抗原性。

2.6. 蛋白序列的致敏性预测
在开发疫苗前需识别过敏原。如果蛋白质和已知过敏原在80个氨基酸窗口内有超过35%的相同序列，则可能引起过敏[37]。使用AllerTop v.2.0工具识别潜在的过敏原[38]。选定的表位经过Allertop分析，确认非致敏性的表位用于疫苗构建和研究[39]。

2.7. 预测T细胞表位的毒性评估
ToxinPred工具用于预测表位的毒性，评估其对人类健康、动物健康或环境的潜在危害[40]。该工具生成给定肽的所有可能突变体，并识别蛋白质中的有毒区域[40]。

2.8. 预测T细胞表位的免疫原性预测
T细胞和B细胞是具有病原体特异性记忆功能的免疫细胞，能提供免疫保护。B细胞和T细胞需通过特异性受体识别病原体上的目标（抗原）才能成为记忆细胞。因此，准确预测CTL和HTL表位对于设计有效疫苗和深入了解免疫系统至关重要。使用IEDB提供的工具评估表位的免疫原性[41]。MHC I类表位的最高预测得分表示较高的免疫反应可能性。**干扰素γ诱导表位的预测**

干扰素表位被用来进一步研究筛选出的10个HTL表位诱导干扰素-γ免疫反应的能力[42]。干扰素表位使用户能够确定在暴露于干扰素-γ时能够引发MHC II类结合的肽或抗原。在基于计算机模拟的疫苗候选物开发中，最终选择了表现出阳性干扰素反应结果的表位。

2.10. 预测的T细胞表位的保守性分析
使用身份和保守性指标来定义和表征表位或蛋白质的变异。在进行表位预测时进行保守性分析是重要的，因为它可以确定表位是否在不同毒力程度的病毒分离株或不同微生物之间存在交叉反应。我们使用IEDB的表位分析工具计算了抗原内表位的保守程度，该工具在特定的身份水平下计算表位的保守度。该工具根据100%或更高的序列身份标准筛选出表位[45]。

2.11. 多表位PKFDVac-I (PIIC Vac Candidate-I)的概念化
MEPV序列是通过使用无害的、无过敏性的、具有显著抗原性的细胞毒性T淋巴细胞、B细胞表位和辅助T淋巴细胞表位精心设计的。这些表位通过GPGPG、AAY和KK连接器相互连接，以确保疫苗构建体作为一个独特的免疫原，并能引发比单一免疫原更高的抗体产生浓度[55]。通过利用AAY作为蛋白酶体切割位点，可以改变蛋白质的稳定性、免疫原性和表位呈现[56]。KK用于保持疫苗构建体的免疫原性[57]。图1提供了预测表位和开发PKFDVac-I所涉及整个过程的示意图。
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图（1）：表位预测和PKFDVac-I开发的全面工作流程。

2.12. PKFDVac-I的理化性质
分析了PKFDVac-I的疫苗质量属性及其他理化特性。使用VaxiJen v2.0在0.4的阈值下确定了其抗原性，使用AllerTopv 20确定了其致敏性[38]。利用Expasy Protparam工具预测了其理化特性[46]。通过Protein-Sol服务器评估了MEPV的溶解性[47]。

2.13. 2D和3D结构预测
使用PSIPRED和SOPMA服务器确定了PKFDVac-I的2D结构。在线工具Psipred 4.0能够准确预测跨膜螺旋、折叠、结构域识别和拓扑结构[58]。SOPMA服务器使用同一家族蛋白质的多序列比对（MSA）信息来预测2D结构[49]。PKFDVac-I的3D结构使用Alphafold Colab进行建模，这是第一种即使在没有已知结构的情况下也能以原子精度常规预测蛋白质结构的计算方法[50]。

2.14. 3D结构的优化和验证
3D结构的验证是一个关键步骤，因为它可以识别预测模型中的潜在错误。一个名为PDBsum的视觉数据库的PROCHECK软件提供了提交给PDB的每个3D结构中包含的信息的简洁概览[51]。PROCHECK程序有助于评估蛋白质结构的质量，无论是已经解决的还是基于现有结构建模的结构。在Ramachandran图统计分析中得分较高的模型将被优化并最小化能量。3D模型的能量最小化使用Chiron：快速蛋白质能量最小化服务器[52]完成，并通过Galaxy Refine网络服务器进行升级。

2.15. PKFDVac-I疫苗候选物与TLR-4免疫受体的分子对接
分子对接的概念基于这样一个理解：有效的免疫反应依赖于抗原和特定免疫受体之间的相互作用。为了研究疫苗与受体之间的相互作用，研究人员使用了Schr?dinger套件中的Maestro程序进行分子对接研究[59]。PKFDVac-I的三级结构被用作配体，而从PDB下载的受体TLR4（PDB: 4G8A）被用作靶标。人类TLR 4复合物的晶体结构包括从A到H的10条链。链A和B代表人类TLR 4受体，链C和D对应于淋巴细胞抗原96，而链E-H与各种类型的吡喃糖相连[60]。疫苗模型和受体使用Schr?dinger Protein Preparation Wizard和默认设置进行制备。在此过程中，添加了氢原子，去除了晶体，并使用OPLS-2005力场分配了分数电荷。发现链C（MD2）的结合位点是活跃的结合位点。选择一个边长为（96 x 96 x 96 ?）的网格框来包围链C区域，网格中心位于此先前描述的结合位点的中心。对接使用蛋白质-蛋白质对接模块完成。以最低的Glide分数选择了顶对接姿势。PDBsum在线服务器用于分析TLR4和疫苗复合物的结合残基和相互作用表面。

2.16. 分子动力学模拟
为了进一步研究疫苗-受体复合物之间的相互作用，进行了分子动力学（MD）模拟。模拟使用Schr?dinger的Desmond模块的2.3版本执行。Desmond内的System Builder应用程序用于准备后续计算的系统。指定了一个所有边都有10 ?缓冲区的正交周期性边界框，以确保特定的体积。在该系统中溶解蛋白质-疫苗复合物后，使用Desmond模块中可用的默认协议进行了能量最小化和松弛，采用OPLS 2005力场参数[61]。模拟在300K下进行了100ns，并每100 ps记录总能量（kcal/mol）。MD模拟完成后，使用Desmond的Simulation Event Analysis工具评估了复合物的稳定性。该工具分析了MD模拟产生的轨迹文件，以确定氢键相互作用、RMSF和RMSD。

2.17. 免疫模拟
为了评估工程化肽的免疫反应，使用C-Imm sim服务器进行了免疫模拟[62]。在疫苗原型的临床前测试中，使用较短的接种间隔以快速将抗体滴度提高到保护水平以上。临床推荐的两次疫苗接种之间的最短间隔是一个月，大约四周[63]。在我们的模拟中，使用了1、84和168的时间步长参数，分别对应于1000个模拟步骤中的8小时间隔[64, 65]。模拟遵循了先前研究中报告的相同协议和默认参数，研究了PKFDVac-I多表位肽疫苗刺激免疫系统细胞（包括树突状细胞、免疫球蛋白、B细胞淋巴细胞、HTL、CTL和自然杀伤细胞）的能力。

3. 结果
3.1. KFD病毒株的鉴定、分析及免疫优势蛋白的检索
选定的印度病毒株的登录代码及其编码包膜蛋白的基因序列从NCBI获取并保存为FASTA格式。KFDV的糖蛋白E由496个氨基酸组成。迄今为止，所有分析的蜱传 flaviviruses 的E蛋白都具有三个潜在的N-糖基化位点[66]。它有助于在宿主和病毒细胞膜之间建立桥梁，使病毒进入宿主细胞。此外，它通过产生中和性和保护性抗体来诱导宿主免疫[25]。此外，E蛋白的结构成分有助于病毒附着、融合、血凝、宿主范围、穿透和细胞趋向性，以及病毒毒力和在自发感染或疫苗接种过程中的减弱[67]。E蛋白在确定病毒毒力或减弱方面起着重要作用，无论是在具有中和抗性逃逸突变体的研究中还是在不同 flaviviruses 的减毒株研究中[68]，以及疫苗开发中[23, 26]。

3.2. KFDV免疫优势蛋白的抗原性评估
分析了抗原性得分，比较研究（表3）发现所有菌株的抗原性得分均高于0.45，选择了抗原性值最高的菌株进行进一步研究。在十个分离株的蛋白质序列中，从人类分离出的62957和67965菌株表现出最高的抗原性得分0.6649，但由于MCL-16-H-1297（0.6634）是2016年新分离并测序的菌株，因此被选为研究对象，而不是1962年和1967年分离的菌株。
**表3. 选定分离株E蛋白的估计抗原性。**
| 编号 | 登录号 | 菌株 | 抗原性得分 |
| ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | ARJ342 | 245.16 | |
| 2 | 2957 | 0.6649 | |
| 3 | KY7798 | 85.16 | |
| 4 | 67965 | 0.6649 | |
| 5 | ASF57 | 7827.1 | |
| 6 | MCL-16-H-1297 | 0.6634 | |
| 7 | ARJ342 | 8843 | |
| 8 | NIV12 | 8630.6634 | |
| 9 | MF186 | 8646.1 | |
| 10 | MCL-16-H-8 | 0.6616 | |
| 11 | MF186 | 85.1 | |
| 12 | MCL-16-H-2 | 0.6617 | |
| 13 | ARJ342 | 390.6587 | |
| 14 | KY7798 | 63.1 | |
| 15 | NIV12 | 878 | |
| 16 | KP31 | 5947.1 | |
| 17 | NIV14 | 6034 | |
| 18 | 38 | 33 | |

3.3. 细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞表位的预测
使用基于计算的工具，根据百分比排名预测并选择了表位。较高的得分表示触发免疫反应的可能性更高，前25个CTL表位被仔细选中进行进一步研究（表4）。IEDB中表位的较低调整排名表明其结合能力更强。根据MHC-II（HTL）结合百分位数排名，选择了前25个表位（表5）。
**表4. MHC-I结合预测结果和分析报告，突出显示预测的CTL表位的毒性、致敏性、抗原性和免疫原性状态。**
| 序号 | 起始位置 | 结束位置 | 表位 | 得分 | 排名 | 毒性 | 致敏性 | 抗原性得分 | 抗原性得分 | 免疫原性得分 |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | 131 | 139 | VYDVNK | 0.549 | | 非毒素 | | | | |
| 2 | 10 | 139 | AL0 | 0.277 | | | | | |
| 3 | 139 | QWFQKG | 0.408 | | | | | |
| 4 | 139 | NAL0 | 0.721 | | | | | |
| 5 | 139 | PA-0 | 0.373 | | | | | |
| 6 | 139 | YVGEL | 0.307 | | | | | |
| 7 | 139 | SHQW | 0.307 | | | | | |
| 8 | 139 | AFGAAF | 0.276 | | | | | |
| 9 | 139 | NAL0 | 0.038 | | | | | |
| 10 | 139 | NIV12 | 839 | | | | |
| 11 | 139 | GYVY | 0.245 | | | | | |
| 12 | 139 | NKI | 0.245 | | | | |
| 13 | 139 | MD2 | 0.226 | | | | |
| 14 | 139 | 0.226 | | | | | |
| 15 | 139 | PDBsum | 0.208 | | | | |
| 16 | 139 | AWQV | 0.141 | | | | |
| 17 | 139 | RHLVEF | 0.208 | | | | |
| 18 | 139 | 140 | 0.68 | | | | |
| 19 | 139 | PA-0 | 0.127 | | | | |
| 20 | 139 | NHADRL | 0.208 | | | | |
| 21 | 139 | AWQV | 0.141 | | | | |
| 22 | 139 | HRDWF | 0.131 | | | | |
| 23 | 139 | LVPW | 0.131 | | | | |
| 24 | 139 | PA-0 | 0.127 | | | | |
| 25 | 139 | 122 | 0.855 | | | | |
| 26 | 139 | PA-0 | 0.127 | | | | |
| 27 | 139 | NIV12 | 0.869 | | | |
| 28 | 139 | GWGN | 0.084 | | | | |
| 29 | 139 | NAG | 0.007 | | | | |
| 30 | 139 | NIV12 | 839 | | | |
| 31 | KY7798 | 0.658 | | | | |
| 32 | 139 | 10 | 0.658 | | | |
| 33 | KP31 | 5947.1 | | | |
| 34 | NIV14 | 6034 | | | |

3.4. 细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞表位的预测
使用基于计算的工具，根据百分比排名预测并选择了表位。较高的得分表示触发免疫反应的可能性更高，前25个CTL表位被仔细选中进行进一步研究（表4）。IEDB中表位的较低调整排名表明其结合能力更强。根据MHC-II（HTL）结合百分位数排名，选择了前25个表位（表5）。
**表5. MHC-I结合预测结果和分析报告，突出显示预测的CTL表员的毒性、致敏性、抗原性和免疫原性状态。**
| 序号 | 起始位置 | 结束位置 | 表位 | 百分位数排名 | 毒性 | 致敏性 | 抗原性得分 | 抗原性得分 | 免疫原性得分 |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | 113 | 139 | VYDVNK | 0.549 | | 非毒素 | | | |
| 2 | 10 | 139 | AL0 | 0.277 | | | | |
| 3 | 139 | NAG | 0.025 | | | | |
| 4 | 139 | 2KY7 | 0.721 | | | | |
| 5 | 139 | AAY | 0.373 | | | | |
| 6 | 139 | YVGEL | 0.307 | | | |
| 7 | 139 | SHQW | 0.307 | | | |
| 8 | 139 | AFGAAF | 0.276 | | | |
| 9 | 139 | NAL基于抗原性得分和预测工具选择疫苗构建的最终B细胞表位。表号 表位 预测抗原性得分 1 LGVALAWLGLNSRNPT 1.6057 2 LGLNSRNPTLSVGFLI 1.5677 3 TVVGEHAWDFGSVGGI 1.2711 4 HVTCDVGLEKLKMKGM 0.9336 5 VGFLPRILLGVALAWL 0.8507 6 LITGGLVLTMTLGVGA 0.8461 7 YVGELSHQWFQKGSTI 0.7818 8 PSMETTGGGFVELQLP 0.7499 9 NESHSNRKTASFTTQS 0.7077 10 KTASFTTQSEKTILTL 0.7068 11 WFEDLSLPWRHEGAQE 0.7041 12 VELQLPPGDNIIYVGE 0.6526 13 EPHAVKMDIFNLGDQT 0.6283 14 HEGAQEWNHADRLVEF 0.5485 15 PGDNIIYVGELSHQWF 0.4761 16 TSGVDPAQTVVLELDK 0.4616 17 SVGKALHTAFGAAFNT 0.4151 18 FNTIFGGVGFLPRILL 0.4096 19 PAMGPATLPEEHQAST 0.4027 20 LPRILLGVALAWLGLNSRNPTLSVGFLITGGLVLT 0.9546 21 PSMETTGGG 0.7857 22 LPPGDNIIYVGELSHQWFQKGSTIGRVL 0.6173 23 DWFEDLSLPWRHEGAQEWNHAD 0.8595 24 AWDFGSVG 2.5292 表位的免疫原性分析 高结合能力的表位随后会进行额外测试以预测其免疫原性。正的表位得分表示高免疫原性，表明其具有强烈的激活T细胞和诱导细胞免疫的能力。表4和表5显示了预测的免疫原性得分。3.9. IFN-γ诱导表位的预测 在10个入围的HTL表位中，只有3个被检测出具有IFN-γ活性（表8），因此被选用于疫苗构建。表8. Gamma干扰素诱导表位。表号 表位 方法 结果 得分 1 IFGGVGFLPRILLGVMERCIN 否 -62 2 NTIFGGVGFLPRILL 4 3 GGVGFLPRILLGVAL 10 4 VGFLPRILLGVALAW 11 5 GVGFLPRILLGVALA 11 6 FLITGGLVLTMTLGVSVM 是 0.219 15 47 47 DQTGILLKSLAGVPV 0.434 5 99 78 VSLVLELGGCVTLTASVM 否 -0.125 14 9 129 GILLKSLAGVPVANIMERCI 11 0 ITGGLVLTMTLGVGASVM 是 0.174 8 8 7 3.10. 保守性分析 对从KFD病毒的免疫优势蛋白E中预测出的T细胞表位进行了保守性分析，需要将一个蛋白表位与给定序列集中的每个蛋白序列对齐，以确定该表位的保守程度。为了实现有效的免疫，表位必须在世界各地的菌株中保持保守。预测结果显示，从MCL-16-H-1297菌株中分离出的所有选定的表位在其他入围的KFD病毒菌株中都具有100%的保守性。3.11. 使用选定的表位构建多表位疫苗候选物PKFDVac-I 从预测和筛选的候选者中最终确定了5个CTL、3个HTL和8个B细胞表位。然后将它们连接在一起形成疫苗构建物PKFDVac-I，总长度为279个氨基酸。图2说明了这种疫苗构建物的示意图。下载：下载高分辨率图像（109KB）下载：下载全尺寸图像 图（2）。PKFDVac-I的多表位肽疫苗候选物的示意图。3.12. PKFDVac-I的物理化学性质和溶解度预测 PKFDVac-I的保护性抗原性得分为0.8882，致敏性得分为-0.81924，根据其氨基酸组成表明它可能是一个非致敏性抗原[38]。PKFDVac-I的物理化学性质，即分子量为29162.32道尔顿。分子量低于110 kDa的蛋白质被认为更好，因为它们可以更容易纯化并用于疫苗开发[70]。pI值为9.79。肽结构中的大多数氨基酸具有碱性结构，这从相对较高的pI值中可以看出[71]。原子组成为C1363H2128N350O349S5，包含4195个原子。假设所有半胱氨酸残基对都形成二硫键，Ext.系数计算为62450 Abs 0.1% (=1 g/l) 2.141。在实验室条件下，人网织红细胞的半衰期为20小时，在活体条件下，酵母的半衰期为30分钟，在活体条件下，大肠杆菌的半衰期超过10小时。不稳定性指数（II）为11.80，表明蛋白质是稳定的，脂肪族指数为108.39，GRAVY得分为0.448。较高的脂肪族指数表明良好的热稳定性，新疫苗也证明了这一点。根据较低的GRAVY值，该蛋白质似乎是亲水且可溶的[71]。由于某些氨基酸（如丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸）在抗体-抗原识别位点中代表性不足，而芳香族残基代表性过高，因此提取了PKFDVac-I的氨基酸组成以确定其中存在的脂肪族和芳香族氨基酸的百分比[72]。PKFDVac-I的质量和物理化学属性在表9中总结。表9. PKFDVac-I的质量属性。特征 数据 报告 推论 氨基酸数量 279个氨基酸 适合疫苗候选物[70] 分子量 29162.32道尔顿 脂肪族指数 108.39 热稳定性提高 GRAVY 0.448 疏水性 抗原性 0.8882 抗原性 致敏性 -0.81924 非致敏 II 11.80 稳定性 测定溶解度 0.554 可溶性 从Expasy Protparam获得的数据表明，脂肪族氨基酸占整体氨基酸组成的58.9%，芳香族氨基酸占10.1%。PsiPred[48]在预测2D结构时获得的数据显示，PKFDVac-I包含小非极性（41.21%）、疏水性（28.67%）、极性（20.07%）和芳香族加半胱氨酸（10.03%）氨基酸群，如图（3）所示。下载：下载高分辨率图像（90KB）下载：下载全尺寸图像 图（3）。PSIPRED预测的氨基酸类型的2D结构。3.13. PKFDVac-I的二级结构预测 使用PsiPred[48]和SOPMA预测的2D结构显示在图（4A和B）中。SOPMA显示40.50%的卷曲环、25.45%的β折叠层和34%的α螺旋。下载：下载高分辨率图像（211KB）下载：下载全尺寸图像 图（4A）。PKFDVac-I的预测2D结构。下载：下载高分辨率图像（97KB）下载：下载全尺寸图像 图（4B）。PKFDVac-I的2D结构的图形表示。3.14. PKFDVac-I的三级结构预测 使用相关蛋白质作为原始输入预测了PKFDVac-I的3D模型。获得了五个不同的3D结构模型，置信度得分越高，模型越好[50]。选择得分最高、排名最高的模型进行进一步精细化和验证（图5A，B）[73]。下载：下载高分辨率图像（139KB）下载：下载全尺寸图像 图（5A）。PKFDVac-I的3D结构。下载：下载高分辨率图像（121KB）下载：下载全尺寸图像 图（5B）。在Galaxy Refine服务器中对图（5A）中的结构进行能量最小化后的PKFDVac-I的3D结构。3.14. 3D结构的精细化和验证 在进行3D结构精细化时，发现VDW（范德华）排斥能量从173.305 kcal/mol降低到37.3358 kcal/mol。这是通过将原子间的接触数量从2150增加到2274，并将碰撞数量从117减少到53来实现的。精炼后的模型的PDB结构在使用Galaxy Refine网络服务器进一步进行能量最小化后，产生了五个最低能量得分的模型。选择Rama偏好得分最高、RMSD值最大和能量得分最低的模型进行下载，以便进一步研究[57]。根据获得的结果，改进模型中的Rama偏好区域（图（5B-6B）和原始模型（图（5A-6A）中的氨基酸残基分别为98.6%和77.3%。改进结构的Ramachandran图显示在图（6B）中，突出了精细化过程中的改进。增强后的结构表现出更高的稳定性，这是任何潜在疫苗候选物的关键，因为它对可预测性和合成性至关重要[71]。下载：下载高分辨率图像（268KB）下载：下载全尺寸图像 图（6）。PKFDVac-I的（A）初始结构和（B）精细后结构的Ramachandra图。如图所示，原始图中的残基在偏好区域中的浓度非常低，但在改进后的图中浓度更高。3.15. 分子对接研究 使用蛋白质-蛋白质对接来确定疫苗候选物PKFDVac-I蛋白受体的稳定性。Schr?dinger服务器显示了30种不同的结合模式。在研究疫苗-受体复合体的结合亲和力时，选择了结合自由能得分最低的姿态，即-579.716，Piper能量为-1150.78。得分来自蛋白质和配体结合时发生的潜在能量变化。因此，很强的结合由非常负的得分表示，而弱结合或无结合则由不太负或甚至正的得分表示[74]。然后通过结合相互作用残基检查了该复合体。Lys91和Cys95氨基酸残基与受体蛋白的Ala59残基之间形成了两个氢键，并在表10和图（7）中表示。尽管在对接的PKFDVac-I–TLR-4复合体中只明确识别出两个氢键，但许多非键合接触（疏水堆积和范德华相互作用）和静电互补性支撑了界面稳定性，这与非常有利的对接能量一致。两个带相反电荷的残基之间没有形成盐桥，也没有两个半胱氨酸残基之间形成二硫键。这些相互作用通过保持蛋白质的构象来贡献于疫苗候选物的稳定性。总共形成了387个非键合接触。表10. PKFDVac-I与TLR-4受体的对接统计。表号 化合物 Piper得分 Piper能量 相互作用残基 蛋白质 肽 1 PKFDVac-I TLR4复合体 579.716 -1150.78 Lys91, Cys95 Ala59下载：下载高分辨率图像（73KB）下载：下载全尺寸图像 图（7）。PKFDVac-I与TLR4受体之间的分子对接相互作用。3.16. 分子动力学模拟 使用Schr?dinger软件的Desmond v2.3包运行了100纳秒的MD模拟。使用RMSD和RMSF检查了疫苗-受体复合体的稳定性。RMSD计算 RMSD是衡量两种蛋白质结构相似性的定量指标[75]。图形图在右侧X轴上显示了开发的疫苗，在左侧y轴上显示了TLR4蛋白的RMSD。最初，复合体在20纳秒内波动较大。在20纳秒到40纳秒的模拟时间期间观察到了轻微的波动。此外，在40纳秒之后，模拟趋于稳定，并在模拟结束（100纳秒）之前保持这种状态。复合体的整体RMSD图（图8）表明它最初波动，然后稳定地结合到TLR4结合位点，在100纳秒的模拟期间保持不变。下载：下载高分辨率图像（77KB）下载：下载全尺寸图像 图（8）。在RMSD图（疫苗-受体复合体）中，蓝色峰值表示蛋白质RMSD，红色峰值表示配体RMSD。第二张图像显示了存在构建的疫苗时TLR4蛋白的RMSF，与B因子相比。3.17. 免疫模拟 使用C Imm-sim服务器通过计算机模拟评估了对PKFDVac-I MEPV的免疫反应。重点研究了B细胞、I类和II类HLA表位以及T细胞受体与HLA-肽复合体之间的相互作用。结果表明，疫苗最初引发了免疫反应，并在后续暴露中引发了更强的反应。接种疫苗后，观察到免疫球蛋白水平升高，抗原水平显著降低（图9）。下载：下载高分辨率图像（100KB）下载：下载全尺寸图像 图（9）。使用C-ImmSim服务器评估了对PKFDVac-I的免疫反应和免疫球蛋白水平。疫苗的有效性通过增加和维持的B细胞和T细胞群体得以证明，每种剂量都增强了这些水平，并促进了记忆T辅助细胞和T细胞毒细胞的发育。这些细胞在整个模拟过程中保持活跃，表明免疫反应持续时间较长。T细胞毒细胞群体保持了稳定的记忆细胞水平，并增加了活跃细胞的数量。此外，巨噬细胞和树突状细胞的增殖增加表明抗原被有效地处理并呈递给CD4+和CD8+细胞。模拟还显示细胞因子和白细胞介素水平升高，特别是干扰素Gamma显著上升，表明PKFDVac-I疫苗构建产生了强烈的抗病毒反应。4. 讨论 KFD，通常被称为猴热，在印度卡纳塔克邦的分布有限，但最近其分布范围已经沿西高止山脉扩大。据估计，每年有400例KFD病例[19]。根据Kasabi等人[17]和Holbrook[77]的研究，由于缺乏适当的治疗方法以及现有疫苗的疗效低，KFD感染病例的数量正在增加。传统的控制措施，如蜱虫控制和基于CEF的疫苗，对病例的效果有限。由于KFDV被认为是一种高致病性病原体，并被归类为BSL4[78]，并且根据“重组DNA研究和生物安全法规和指南”[4]，KFDV自2017年起被划分为风险组4微生物。反向疫苗学方法的使用简化了识别触发强免疫反应的表位的任务。鉴于病毒的致病特性，利用现有的病原体基因组序列预测了多表位抗原肽，并使用表2中列出的免疫信息学工具分析了它们的物理化学特性。表2。在本计算研究中使用的计算机工具或服务器如下：

| 工具/服务器编号 | 网站地址 |
|--------------|------------|
| 1VaxiJen 2.0 | http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html | [29] |
| 2Allele Frequency Database | http://www.allelefrequencies.net | [30] |
| 3NetMHCpan4.1 | http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/ | [32] |
| 4IEDB MHC-I Binding tool, MHC-I Immunogenicity | http://tools.iedb.org/mhci/ | [32] |
| 5IEDB MHC-II Binding tool | http://tools.iedb.org/mhcii/ | [32] |
| 6ABCPred | http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ | [36] |
| 7Bepipred | http://tools.immuneepitope.org/bcell/ | [43] |
| 8Ellipro | http://tools.iedb.org/ellipro/ | [34] |
| 9AllerTop v 2.0 | https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/index.html | [38] |
| 10AlgPred | https://webs.iiitd.edu.in/raghava/algpred2/batch.html | [39] |
| 11ToxinPred | https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/design.php | [40] |
| 12MHC-II Immunogenicity | http://tools.iedb.org/CD4episcore/ | [44] |
| 13IFN Epitope | https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ifnepitope/predict.php | [42] |
| 14Epitope Linear Conservancy | http://tools.iedb.org/conservancy/ | [45] |
| 15Expasy Protparam tool | https://web.expasy.org/protparam/ | [46] |
| 16Protein Solubility | http://protein-sol.manchester.ac.uk | [47], [48] |
| 17Psipred 4.0 | http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ | [48] |
| 18SOPMA | https://npsa.lyon.inserm.fr/cgi-in/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html | [49], [50] |
| 19Alphafold | https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb | [50] |
| 20Procheck- PDBsum | https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html | [51] |
| 21Chiron: The rapid protein energy minimization server | https://dokhlab.med.psu.edu/chiron/processManager.php | [52] |
| 22Galaxy Refine | http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE | [53] |
| 23C-Imm Sim | http://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM | [54] |

在结构蛋白中，KFD病毒的包膜蛋白（E）具有显著的组织嗜性。这种蛋白质对病毒的致病性和免疫逃避至关重要，因为它有助于病毒进入宿主细胞，并决定了病毒的免疫遗传和表型特征[79]。根据结合分数和百分位数排名，共选择了25个HTLs和CTLs以及66个B细胞表位。这些表位经过了包括抗原性、致敏性、毒性和免疫原性在内的质量属性分析。经过综合分析，最终确定了5个CTL表位、3个HTL表位和8个B细胞表位，它们符合可行疫苗候选物的标准，并通过适当的连接子连接起来，形成了一个稳定且有效的疫苗构造，有望产生强大的免疫反应。最终的PKFDVac-I疫苗包含279个氨基酸，分子量为29,162.32道尔顿，处于疫苗的最佳大小范围内。理化性质显示等电点（pI）为9.79，表明在该pH值下蛋白质呈电中性。计算出的不稳定指数（II）为11.80，表明蛋白质具有稳定性；烷基指数为108.39，预示了热稳定性[71]。GRAVY得分为0.448，表明其具有极性和疏水性；标准化溶解度为0.554，表明其溶解度较高[46]。

Toll样受体（TLRs）是抵御感染的第一道防线，在适应性免疫中起着关键作用。具体来说，除TLR-5外，TLR 1-9都参与对病毒感染的反应。基于其在抗病毒识别中的核心作用以及先前研究的证据（黄病毒包膜蛋白可以与TLR-4相互作用以触发细胞因子反应），选择TLR-4作为典型的先天免疫受体。除了结构功能外，E蛋白还作为病原体相关分子模式（PAMP），其与TLR4的相互作用突显了该受体作为先天免疫传感器的角色，使得TLR4成为研究黄病毒感染中的对接相互作用和宿主免疫激活的合理目标[79, 80]。

在我们的分子对接实验中，推荐的疫苗候选物PKFDVac-I在TLR4受体结合位点表现出高结合亲和力和低结合能量（Piper能量为-1150.78）。TLR4的分子对接结果表明，该多表位肽可以与该中枢先天免疫受体结合。这在生物学上具有重要意义，因为TLR4的激活已知会诱导产生促炎细胞因子和I型干扰素，这些都是启动适应性免疫所必需的。这样的TLR4刺激疫苗候选物将增强抗原呈递、树突状细胞成熟以及T细胞和B细胞的后续激活，最终提高并延长保护性免疫。100纳秒的MD模拟进一步证实了复合物的稳定性（RMSD一致），表明这种相互作用是持久且具有生物学意义的。

在正常的KFDV-宿主相互作用中，已知病毒蛋白NS1和E蛋白在大多数情况下会与TLR4结合，导致严重黄病毒感染时细胞因子过量产生和血管病理[81]。相比之下，设计良好的MEPV–TLR4相互作用旨在利用TLR4激活的有益效果（强大的免疫启动），而不引发失控的免疫病理。因此，对接计算为预期疫苗构造能够以更安全、更具免疫原性的方式复制自然病毒识别事件提供了合理依据，支持其潜在的有效性。使用计算机模拟测试的PKFDVac-I引发了强烈的免疫反应，尤其是在重复接种后。该疫苗提高了关键免疫蛋白的水平，并增强了B细胞和T细胞的活性，这对抵抗感染至关重要。这些免疫细胞在较长时间内保持活性。此外，疫苗还增强了抗原呈递免疫细胞的活性，这些细胞负责处理并向其他免疫细胞呈递抗原。总体而言，该疫苗产生了强大的抗病毒反应。

鉴于这些有希望的结果，需要通过体外和体内研究进一步研究PKFDVac-I，以开发出一种安全有效的疫苗候选物，用于人类使用。

结论：

KFD是印度重新出现的动物源性疾病问题，其在印度的再次出现强调了需要超出传统媒介管理范围的的有效预防策略。本研究展示了从病毒基因组预测多表位肽基免疫原的方法。分析表明，这些基于免疫信息学预测的抗原可能作为对抗KFD的潜在免疫原。研究提出PKFDVac-I疫苗具有高结合亲和力和稳定性，在计算机模拟中表现出良好的免疫原性，表明它可能作为一种强效的免疫原发挥作用。这一发现强调了需要进一步研究以评估其在适当生物模型中的有效性。工作还强调了如何将免疫信息学预测的抗原进行化学合成，这使得大规模生产变得更加简单。此外，确定这些免疫原在体内的潜在交叉保护作用也很重要，因为这可能会扩大它们在对抗相关病毒性疾病中的用途，特别是考虑到KFDV与沙特阿拉伯报告的Alkhurma病毒之间存在强烈的遗传相似性。

**作者贡献**

作者对论文的贡献如下：
S.B.P., S.J.：概念化和设计；
S.B.P., A.J., S.J.：方法论；
S.B.P., A.J., N.K.P., R.G.P.：计算工作；
S.B.P., S.J.：数据分析；
R.S.：数据收集；
S.B.P., S.J., P.R.：撰写；
S.J.B., P.R.：审阅和编辑；
S.K.C., A.A.P.：研究协调；
S.J., S.K.C., P.R.：监督。所有作者均已阅读并批准了最终手稿。

**伦理批准和参与者同意**

不适用。

**人权和动物权利**

不适用。

**发表同意**

不适用。

**数据和材料的可用性**

支持本文发现的数据可在Zenodo网站上获取：
https://doi.org/10.5281/zenodo.17915145（参考编号2025，版本v1）。

**资助**

无。

**利益冲突**

作者声明没有财务或其他利益冲突。