利用集成3D多光谱表型和时间序列分析技术对中国白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）幼苗的热应力反应进行高通量筛选

《Plant Phenomics》：High-Throughput Screening of Heat Stress Response in Chinese Cabbage (Brassica rapa L. ssp. pekinensis) Seedlings Using Integrated 3D Multispectral Phenotyping and Time-Series Analysis

　　尹娜·张 | 罗兰德·沙弗莱特纳 | 林亚平 | 金珍熙 | 朴美惠
韩国全罗北道万珠郡农业与草药科学研究院（RDA），邮编55365

**摘要**
气候变化威胁着全球白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）的产量，这种耐寒作物对亚洲市场至关重要。白菜在18-20°C的温度下生长最佳，而温度超过25°C时生长会受到严重干扰，因此培育耐热品种至关重要。本研究结合了高通量3D多光谱表型和多变量分析，以表征18个白菜基因型对热应激的时间响应。幼苗在40/35°C（白天/夜间）和25/20°C（白天/夜间）的温度条件下分别接受14天的热处理，并使用PlantEye F600多光谱3D扫描仪持续无损监测14个形态学和光谱参数。通过对时间表型数据的主成分分析，解释了62-68%的变异，从而能够通过欧几里得距离测量来定量评估表型稳定性。时间分析显示，白菜在处理后3天的响应最为显著（ΔC=3.27），这反映了其作为耐寒作物的快速热敏感性；随后在14天后逐渐适应（ΔC=1.41）。早期响应主要受形态学参数影响（3-5天），随后转变为以光谱指数为特征的生理调整（10-14天）。在热应力下，植物通过增加蒸腾作用（增加了四倍）来优先进行蒸发冷却，而不是碳同化。一个关键发现是，与地上部分相比，根部生物量的减少更为明显，根部生物量减少了38-47%，而地上部分仅减少了20%。3D成像参数与破坏性生物量测量之间的高相关性（r>0.8）验证了无损方法的可靠性。值得注意的是，基于图像的根表面积分析与实际根生物量高度相关（R2=0.698，p<0.001），使得无需传统破坏性处理即可实际评估根面积。通过整合表型稳定性（欧几里得距离）和热应力下的生物量生产情况，本研究确定了四种不同的耐热策略：稳定高产基因型（结合表型稳定性和高耐热生物量的理想育种目标）、稳定保守基因型（表型稳定但产量较低）、可塑性高产基因型（表型发生显著变化但产量仍高）以及可塑性敏感基因型（表型不稳定且生物量低）。这一框架通过高效的高通量表型分析加速了耐热白菜的育种，为实现适应气候变暖的各种生产环境提供了有针对性的基因型选择。

**1. 引言**
气候变化对全球农业生产构成了严重威胁，温度升高和热浪频发扰乱了作物生长，威胁到全球食品安全。其中，白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）是最容易受到影响的蔬菜之一，这种耐寒作物不仅是主要的新鲜蔬菜，也是制作泡菜的关键原料。2023年，全球白菜产量达到7380万吨，是亚洲食品系统的重要组成部分。然而，它狭窄的适宜生长温度范围（18-20°C）以及25°C以上的严重生长障碍，使其容易受到气候变暖的影响，亟需培育耐热品种。

热应力会触发白菜复杂的生理级联反应，从根本上改变植物的功能和生产力。在细胞层面，高温会破坏光合作用机制，特别是影响RuBisco活性酶和卡尔文循环中的酶，导致尽管二氧化碳充足但碳固定能力下降。植物通过优先调节体温来应对热应力，增加蒸腾作用以促进蒸发冷却，即使这会降低水分利用效率。这种生理权衡在十字花科植物中尤为明显，因为热应力对根系和地上部分的影响不同。多项研究表明，根系对高温的敏感性远高于地上部分，根生物量的损失通常比地上部分多20-30%。根系的这种敏感性会导致水分和养分吸收的连锁效应，这可能是田间种植的白菜在热应力下产量严重下降的原因，尽管其地上结构相对完整。

分子和生理学研究揭示了白菜基因型在热应力响应方面的显著遗传变异。耐热品种表现出协调的应激缓解策略，包括热休克蛋白（HSPs）的积累、脯氨酸和可溶性糖等物质的积累，以及抗氧化酶系统（如超氧化物歧化酶）的上调。转录组分析发现了涉及植物激素信号传导的关键调控途径，特别是脱落酸介导的响应，以及碳代谢和糖酵解途径的变化。然而，仍存在一个关键缺口：这些分子响应如何转化为跨时间尺度的整体植物表型，以及地上和根系如何协调响应以维持功能。此外，应力下的表型稳定性与生产能力之间的关系尚未得到充分理解，但这对寻求平衡耐热性和产量维持的育种计划至关重要。

传统的基于田间的耐热性评估方法存在方法学限制，环境异质性、不可预测的天气模式和基因型与环境的复杂相互作用会导致混淆效应，掩盖了真正的遗传差异。传统的破坏性采样虽然能提供准确的生物量数据，但仅能捕捉到最终状态，无法揭示应激响应和适应过程的时间动态。高通量表型技术提供了改进的解决方案，通过激光雷达（LiDAR）结合多光谱反射率测量，可以连续、无损地监测整个应激过程中的形态变化和生理状态。最近的应用表明，这种方法在小麦研究中证明了从初始形态学到后期生理调节的时间变化，揭示了热适应的不同阶段。在玉米研究中，叶绿素荧光参数和高光谱指数的联合分析为干旱响应提供了补充见解，有助于区分不同基因型，并与植物活力和产量表现相关联。类似的三维多光谱方法在辣椒耐热性筛选中的应用也验证了时间表型在捕捉基因型特定适应动力学方面的有效性。然而，将其广泛应用于白菜仍存在局限性，尤其是在根系评估和热应力条件下的图像参数与传统破坏性测量的结合方面。

热应力响应是复杂的，涉及形态学、结构和生理方面的多种同时变化。主成分分析（PCA）已成为将多种表型测量整合为定量耐热性指标的强大工具。通过计算主成分空间中的欧几里得距离，研究人员可以客观量化应激下的表型稳定性，并识别具有不同适应策略的基因型。最近的应用已在番茄研究中得到验证，基于PCA的聚类方法通过欧几里得距离成功区分了温室控制条件下的耐热基因型，表明耐热基因型在多个生理和形态特征上保持了更稳定的表型。同样，PCA结合欧几里得距离计算有效区分了耐旱和耐旱敏感玉米基因型。此外，无监督的多变量分析在视觉症状出现之前就检测到了微妙的应激响应，展示了集成表型方法的强大能力。PCA基于距离的方法在育种计划中具有特别优势，有助于将基因型分类为不同的耐受类别。然而，将其应用于白菜耐热性筛选（尤其是与传统生理测量方法的验证）方面仍需进一步探索。

**2. 材料与方法**
**2.1. 植物材料与生长条件**
该实验于2024年7月至8月在台湾的世界蔬菜中心（WorldVeg）进行。最初选择了20个白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）基因型，包括12个由农村发展局（RDA）开发的自交系、4个韩国商业F1杂交种和4个台湾商业F1杂交种（表1）。由于虫害侵袭，有两个基因型（Ccab11和Ccab12）受损，被排除在热应力处理实验之外。因此，共有18个基因型参与了热应力响应的评估。实验设计包括时间线、测量计划、处理条件和表型分析流程（图1）。

**表1. 实验中使用的大白菜基因型**
| 基因型 | 来源/产地 | 遗传状态 |
| --- | --- | --- |
| Cab01 | Wongyo20034ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab02 | Wongyo20035ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab03 | Wongyo20036ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab04 | Wongyo20037ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab05 | Wongyo20038ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab06 | Wongyo20039ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab07 | Wongyo20042ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab08 | Wongyo20045ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab09 | Wongyo20046ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab10 | Wongyo20048ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab11 | Wongyo20049ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab12 | Wongyo20050ho | RDA, 韩国 | 自交系 |
| Cab13 | Bulam3ho | Farm Hannong, 韩国 | F1杂交种 |
| Cab14 | CRmatjjang | Farm Hannong, 韩国 | F1杂交种 |
| Cab15 | Chungwang | Sakata Korea, 韩国 | F1杂交种 |
| Cab16 | Yeoleum-wanggug | Nongwoo Bio, 韩国 | F1杂交种 |
| Cab17 | Huángjīn bǎi cài HV-472 | Known-You, 台湾 | F1杂交种 |
| Cab18 | Shāndōng dà bái cài HV-080 | Known-You, 台湾 | F1杂交种 |
| Cab19 | Jiéqiú bái cài (Lù yáng) HV-019 | Known-You, 台湾 | F1杂交种 |
| Cab20 | Bāo xīn bái cài (yù lǐ) HV-179 | Known-You, 台湾 | F1杂交种 |

**2.2. 热处理与测量**
**2.2.1. 热处理**
播种28天后，具有4-5片真叶的幼苗被移栽到新的育苗盘中，间距加倍（180株/m2）。幼苗随机分配到对照组或热处理组，每组每种处理有17个重复（每组306株）。两组分别放置在不同的温控室中（W 4.0 × L 3.6 × H 3.0 m，Model H-6400，Taiwan Hipoint Corporation，运行温度范围15-40°C，温度控制精度±1.5°C，≥20°C时）。温控室的温度设置为25/20°C（白天/夜间），光照时间为12/12小时。实际温控室条件为：白天/夜间气温25.8 ± 0.2°C/20.8 ± 0.2°C，相对湿度77.0 ± 1.9%/77.0 ± 1.3%，光合光子通量（PPF）平均195.3 ± 14.4 μmol·m?2·s?1（图1A）。每周进行两次浇水，每盘约2升水。从播种后第二周开始，施用营养液（Autopot power nutrients，Autopot Australia Pty., Ltd.，澳大利亚，EC 1.2 dS·m?1）。根据生长介质湿度和植物状况需要额外浇水。

**2.2.2. 测量**
每种基因型的种子播种在70孔育苗盘中（L 550 × W 353 × H 48 mm，7 × 10孔，每平方米360株），并使用商业栽培基质（King Root，Dayi Agritech Co., Ltd.，台湾）。每个基因型播种35粒种子，并在配备LED照明系统的控制生长室中生长28天。生长室温度设置为25/20°C（白天/夜间），光照时间为12/12小时。实际生长条件为：白天/夜间气温25.8 ± 0.2°C/20.8 ± 0.2°C，相对湿度77.0 ± 1.9%/77.0 ± 1.3%，光合光子通量平均195.3 ± 14.4 μmol·m?2·s?1（图1A）。每次浇水约2升溶液。2023年和2024年连续的热浪导致日本市场上主要蔬菜（包括大白菜）的批发到货量减少，价格上升[30]。在之前的控制环境筛选研究中，为了充分区分大白菜的耐热性基因型，也采用了40°C的设定温度[25]，这与本研究采用的方法一致。为了确认两个实验室在主要实验前的热性能是否相当，两个实验室在相同的条件（白天35°C/夜间18°C；12/12小时光照周期，光照时间08:30-20:30）下连续运行了四天（2024年6月3日至7日），且期间没有植物材料。使用数据记录仪以15分钟为间隔持续记录环境条件。分析仅限于稳定阶段的读数（白天10:00-20:30；夜间21:00-07:00），以排除温度上升和下降的过渡期。在稳定的白天期间，第一个实验室记录的平均气温为35.04 ± 0.14°C，第二个实验室为35.00 ± 0.08°C，两者之间的温差为0.04°C。在稳定的夜间期间，第一个实验室记录的平均气温为18.48 ± 0.12°C，第二个实验室为18.87 ± 0.16°C，温差为0.39°C。这两个温差均在制造商规定的温度控制精度范围内（±1.5°C，≥20°C时），确认了两个实验室的热性能几乎相同（图S2）。

环境参数，包括空气温度、根区温度、相对湿度和光合有效辐射（PPF），使用校准的传感器（LightScout Quantum Light传感器和外部土壤温度传感器，Spectrum Technologies, Inc., USA）以及集成温度和湿度传感器的数据记录仪（WatchDog 1,000 Series Micro Stations，Spectrum Technologies, Inc., USA）以30分钟为间隔进行收集。在实验期间，对照组的日/夜平均气温分别为25.0 ± 0.3°C和17.7 ± 0.3°C，而热处理组的日/夜平均气温分别为35.7 ± 0.3°C和31.5 ± 0.1°C。根区温度始终比空气温度低2-3°C，对照组的平均日/夜温度分别为22.3 ± 0.3°C和14.8 ± 0.4°C，热处理环境的平均日/夜温度分别为33.5 ± 0.6°C和29.9 ± 0.4°C。相对湿度水平分别为对照组的70.0 ± 1.5%/73.2 ± 1.6%和热处理组的59.5 ± 2.0%/65.3 ± 0.8%。对照组的平均PPF测量值为195.1 ± 5.7 μmol·m-2·s-1，热处理组的平均PPF测量值为226.8 ± 9.9 μmol·m-2·s-1[20]。设定温度与实测温度之间的偏差——热处理组低于设定温度4.3°C（白天），对照组低于设定温度2.3°C（夜间）——归因于设定温度对实验室性能的影响。在35°C的中间设定温度下进行的预实验监测确认了几乎精确的温度达到（每个实验室分别为35.04 ± 0.14°C和35.00 ± 0.08°C），表明实验室在中间操作条件下的性能非常高准确。在主要实验中观察到的较大偏差与设定温度接近制造商规定的操作范围上限（40°C）和下限（15-40°C；精度±1.5°C）时加热和冷却能力下降一致。因此，所有结果均基于本研究中的实测温度进行解释。

2.2.2 使用多光谱3D扫描仪进行非破坏性表型分析
为了获取非破坏性表型数据，使用了一个表型工作站（TraitFinder，尺寸W 2.5 × L 0.6 × H 2.0 m，Phenospex，荷兰），该工作站配备了双多光谱3D激光扫描仪（PlantEye F600，Phenospex，荷兰）。该工作站与生长室位于同一研究设施内，测量期间的环境温度保持在大约25°C。每次表型分析时，植物直接从生长室转移到相邻的工作站，并在移除后大约5分钟内开始扫描，以尽量减少暴露于测量环境的时间。高通量表型分析在处理开始后的第3天、第5天、第7天、第10天、第12天和第14天进行（图1B）。该系统同时通过LiDAR（中心波长范围935-945 nm）和四个波段的多光谱反射率捕捉3D结构信息：红色（R；624-634 nm）、浅绿色（G；530-540 nm）、蓝色（B；465-485 nm）和近红外（NIR；720-750 nm）。扫描距离固定在0.7-0.8 m，扫描速度为6.7 cm/s，处于制造商规定的有效测量范围（0.4-1.5 m）内。扫描会话使用HortControl软件（Phenospex，荷兰）进行管理。总扫描区域被划分为多个单元，每个单元配置为2行×4列，每个单元的空间尺寸及其起始位置相对于扫描块的左上角进行定义。这种配置确保了所有扫描会话中每个单元与单株植物之间的一致空间对应关系。为了排除插盘基质的影响，在HortControl中定义了一个插盘高度阈值（称为“盆高”），以移除所有位于植物冠层下方的3D点，并设置了一个截止高度以排除冠层上方的点。所有扫描都在实验期间的相似时间段内进行。PlantEye F600系统采用3D线扫描和多光谱成像技术，设计为能够在不受环境光照条件影响的情况下独立工作，内置的R、G、B和NIR LED光源在每次扫描过程中提供固定工作距离的直接照明（Phenospex，荷兰）。该系统经过工厂校准，并配备了内部温度控制功能。制造商报告称，在完全黑暗条件和2,530 μmol·m-2·s-1的直射 sunlight 下，测量的RMSPE（均方根百分比误差）仅为0.96%，表明其对环境光变化不敏感（Phenospex，荷兰）。正如Agarwal等人[31]报告的那样，这种设计消除了会话之间进一步光谱校正的需要，支持整个研究期间光谱参数的跨时间比较。操作员在每次扫描后通过视觉检查渲染的3D输出来评估点云质量。对于由于冠层覆盖不完整或传感器遮挡而被认为不充分的扫描，会重新进行扫描，以确保只有质量可接受的扫描被保留用于分析。原始点云数据随后使用Phena软件（Phenospex，荷兰）通过包含坐标转换、植物分割、网格三角化、冠层分割、数据合并和参数计算在内的六阶段流程进行处理。Phena自动计算了形态-光谱参数，包括3D叶面积、投影叶面积、数字生物量、植物高度（最大和平均）、冠层光穿透深度、归一化植被指数（NDVI，(NIR - R)/(NIR + R)）、归一化叶绿素指数（NPCI，(R - B)/(R + B)）和绿叶指数（GLI，(2 × G - R - B)/(2 × G + R + B）（图1D）。处理后的数据以逗号分隔值（.csv）文件格式输出，每个植物每个扫描时间点对应一行，随后导入R软件（版本4.4.2，R Foundation for Statistical Computing，维也纳，奥地利）进行统计分析。参数的完整定义和计算方法见补充表S1。

2.2.3 视觉评估
在处理开始后的第3天、第7天、第11天和第14天，进行了视觉评估，以评估热应对应对大白菜幼苗的影响。评估采用了Shi等人[25]描述的方法基于的5点评分标准（图2）：
-5：正常幼苗，无明显热损伤症状
-4：轻微损伤，受影响的叶片少于总叶片数的1/3
-3：中度损伤，受影响的叶片占总叶片数的1/3到1/2
-2：严重损伤，受影响的叶片占总叶片数的1/2到2/3
-1：极端损伤，受影响的叶片超过总叶片数的2/3或植株死亡

2.2.4 光合气体交换测量
使用LI-6800便携式光合系统（Li-Cor Biosciences，Lincoln，NE，美国）在处理后第1周（第6-7天）和第2周（第13-14天）测量了光合气体交换参数（图1B）。所有测量都在09:00至16:00之间进行。每个基因型的三株植物中最年轻的完全展开的叶片（第三或第四片叶子）被用于测量。气体交换分析期间的测量条件严格控制：叶片室温度与相应的生长条件相匹配（对照组25°C，热处理组40°C），其他参数标准化如下：光照强度为300 μmol·m-2·s-1（内置LED光源），参考CO2浓度为460 μmol·mol-1，相对湿度为60-65%，气流速率为500 μmol·s-1。稳定3-5分钟后，记录了净同化率（A）、蒸腾率（Tr）、细胞间CO2浓度（Ci）和气孔导度（gsw）。

2.2.5 破坏性测量
在第10天，每个处理组的三株植物被收获用于破坏性分析（图1B）。将植株和根系在根-下胚轴连接处分离，并立即记录茎的鲜重。单个叶片和完整的根球在标准化成像环境中使用photobox（L 63 × W 63 × H 63 cm，Z60 LED，ZENITH，台湾）和顶置LED照明仔细提取并拍照。高分辨率数字图像在标准化照明条件下使用固定位置的数字相机捕捉。图像处理和分析使用ImageJ Fiji软件（版本1.54f，校准比率为3025像素：1 cm2）进行，以量化总叶面积和根表面积。清洗后测量根的鲜重。然后将样品在80°C的强制对流烤箱（Double-Doors Oven，Chaoli Technology Corp.）中烘干48小时，以便测定干重。非破坏性地估计叶片叶绿素含量使用了SPAD仪（SPAD-502Plus，Konica Minolta，日本）。在每株植物的三片完全展开的叶片上的三个位置进行测量，取平均值以获得每个植物的代表性SPAD读数。

2.3 统计分析
所有统计分析均使用R软件（版本4.4.2，R Foundation for Statistical Computing，维也纳，奥地利）进行。双向ANOVA检验了基因型、处理及其交互作用对每个参数的影响。对所有测量参数的中心化和标准化数据应用了PCA分析。PCA分析中包含了所有的形态和光谱参数，保留了前三个主成分（PC1、PC2、PC3），因为它们一致解释了所有时间点超过75%的总方差。这种选择通过Scree图检查得到了验证。使用以下公式计算每个时间点处理组质心之间的距离（ΔC）：
其中（x1, y1）和（x2, y2）是PC1-PC2空间中对照组和热处理组质心的坐标。
每个基因型在整个处理期间对照组和热处理组样本之间的平均PC距离（D）确定为：
其中PC1h、PC2h、PC3h表示热处理组的平均PC得分，PC1c、PC2c、PC3c表示对照组的平均PC得分。在此计算中，三个主成分的权重相同，以捕捉热应激反应的多维性质。使用K均值聚类（k=3到5）对基因型进行分类，通过肘部方法确定最佳聚类数量。PC1–PC3解释的方差和每个时间点的K均值聚类结果的完整细节见补充表S2。表型特征与实际测量值之间的关系使用Spearman相关系数（r）进行分析。所有图形表示均使用R软件创建。

3. 结果
3.1 热应激损伤的视觉评估
在整个14天的处理期间使用5点评分标准评估视觉分数（图2），分数范围从5（无可见热损伤）到1（>2/3的叶片受损或植株死亡）。与对照组植物相比，热应激显著降低了视觉分数（p<0.001，图3A）。对照组植物的分数在整个实验期间保持在4.30到4.96之间，而热应激植物的分数从处理后的第3天（DAT）的4.55±0.04下降到第14天的3.96（图3A）。

图3. 热应激的视觉和形态反应：(A) 对照组和热处理组视觉分数的时间动态；(B) 四个基因型的形态反应。***表示显著性p < 0.001。
热应激在最初的3-5天内导致下部叶片迅速变黄和脱落，分数降至4范围内（轻微应力：<1/3的叶片受影响）。然而，没有植株死亡，所有基因型的分数均保持在3以上，表明损伤保持在轻微到中度范围内。个体基因型轨迹显示出显著差异，有些基因型的得分始终接近4.5，而有些则在14天后下降到4.0以下，这表明不同基因型之间的耐热性存在差异（图3B）。代表性基因型表现出不同的视觉反应。Ccab10（Wongyo20048ho）虽然叶片黄化程度较低，但仍保持了相对紧凑的叶片结构并较好地保持了叶色。Ccab13（Bulam3ho）表现出较低的叶片褪色现象，并伴有部分落叶，证实了生物量的减少。Ccab17（HV-472）的叶片黄化和萎蔫现象最为明显。Ccab03（Wongyo20036ho）在对照条件下也显示出褪色症状，但在热应力下仍保持了生物量（图3B）。

3.2 温度应力下的生长和生物量响应
3.2.1 生长参数的方差分析
双因素方差分析显示，所有测量参数都受到了基因型的显著影响（p<0.001，表2），表明18个中国白菜基因型之间存在显著的遗传变异。热处理显著影响了茎鲜重（M_SFW）、根鲜重（M_RFW）、总鲜重（M_FW）、茎干重（M_SDW）、根干重（M_RDW）、根面积（P_RA）以及单位面积叶质量（LMA）（p<0.001），还包括干物质含量（DM）（p<0.05）。值得注意的是，叶片数量（M_NL）和叶片面积（P_LA）并未受到热应力的显著影响。基因型与热处理的交互作用在M_SFW、M_FW和LMA（p<0.01）以及DM（p<0.05）上显著存在，证实了基因型的特异性响应。

表2. 热处理10天后中国白菜基因型破坏性生长参数的方差分析结果

变量 基因型 热处理 交互作用
M_SFW（茎鲜重） < 0.001 *** z< 0.001 ***
M_RFW（根鲜重） < 0.001 *** < 0.001 ***
M_FW（鲜重） < 0.001 *** < 0.001 ***
M_SDW（茎干重） < 0.001 *** < 0.001 ***
M_RDW（根干重） < 0.001 *** < 0.001 ***
M_DW（干重） < 0.001 *** < 0.001 ***
M_NL（叶片数量） < 0.001 *** 0.277
P_LA（叶片面积） < 0.001 *** 0.252
P_RA（根面积） < 0.001 *** 0.320
DM（干物质含量） < 0.001 *** 0.029 *
LMA（单位面积叶质量） < 0.001 *** 0.002 *

*、** 和 *** 分别表示在p < 0.05、p < 0.01和p < 0.001水平上的显著性。

3.2.2 热应力下的生物量减少模式
热处理在10天后显著降低了大多数生长参数（图4A）。茎鲜重从5.59克（对照组）下降到4.47克（处理组），减少了20%。根鲜重从1.03克减少到0.55克（减少了47%）。同样，茎干重从0.71克减少到0.57克（减少了20%），而根干重从0.08克减少到0.05克（减少了38%）。总鲜重和干重的变化趋势相似。

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图4. 热处理10天后中国白菜基因型的生长情况。(A) 处理效应，(B) 基因型比较。数值为平均值±标准误差。
无论处理如何，叶片数量保持在8-9片，叶片面积变化很小（147-152平方厘米），这表明热应力主要影响了生物量的积累而不是叶片的起始或扩展。根面积显著减少，从64.0平方厘米减少到41.8平方厘米（减少了35%）。
基因型比较显示出了应对压力的显著差异（图4B）。一些基因型（例如Ccab03）在热应力下保持了相对较高的生物量，而其他基因型（例如Ccab17）则表现出更明显的减少，这表明它们具有不同的耐热机制。
一个关键发现是根生物量的减少幅度相对于茎生物量来说更大（38-47%），这表明根系可能对实验中的热应力条件特别敏感，尽管其背后的机制仍有待进一步研究。根区温度（白天/夜间33.5/29.9°C）比空气温度（35.7/31.5°C）低2-3°C，这意味着根生物量的相对减少不能仅归因于直接的热暴露，可能还反映了如碳分配模式的变化或热引起的茎和根系之间激素信号传递的障碍。这种差异性响应对植物在热应力条件下的水分和养分吸收有重要影响。

3.3 光合作用对热应力的响应
14天后的气体交换测量显示，所有基因型都对热应力产生了显著的生理响应（图5）。热处理使蒸腾速率从0.001摩尔·平方米·秒增加到0.004摩尔·平方米·秒（增加了四倍）。净光合速率从7.11微摩尔·平方米·秒降低到4.84微摩尔·平方米·秒（减少了32%）。

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图5. 热处理14天后中国白菜基因型的光合作用特性。(A) 处理效应，(B) 基因型比较。数值为平均值±标准误差。
值得注意的是，热应力下的细胞间CO2浓度（Ci）从对照组的305.8微摩尔·摩尔-1增加到热处理组的356.7微摩尔·摩尔-1。水分利用效率受到严重影响，从对照组的8,760微摩尔CO2·毫米-1 H2O降低到热处理组的1,388微摩尔CO2·毫米-1 H2O（减少了84%）。
基因型比较显示出了不同的生理策略。商业品种（Ccab13-20）在对照条件下通常表现出较低的蒸腾速率，但在热应力下Ci显著增加，表明它们对光合作用代谢限制更敏感。一些基因型（例如Ccab14、Ccab17）的光合作用显著降低（约为1微摩尔·平方米·秒），同时Ci升高，表明二氧化碳固定能力完全受损。

3.4 非破坏性形态和光谱参数的时间动态
在整个14天的处理期间进行了非破坏性表型测量，以表征形态和光谱参数的时间响应。对代表性基因型的分析显示，基因型在热应力下的响应模式和适应动态存在显著差异。
10天后的表型参数方差分析显示，基因型、处理及其交互作用对大多数参数都有显著影响（p<0.001，表3）。特别是形态参数（包括3D叶面积P_3DLA、数字生物量P_DB、植株高度P_PH）和光谱参数（包括GLI、亮度和NDVI）的交互作用非常显著，证实了基因型对热应力的特异性响应。

表3. 热处理10天后中国白菜基因型形态和光谱参数的方差分析结果

变量 基因型 热处理 交互作用
P_3DLA（3D叶面积） < 0.001 *** z< 0.001 ***
P_DB（数字生物量） < 0.001 *** < 0.001 ***
P_PH（植株高度平均） < 0.001 *** 0.276
P_LPD（冠层光穿透深度） < 0.001 *** 0.405
P_CH（凸包面积） < 0.001 *** 0.001 ***
P_S（饱和度平均） < 0.001 *** 0.038 *
P_SA（表面角度平均） < 0.001 *** 0.067
P_VV（体素体积总） < 0.001 *** 0.001 ***
P_GLI（GLI平均） < 0.001 *** 0.222
PHLT（亮度平均） < 0.001 *** 0.001 ***
P_NDVI（NDVI平均） < 0.001 *** 0.001 ***
P_NPCI（NPCI平均） < 0.001 *** 0.313
P_PSRI（PSRI平均） < 0.001 ***
*、** 和 *** 分别表示在p < 0.05、p < 0.01和p < 0.001水平上的显著性。
对代表性基因型的时间表型分析显示了不同的响应模式（图S3）。形态参数表现出渐进性变化。对照组的3D叶面积在14天时增加到10,000-30,000平方毫米，其中Ccab17的值最高。在热应力下，大多数基因型的叶片扩展受到抑制。然而，Ccab03表现出矛盾的响应，在14天时其叶面积与对照组相当或更大（约25,000平方毫米），与其异常的生长响应一致。
光谱指数提供了补充的生理信息。不同基因型的NDVI模式有所不同。Ccab10在两种处理条件下都保持了较高的稳定值（约0.6），表明其叶绿素含量持续。Ccab03在热应力下第3-7天的NDVI逐渐增加，随后稳定在0.4-0.45。Ccab13和Ccab17的NDVI逐渐下降，其中Ccab17的NDVI从0.53下降到0.47。
PSRI显示了时间上的衰老模式。Ccab10在两种处理条件下都保持了较低的PSRI值（约0.08），表明其衰老程度很小。其他基因型的PSRI动态变化较大，可能反映了复杂的应力-发育相互作用。
表面角度测量表明热应力下叶片结构发生了改变。Ccab17的表面角度显著下降，反映了叶片更加直立的姿态，而其他基因型的表面角度值相对稳定，表明在所施加的热条件下的结构重组不明显。时间表型分析表明，基因型差异随着时间的推移变得越来越明显，特别是在10-14天时差异最大，这表明筛选耐热性需要较长的评估期来捕捉累积的压力效应。为了全面评估所有18个基因型的热应力响应和耐受水平，我们使用了PCA来整合整个处理期间的多个表型维度。

3.5 PCA和定量应力评估
3.5.1 时间响应的PCA
对14个形态和光谱特征的PCA分析显示，处理期间对照组和热处理组的中国白菜幼苗之间有明显的分化（图6A）。处理组之间的分离在3天时最为明显（ΔC = 3.27），并在12天时仍然明显（ΔC = 2.82），直到14天时显示出潜在的适应（ΔC = 1.41）。由于本研究没有进行处理前的基线扫描（0天），3天时的ΔC值代表最早观察到的表型分离，而不是从确认的相同处理前基线发生变化；因此无法完全排除任何已存在的基因型间变异的贡献。

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图6. PCA揭示的热应力响应的时间动态及参数贡献。(A) 处理期间对照组（蓝色圆圈）和热处理组（红色三角形）植物的形态和光谱特征的PCA。(B) 从第3天到第14天参数贡献对热应力响应的时间变化。水平红色虚线表示参数贡献的显著性阈值。形态特征包括：P_3DLA（3D叶面积）、P_DB（数字生物量）、P_PH（植株高度平均）、P_LPD（冠层光穿透深度）、P_CH（凸包面积）、P_SA（表面角度平均）；光谱特征包括：P_GLI（GLI平均）、P_Hue（色调平均）、P_LT（亮度平均）、P_NDVI（NDVI平均）、P_NPCI（NPCI平均）、P_PSRI（PSRI平均）。
前两个主成分（PC）始终解释了62-68%的总方差。PC1解释了36.2-45.7%的方差（取决于时间点），主要与形态特征相关，包括3D叶面积、数字生物量和植株高度。PC2解释了20.4-30.8%的方差，并与光谱参数（如NDVI、NPCI和PSRI）密切相关。PC1-PC3解释的累积方差在所有扫描时间点范围内从77.7%（14天）到85.7%（12天）（表S2）不等，证实了三维PC空间捕捉了整个处理期间的表型变化的主要轴线。

3.5.2 随时间变化的参数贡献
参数贡献的分析揭示了热应力响应的两个不同阶段（图6B）。在早期响应阶段（3-5天），形态参数主导了处理组之间的分离，数字生物量、色调值和NDVI是主要贡献因素（ each超过10%）。这解释了3天时观察到的最大ΔC值（3.27），表明初始的应力响应主要通过植物形态的变化表现出来。
随着处理期的进展，特征的相对重要性发生了变化。在后期阶段（10-14天），光谱指数变得更加重要，NDVI、色调和PSRI成为主要的贡献因素（each超过11%）。

3.5.3 使用PC距离的定量评估
三维PC空间（PC1-PC3）中的欧几里得距离提供了应力响应的定量度量（图7）。K均值聚类平均PC距离确定了三个热响应组：
- 第1组（低应力响应，n=9）：Ccab05、Ccab06、Ccab07、Ccab08、Ccab09、Ccab10、Ccab13、Ccab14、Ccab20，平均PC距离为2.2-3.2。这些基因型的表型偏离对照组最小。
- 第2组（中等应力响应，n=7）：Ccab01、Ccab02、Ccab03、Ccab04、Ccab15、Ccab18、Ccab19，距离为3.8-4.7，表现出中等的表型变化。
- 第3组（高应力响应，n=2）：Ccab16、Ccab17，距离为5.0-5.4，表现出显著的表型改变。

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图7. 基于PCA的中国白菜基因型特异性热应力适应模式。(A) 根据所有时间点的平均PC距离对中国白菜基因型的K均值聚类，显示了三个不同的热响应组（第1组：低应力，第2组：中等应力，第3组：高应力）。(B) 14天处理期间基因型特异性PC距离的时间分析，显示了多样的适应轨迹。

3.5.4 时间动态和基因型特异性模式
时间分析显示了多样的响应模式（图7B、S4、S5）。低响应基因型（例如Ccab10、Ccab09、Ccab08）在整个处理期间始终保持较短的PC距离，表明表型轮廓稳定。一些基因型表现出动态响应。Ccab20最初距离较长，但在14天时显著缩短。相反，Ccab05和Ccab17的距离逐渐增加。
基因型在不同时间点之间的迁移（图S5) 描述了响应动态。几个基因型（Ccab10、Ccab08、Ccab09） consistently 出现在短距离集群中（蓝色/绿色），表明其表现稳定。其他基因型则显示出显著的转变。Ccab20 在第3天从中等距离集群（红色）转移到了后来的短距离集群（蓝色/绿色）。Ccab03 则表现出相反的模式，在第14天迁移到了长距离集群。

3.6. 通过破坏性测量验证基于PCA的分类方法
为了验证基于PCA的分类方法，我们比较了三个稳定性组之间的生长和表型参数的减少百分比（图S6）。这项分析测试了表型稳定性（通过PCA距离衡量）是否与实际的抗逆性（通过生物量保留衡量）相关。

3.6.1. 生长和生物量参数验证
表型稳定性与生物量保留之间明显相关（图S6A）。第1组（最稳定，PC距离较低）显示出最小的减少，茎鲜重减少了17.9%，茎干重减少了15.9%，叶面积减小了17.3%。第3组（最不稳定，PC距离较高）显示出更大的减少，茎鲜重减少了30.4%，茎干重减少了31.2%，叶面积减小了27.5%。减少率的逐步增加表明表型稳定性指标与实际生长表现之间有很强的一致性和相关性。

根生物量在所有组中都大幅减少，且表现出不同的模式。根鲜重的减少幅度分别为：第1组（37.4%），第2组（43.2%），第3组（47.4%）。根干重的减少幅度也相似，分别为45.6%、45.0%和56.1%。值得注意的是，即使是最高稳性的基因型（第1组）的根鲜重减少也超过了37%，这证实了根系普遍容易受到损害，无论其整体的抗逆性如何。根与茎之间的差异显著（37-56% vs 16-31%），突显了一个基本的生理限制。

3.6.2. 表型参数验证
表型参数验证了分类结果，同时揭示了各参数的敏感性（图S6B）。3D叶面积的减少幅度依次为：第1组10.2%，第2组15.8%，第3组20.5%，表明稳定基因型能更好地维持叶片扩展。数字生物量的减少幅度最小（分别为3.6%、7.4%、14.5%），尽管仍符合预期模式。与实际生物量相比，数字生物量的减少幅度较小，说明3D成像更多地捕捉到了冠层体积而不是组织密度。表面角度的减少幅度最大（分别为第1组21.7%、第2组29.3%、第3组43.7%），这是最敏感的表型指标。第3组43.7%的显著减少表明敏感基因型的冠层结构发生了较大变化。

光谱指数在不同稳定性组中的表现逐渐恶化。NDVI的减少幅度从第1组的7.6%增加到第3组的24.7%。GLI的减少幅度也很大，第1组为17.2%，第2组为24.1%，第3组为36.5%，这意味着第3组的绿色组织损失超过了第1组的两倍，证实了敏感基因型的严重损伤情况。

这种验证表明，PCA距离能有效按耐热性对基因型进行分层，因为从表型数据得出的稳定性组能够强烈预测生物量表现。该方法成功整合了多种表型维度，捕捉到了形态和光谱响应。

3.7. 非破坏性与破坏性参数之间的相关性
在10天时对非破坏性和破坏性参数进行的相关性分析揭示了有意义的关系（图8）。3D叶面积与茎鲜重之间存在强正相关（r>0.8），证实了非破坏性评估的可靠性。数字生物量也与生物量参数有类似强的相关性。

图8. 在热处理后10天，中国白菜中破坏性参数与非破坏性参数之间的相关矩阵。与光合作用相关的参数使用了热处理后7天收集的数据。蓝色圆圈表示正相关，红色圆圈表示负相关，圆圈的大小和颜色强度代表相关性强弱（范围从-1到+1）。上方以“M”开头的特征表示热处理结束后的实际测量值，包括茎鲜重（M_SFW）、根鲜重（M_SDW）、鲜重（M FW）、干茎重（M_SDW）、干根重（M_RDW）、叶片数量（M_NL）、SPAD值（M_SPAD）、视觉评分（M_VS）、净同化率（M_A）、细胞间CO2浓度（M_Ci）、气孔导度（M_SC）和蒸腾速率（M_TR）。下方以“P”开头的特征是通过TraitFinder系统和RGB相机（以及Image J）测量的特征。形态特征包括：P_3DLA（3D叶面积）、P_DB（数字生物量）、P_PH（植株高度平均）、P_LPD（冠层光穿透深度）、P_CH（凸包面积）、P_SA（表面角度平均）；光谱特征包括：P_GLI（GLI平均）、P_Hue（色调平均）、P_LT（亮度平均）、P_NDVI（NDVI平均）、P_NPCI（NPCI平均）、P_PSRI（PSRI平均）。

NDVI显示出选择性相关性，与叶绿素含量（M_SPAD值，r = 0.72）、视觉评分（M_VS，r = 0.60）和色调值（P_Hue，r = 0.93）呈正相关，而与亮度（P_LT，r = 0.71）呈负相关。然而，NDVI与生物量参数的相关性有限，表明其主要作用是作为色素状态的指标，而不是热应激下的直接生物量生产指标。视觉评分（M_VS）与多个光谱指数表现出显著正相关，包括GLI（r = 0.57）、色调（r = 0.58）和NDVI（r = 0.60），与PSRI（r = 0.45）呈负相关，表明光谱指数能够体现与人类视觉评估一致的热应激严重程度。热应激下的视觉评分变化（范围从3.96到4.55）与这些光谱指数的可测量变化相关，表明即使是轻微到中度的视觉损伤也能通过基于图像的光谱测量检测出来。

根鲜重和干重与饱和度（P_Saturation）和GLI（P_GLI）有强正相关，表明这些光谱指数可能作为地下生物量积累的指标。蒸腾速率与包括茎鲜重和干重在内的生物量测量值呈负相关。有趣的是，地上症状的视觉评分也与基于图像的根表面积估计有显著正相关（P_RA，r=0.59），表明可见的地上症状反映了根系的健康状况。这表明通过视觉评分捕捉到的地上症状可以指示植物的整体应激状态，包括根系状况。

在10天时，3D衍生的叶面积（P_3DLA）与破坏性测量的叶面积（P.LA）之间的回归分析显示了整体数据集上的显著正相关（y = 61.8x + 6973，R2 = 0.447，p < 0.001；n = 34；图S7）。在对照条件下，这种相关性更强（y = 84.9x + 6322，R2 = 0.861，p < 0.001；n = 16），而在热应激条件下相关性较弱（y = 47.9x + 6618，R2 = 0.538，p < 0.001；n = 18）。热应激下较低的R2与热引起的冠层结构变化一致，包括叶片脱落减少和上部叶片方向改变，这些变化改变了自上而下扫描捕获的叶片表面积的比例。热应激下较低的相关系数（47.9 vs 84.9）表明P_3DLA在热处理植物中对P.LA的低估程度更大，反映了与冠层重组相关的叶片遮挡增加。这些结果证实P_3DLA提供了一个有效的相对叶面积测量方法，适用于不同基因型和处理的比较分析，而绝对值应结合自上而下扫描的几何特性进行解释。

基于图像的根表面积分析显示出作为快速、非破坏性工具的巨大潜力，可以量化根面积，与根鲜重（R2 = 0.698，p<0.001）和根干重（R2 = 0.501，p<0.001）在处理间有强相关性（图S8）。在对照条件下，根面积能有效预测根生物量（FW的R2 = 0.52，DW的R2 = 0.33）。热应激减弱了处理内的相关性（FW的R2 = 0.28，DW的R2 = 0.14），但持续的相关性和明显的处理组分离验证了基于图像的根表面积分析在基因型筛选中的有效性。

3.8. 结合热稳定性和生长表现进行基因型选择
通过结合热稳定性（PC距离）和生长表现（生物量），我们将18个基因型分为四组（图9）。基因型根据其PC距离分类（第3.5.3节中的组1-3）和热应激下的相对生物量保持情况进行了分类。

- 响应模式1（表型稳定且生物量保留高）：几个基因型在热应激下表现出优异的表型稳定性和高生物量生产。该组包括Ccab5（Wongyo20038ho）、Ccab13（Bulam3ho）、Ccab14（CRmatjjang）和Ccab20（HV-179），它们在热应激下表现出高稳定性和高生物量（平均PC距离2.76，平均DW 0.77克）。
- 响应模式2（表型稳定但生物量保留低）：另一个不同的组表现出优异的表型稳定性，但生物量较低。该组包括Ccab6（Wongyo20039ho）、Ccab7（Wongyo20042ho）、Ccab8（Wongyo20045ho）、Ccab9（Wongyo20046ho）和Ccab10（Wongyo20048ho），它们在热应激下表现出优异的稳定性但生物量生产较低（平均PC距离2.54，平均DW 0.5克）。
- 响应模式3（表型可塑但生物量保留高）：相比之下，一些基因型表现出显著的表型变化，但仍保持了相对较高的生物量生产。该组包括Ccab1（Wongyo20034ho）、Ccab3（Wongyo20036ho）、Ccab16（Yeoleum-wanggug）、Ccab18（HV-080）和Ccab19（HV-019），尽管结构发生了显著变化，但在热应激下仍实现了中等到高的生物量生产（平均PC距离4.54，平均DW 0.68克）。
- 响应模式4（表型可塑且生物量保留低）：最脆弱的组表现出显著的表型不稳定性以及在热应激下生物量生产很低。该组包括Ccab02（Wongyo20035ho）、Ccab04（Wongyo20037ho）、Ccab15（Chungwang）和Ccab17（HV-472），它们在热应激下表现出较差的结构稳定性和低生物量生产（平均PC距离4.46，平均DW 0.51克）。

图9. 根据欧几里得距离（ED）和热应激下的总干重对基因型进行分类。ED代表热应激下的多变量表型稳定性，是根据PCA空间中的14个表型参数计算得出的。中位线：ED = 3.51，DW = 0.59克。

4. 讨论
4.1. 中国白菜苗的热应激响应：传统方法
4.1.1. 视觉评估和生物量减少模式
传统的破坏性采样和视觉评估显示，在14天的热处理期间，中国白菜苗的生长受到了严重影响。视觉评分显示，在35.7/31.5°C（白天/夜晚）的测量热处理条件下，植物状况持续下降（p<0.001），对照组的评分为4.30-4.96，而热应激组的评分下降到3.96。这种视觉下降伴随着特征性症状，包括叶片逐渐变黄、下部冠层的脱落以及与先前研究[32]、[33]中记录的热应激响应一致的老化现象。生物量测量显示，热应激对茎系统和根系统的影响存在显著差异，这与多种作物物种的观察结果一致[11]。虽然茎鲜重在热应激下减少了大约20%，但根鲜重的减少幅度更大，达到了47%，表明根生物量的减少相对于茎生物量更为严重。根面积也大幅减少（从64.0 cm2减少到41.8 cm2），表明热诱导的损害不仅包括根生物量的减少，还包括根系结构和吸收能力的改变。

根和茎系统之间的这种不同响应反映了多种相互关联的生理过程。尽管根区温度（33.5/29.9°C白天/夜晚）比空气温度（35.7/31.5°C）低2至3°C，但根生物量的更大减少表明间接机制可能对根的响应有重要贡献。这些包括由于热损伤导致的光合作用减弱，以及热应激下碳优先分配给茎，以及热诱导的调节根发育的激素信号通路的紊乱。由此导致的根功能受损进一步限制了茎的水分和养分供应，形成了一个循环，即退化的根逐渐无法满足地上部分的需求[9]、[11]、[34]。

4.1.2. 光合作用响应和非气孔限制
在14天时进行的气体交换测量显示，在35.7/31.5°C（白天/夜晚）的测量热处理条件下，光合作用响应复杂且生理上矛盾。净光合作用减少了大约32%（从7.11 μmol·m-2·s-1减少到4.84 μmol·m-2·s-1），表明碳同化能力大幅受损。然而，这种光合作用的下降伴随着蒸腾速率增加了四倍（从0.001 mol·m-2·s-1增加到0.004 mol·m-2·s-1），以及细胞间CO2浓度（Ci）从305.8 μmol·mol-1增加到356.7 μmol·mol-1。这种模式与在水分充足的热应激条件下预期的体温调节响应一致。测量的35.7°C处理温度远超过了作物的生长障碍阈值25°C，并且不同于通常在干旱-热应激条件下观察到的气孔关闭响应。在水分充足的条件下，白菜似乎更倾向于通过增加蒸腾作用来降低叶片温度，而不是维持光合作用效率，这种体温调节策略之前已在耐热作物中得到研究[8]、[32]。尽管气孔开放度增加，但细胞内二氧化碳浓度仍升高，这表明非气孔限制在热应激反应中起着关键作用。这种现象表明，二氧化碳的可用性并不是限制因素，而是光合作用机制本身，特别是RuBisco激活酶和Calvin循环酶，在高温下会受到损害[5]。细胞内二氧化碳的积累可能是由于碳固定能力下降以及光呼吸和呼吸作用增强共同造成的[6]。热应激严重影响了水分利用效率，下降了84%（从8,760 μmol CO2·mmol-1 H2O降至1,388 μmol CO2·mmol-1 H2O），反映了利用蒸腾作用作为体温调节机制的代价。这种显著的权衡突显了白菜幼苗在水分充足条件下适应热应激时所面临的生理限制。光合作用反应的遗传变异也很明显，一些商业品种（如Ccab13-20）在热应激下表现出更明显的二氧化碳浓度增加。

4.2. 表型技术作为辅助工具：相关性分析和验证
4.2.1. 通过相关性分析验证非破坏性参数
我们对非破坏性表型参数和破坏性测量结果之间的相关性分析提供了强有力的证据，证明基于图像的表型分析可以有效地替代或补充传统的筛选方法[16]、[35]、[36]。使用PlantEye F600扫描仪获得的3D叶面积测量结果与对照组和热应激组中的地上部分新鲜重量之间显示出非常强的正相关性（r > 0.8），这验证了基于图像的形态学评估的实用性。同样，数字生物量也与实际生物量测量结果具有很强的相关性。特别值得注意的是，基于图像的根表面积估计值与实际根新鲜重量（R2 = 0.698, p<0.001）和根干重量（R2 = 0.501, p<0.001）在各种处理之间也有很强的相关性。这一发现对于高通量育种应用具有重要意义，因为它表明可以从完整的根球表面图像快速量化根系发育情况，而无需传统的费力挖掘和测量程序。

4.2.2. 表型参数作为胁迫指标：相对于传统方法的优势
结合形态学和光谱表型参数的方法相比传统的破坏性测量方法具有几个关键优势。基于图像的表型分析能够快速、无损地评估大量植物群体，无需进行收获和破坏性分析，从而根本加快了育种周期的效率。单次3D多光谱扫描可以在不到一分钟的时间内同时捕获多个形态学和光谱参数，包括3D叶面积、植株高度、表面角度以及多个光谱指数（NDVI、PSRI、GLI、Hue、Saturation、Lightness），而传统的破坏性取样和分析则需要花费数小时的时间[37]、[38]。这些非破坏性参数与破坏性生物量测量结果之间的强相关性验证了它们作为热耐受性筛选指标的可靠性。此外，形态学和光谱数据的结合可以提供互补的生理信息：形态学参数反映了生长和结构变化，而光谱指数则揭示了色素状态和衰老过程的信息。这种双重视角的分析比任何单一测量方法都能提供更全面的表型特征[39]、[40]。

在表型参数中，表面角度对热应激的反应最为显著，稳定基因型的表面角度减少幅度从21.7%到敏感基因型的43.7%不等，证实了这一参数是热应激严重程度的最敏感指标。在中国白菜中，热应激会导致下部叶片迅速萎蔫并脱落，而上部叶片则趋于更加垂直的姿态，这两种变化共同导致平均表面角度的净减少。这种结构重组反映了热诱导的下部叶片退化与上部叶片适应性调整以减少直接辐射截获的结合，涉及多种生理反应，包括水分状态、细胞膨压维持和辐射管理，这些都可以通过非破坏性的3D扫描快速捕捉到。

光谱指数，尤其是GLI，在不同稳定性组中显示出渐进性的恶化趋势（第1组的减少量为17.2%，第3组为36.5%），其中第3组的减少量是第1组的两倍多，表明光谱参数能够有效区分不同基因型的热耐受性程度[41]。高通量表型方法在评估热耐受性方面的验证代表了方法学上的重要进展，并可直接应用于育种计划。基于图像的特征与传统破坏性测量结果之间的一致性与其他作物物种的最新研究结果相符，证实了这种方法的广泛应用性[23]。这使得使用传统方法可以筛选更大的植物群体，同时保持测量的准确性[17]、[42]、[43]。

4.2.3. 光谱指数作为生理指标：NDVI、GLI和PSRI在热应激下的表现
虽然NDVI常被用作光合作用能力的代理指标[44]，但我们的研究结果表明，在热应激条件下，NDVI与实际生长表现之间的关系比通常假设的更为复杂。NDVI与叶绿素含量（SPAD值，r = 0.72）和视觉评分（r = 0.60）之间存在强相关性，表明NDVI能够准确反映色素状态和植物的整体健康状况。然而，NDVI与生物量参数之间的直接相关性有限，这表明其在热应激下的主要作用是作为色素含量的指标，而不是直接的光合产物生产能力指标。这种差异可能与能量分配到胁迫保护机制而非生长有关，或者是在光合机制保持不变的情况下碳分配受到阻碍[46]、[47]。这突显了整合多种互补的光谱和形态学参数的重要性，而不是依赖于单一指数来进行全面的热耐受性评估。

4.3. 热耐受性的综合评估：基于PCA的分类
4.3.1. PCA作为多维度表型评估的整合框架
将PCA应用于14个形态学术和光谱特征表明，PCA能够有效地整合热应激响应的复杂多维特性，这些特性无法通过单一特征来描述[20]、[21]、[23]、[48]、[49]。前两个主成分一致解释了62-68%的总变异，其中PC1解释了36.2-45.7%（主要与形态学术特征相关），PC2解释了20.4-30.8%（与光谱参数更相关）。值得注意的是，与相同条件下评估的辣椒幼苗相比，白菜在热应激下的表型差异显著更大[20]。在PCA空间中，对照组和热处理后的白菜植株在3天时表现出最大的分离（ΔC = 3.27），随后逐渐减小（12天时ΔC = 2.82，14天时ΔC = 1.41），表明初始应激反应迅速且随后发生了适应。相比之下，辣椒幼苗的分离距离明显较小，最大分离发生在10天时（ΔC = 2.05）。这种不同的响应模式反映了它们在热耐受性方面的生理差异。辣椒的较高温度适乐期（25-30°C）为其提供了更宽的热缓冲范围，而白菜的温度适乐期较低，因此在暴露于40/35°C时表现出快速的表型分化。这种差异说明了物种特定的热偏好如何从根本上影响热应激响应模式的强度和动力学。

4.3.2. 欧几里得距离作为表型稳定性的定量度量
三维主成分空间（PC1-PC3）中的欧几里得距离为评估基因型间的热应激响应严重程度提供了可靠的定量指标。K均值聚类分为三个不同的表型稳定性组：第1组（低应激响应，n=9，平均PC距离2.2-3.2）、第2组（中等应激响应，n=7，距离3.8-4.7）和第3组（高应激响应，n=2，距离5.0-5.4）。基于PC距离的分类框架与实际生长表现有明确的对应关系。PC距离较短的基因型（第1组）在热应激下表现出更好的生物量保持能力，地上部分新鲜重量仅减少了17.9%，而第3组则减少了30.4%。然而，分析显示表型稳定性和热应激下的生产力是相对独立的指标。所有组别的根生物量减少都很严重（新鲜重量减少了37-56%），但稳定性组之间的差异并不像地上部分反应那样明显。这种稳定性和生产力的独立性揭示了一个关键的生物学见解：稳定性并不总是与更好的生长表现相关。

4.3.3. 基于表型稳定性和生长表现的热应激响应模式
通过结合表型稳定性（PC距离）和生长表现（生物量维持）确定的四个响应组代表了不同的表型模式。表型稳定性和生长表现在不同基因型间并不总是共同变化，这表明它们可能反映了部分可分离的调节机制。这一观察结果与大量文献一致，这些文献表明胁迫耐受性通常伴随着生长率和生产力的权衡[13]、[50]、[51]、[52]，尽管不同基因型之间的权衡程度存在自然差异[53]。不同的响应模式有助于根据特定的生产目标和环境条件进行有针对性的基因型选择。第1组基因型结合了表型稳定性和高生物量保持能力，是为抗热、高产栽培品种进行传统育种的理想候选者。在热应激下同时保持表型稳定性和生产力可能反映了保护机制（如HSPs稳定细胞蛋白和膜）和抗氧化酶系统（SOD、CAT、APX）的限制活性氧（ROS）的协调上调，从而在压力下维持持续的光合作用和碳同化[32]、[59]。这些基因型中积累的适宜溶质（如脯氨酸和可溶性糖）可能进一步有助于渗透调节和膜稳定[13]。第2组基因型虽然在表型稳定性方面表现出色，但在热应激下的生物量生产有限。这些材料可能在临时热应激优先生存的环境中具有价值，或者适用于研究独立于生长反应的稳定性机制的基础研究。表型稳定性与生产力的降低结合可能反映了在热应激下优先考虑细胞保护的策略，资源被重新分配用于胁迫防御机制而非生物量积累。这种资源分配的权衡在多个物种中都有记录[50]、[51]。

第3组基因型在保持生产力的同时能够承受显著的表型变化，表明了一种基于表型可塑性的替代适应策略。这些基因型显著的表面角度减少反映了热诱导的下部叶片脱落后上部叶片趋向更加垂直的姿态，这可能是为了减少直接辐射截获的适应性机制。这种形态学调整与代表性基因型（如Ccab03）中早期NDVI的增加相结合，表明冠层重构有助于在整体表型不稳定的情况下保持光合能力。通过快速形态重组维持生物量生产的能力在温度持续升高的气候中尤其有价值，这种重组可能是由ABA介导的激素重编程加速的[13]、[32]。第4组基因型在热应激下既没有表型稳定性也没有生产力，代表了最不利于热耐受性育种的表型组合。这里采用的分类方法结合了多种表型指标，而不是依赖于单一特征进行评估，揭示了传统单变量选择标准可能掩盖的基因型多样性。响应模式1、2和3之间明显的稳定性-生长权衡强调，热耐受性评估必须结合多个相关终点，以全面描述基因型响应并识别适合多种农业应用的材料。需要注意的是，上述机制解释是从表型观察和现有文献中推断出来的，在缺乏直接生化测量的情况下仍具有推测性。未来研究中整合氧化应激标志物（如MDA、SOD活性）和适宜溶质定量（如脯氨酸、可溶性糖）将为这些假设机制提供直接的生化验证。

4.3.4. 时间维度和表型维度的整合
时间分析与基于PCA的分类相结合揭示了基因型从急性热冲击到适应的过程中的重要模式。在整个处理期间始终保持较短PC距离的基因型（如Ccab10、Ccab09、Ccab08）表现出内在的热稳定性，几乎没有应激引起的表型变化。相比之下，其他基因型表现出动态的时间变化模式。Ccab20在初期表现出较长的抗热距离，但在14天后这一距离显著缩短，表明其具有很强的适应能力；而Ccab05和Ccab17的抗热距离则逐渐增加，暗示它们积累了压力损伤且未能有效适应。这种抗热距离轨迹的时间差异性表明，欧几里得距离不仅能够捕捉到抗热反应的幅度，还能反映基因型特有的时间和适应模式。将时间动态与表型稳定性分类相结合，比在固定时间点进行横断面分析能更全面地理解植物的耐热机制[54][55]。

4.4. 抗热反应与适应机制的时间动态
4.4.1. 时间分析揭示的不同适应阶段
时间表型学方法使人们能够识别出传统终点分析可能遗漏的抗热反应中的不同生理阶段[33][56]。对照组与处理组植物之间的最大分离发生在3天时（ΔC = 3.27），这表明这是一个早期筛选耐热性的最佳时间点。随后，在12天（ΔC = 2.82）到14天（ΔC = 1.41）期间，分离程度逐渐减小，反映了多种基因型的逐渐适应过程。这种模式与已知的热应激反应理论一致，该理论描述了从急性休克反应到长期适应的转变[57][58][59][60]。根据Wahid等人的研究[29]，短期热应激主要触发即时的保护性反应，如气孔关闭、渗透质积累和应急蛋白合成；而长期热暴露则激活更持久的适应过程，涉及基因表达的改变、代谢重组和结构修改。

4.4.2. 适应过程中从形态参数向生理参数的转变
时间表型学模式伴随着驱动抗热反应的主要参数的变化。早期反应（3-5天）主要受形态参数影响（数字生物量、色度值和NDVI，各自贡献超过PC方差的10%），反映了生长抑制和初期色素变化。到了后期（10-14天），光谱指数变得更为重要，NDVI、色度和PSRI成为主要贡献因素（各占11%以上）。这种转变表明，初始的抗热反应主要通过改变生长和冠层结构来减少热暴露[18][29]；随后的光谱指数主导则表明后期适应涉及更复杂的生理调整，包括光合机制、色素组成和细胞结构[61][62]。视觉观察也证实了这一转变：在处理开始阶段（3-5天），下部叶片出现逐渐变黄、枯萎和脱落现象；而后期（10-14天）新长出的叶片表现出较少的压力症状，表明至少某些基因型已经成功适应了热应激。

4.4.3. 特定作物的时间模式及其对育种的影响
我们的研究发现，中国白菜在3天时表现出最大的抗热反应分离，这与辣椒的研究结果不同（辣椒在10天时表现出最大分离[20]）。这种时间差异可能反映了不同作物的生活策略。作为冷季叶类蔬菜，中国白菜对热应激的初始反应更快，这可能是其进化适应较冷气候的结果，因为在较冷的气候下快速识别和应对压力具有适应性价值。这些特定作物的时间模式对育种策略有重要意义。对于中国白菜而言，在3天时进行早期筛选可能是识别耐热基因型的最有效方法；而对于辣椒来说，可能需要延长评估期以充分评估其适应潜力。这些作物在抗热反应时间上的差异表明，育种计划必须仔细考虑这些时间差异，并针对每种作物的具体生理适应机制进行选择。

4.5. 对育种和筛选方法的影响
4.5.1. 结合表型技术的多阶段育种框架
我们的研究建立了一种实用的、分阶段的育种策略，它在早期发育阶段利用高通量表型技术，并通过传统的生理测量进行验证。我们建议采用多阶段选择方法：首先是大规模幼苗筛选，利用室内表型技术和基于PC距离的分类；筛选出的有潜力的候选基因型随后通过破坏性测量和气体交换分析进行二次评估，以确认其在热应激下的生物量维持和光合效率；最后是在实际生长条件下进行田间评估，以确保成熟植物的表现。这种逐步的方法通过逐步缩小候选基因型范围来提高筛选效率，同时确保所选基因型在不同发育阶段和环境条件下都能保持优异的表现。早期阶段基于PC距离的表型评估可以使大规模群体快速通过筛选，同时减少资源投入；后期验证则确认实验室发现的耐热机制能够转化为田间表现。

4.5.2. 为实际应用优化的时间采样
为了实现最佳育种计划，我们建议关注三个关键时间点：3天时可以捕捉到抗热反应之间的最大分离，便于快速识别耐热基因型；7天时可以进行中间评估，了解急性反应和适应反应之间的转换；14天时可以评估适应能力和长期耐热性。这种方法能够捕捉抗热反应的核心动态，同时最大限度地减少资源需求。早期（3天）和后期（14天）的测量相结合尤其有价值，因为它能够同时识别出即具抗热性又具有有效适应潜力的基因型。这种双时间点的评估策略有效地识别出适用于多种热环境（包括急性和慢性热应激情况）的基因型。

4.5.3. 方法学局限性与未来研究方向
尽管本研究证明了基于PC距离的分类和表型验证的实用性，但仍有一些实验局限性需要考虑：首先，使用两个独立的培养室（每个处理组一个）进行实验，且没有进行培养室轮换或独立重复实验，可能会引入温度处理与培养室身份之间的潜在混淆。然而，在引入植物前的四天里，我们在相同的设定条件（白天35°C/夜晚18°C）下进行预实验监测，发现两个培养室之间的热性能几乎相同，白天相差0.04°C，夜间相差0.39°C，都在制造商规定的±1.5°C的控制范围内。这些数据大大降低了培养室混淆的风险，尽管无法完全排除实际实验中不同操作条件下的植物热负荷差异带来的影响。未来的研究应包含培养室轮换设计，以完全消除这一潜在的偏差源。其次，本研究没有在0天时进行预处理前的表型基线扫描，因此3天时观察到的ΔC值无法完全区分是由处理引起的反应和基因型固有的表型变异。为了最小化这种风险，植物是在均匀选择的幼苗和随机分配的托盘中分配到处理组的。尽管如此，3天时的数据点应被视为最早观察到的反应，而不是从一个确认的相同基线开始的变化。未来的研究应将0天时的扫描作为标准实践，以便严格量化早期由压力引起的表型变化。第三，PlantEye F600系统的内置LED照明在扫描过程中提供了恒定的光照条件，基于比率的植被指数计算减少了对绝对强度变化的敏感性；但在没有外部校准目标的情况下，无法完全保证单波段绝对值在会议间的可比性。因此，对本研究中光谱参数的解释应基于处理组间的相对差异，而不是绝对反射值。未来的研究可以使用外部光谱参考面板进行额外验证，以进一步加强会议间光谱数据的可比性。第四，随着植物冠层高度的增加，14天处理期间传感器到冠层的扫描距离略有减小。整个实验中，0.7-0.8米的扫描距离保持在制造商规定的有效测量范围（0.4-1.5米）内（Phenospex，荷兰）。虽然已知空间分辨率会随扫描距离变化，但由于幼苗阶段的冠层高度变化较小，这些变化不太可能在基因型间或处理组间引入系统偏差。解释不同时间点的绝对结构特征值时，应考虑这一潜在的变化因素。第五，尽管植物从生长室转移到表型工作台并在大约5分钟内完成扫描，但在扫描前短暂暴露在较凉爽的工作台环境（约25°C）中可能会引起短暂的生理变化。结构和形态特征在这段时间内不太可能发生显著变化，反映叶绿素含量和色素（NDVI、GLI、PSRI）的光谱指数受生化状态的影响，而这些变化发生在数小时到数天的时间尺度上。尽管如此，反映叶片姿态和胀压状态的表面角度参数在转移期间可能会部分恢复，因此在解释时应适当谨慎。第六，本研究未测量氧化应激的生化标志物，包括丙二醛（MDA）含量和抗氧化酶活性（SOD、CAT、APX）以及相关溶质（如脯氨酸和可溶性糖）。这些参数通常用于细胞水平上表征基因型的热应激反应[13][32]，并将为通过表型分类识别的四种耐热策略提供直接的生化验证。将它们纳入未来的研究将大大增强对反应模式的机制理解。我们的控制实验室环境无法模拟田间条件，因为在田间，热应激通常伴随着水分供应的变化、辐射强度和大气湿度的变化[63][64]。此外，幼苗阶段的限制使得无法详细检查根系结构和功能，尽管最近在根系表型系统方面的进展为更全面的地下分析提供了可能[26][28]。关于3D表型平台，反射性或透明叶片表面可能导致的测量误差是基于LiDAR扫描的固有问题。另一个技术限制是叶片遮挡的可能性，即上层冠层叶片可能会部分遮挡下层叶片的扫描。在本研究的幼苗阶段，冠层闭合程度较低，多层叶片重叠较少，因此遮挡对参数估计的实际影响较小；然而，随着植物在后期生长阶段形成更密集的冠层，遮挡可能导致3D叶面积和数字生物量的低估，这一点在将当前筛选框架应用于更高级的发育阶段或具有典型密集莲座叶结构的基因型时需要加以考虑。未来3D成像分辨率和准确性的技术进步，或补充性测量方法（如热成像），可以进一步增强表型评估的准确性。目前的研究结果表明中国白菜基因型之间存在不同的抗热反应模式，但其背后的遗传和分子机制仍有待阐明。基因型之间的明显生理差异，特别是表型稳定性和生物量生产的独立性，为整合基因组学、转录组学和代谢组学分析奠定了基础。比较具有不同适应模式的基因型可以帮助揭示控制耐热性的遗传和分子机制。最近的多组学研究已经确定了值得在表型分类背景下进一步研究的重点热耐受模块[65][66]。

4.5.4. 转化考虑与育种应用
本研究的受控环境设计为严格比较基因型提供了方法学优势，因为它消除了由变量太阳辐射、蒸气压亏缺和土壤水分共存引起的混淆。然而，东亚夏季生产环境中的田间热应激通常伴随着较高的太阳辐射和土壤水分亏缺，这可能会放大或修改在良好灌溉条件下观察到的应激反应[63][64]。此外，幼苗阶段的耐热性并不一定能够预测后续发育阶段的性能，因为不同的生长阶段可能会涉及不同的应激反应机制。在将这里报告的基因型排名转化为田间表现预测时，应考虑到这些因素。为了将本研究的发现应用于实际育种流程，我们提出了一个四阶段的耐热性育种框架（图S9）。第一阶段包括杂交和引入种质以产生分离群体；第二阶段（室内表型分析；F2-F5/R1-R4）在35-40°C下施加受控环境热处理，并使用高通量3D多光谱表型技术、基于图像的根表面面积分析和热成像及叶绿素荧光测量等工具进行早期耐热性选择。本研究中开发的基于PC距离的分类框架可直接应用于此阶段，从而快速客观地分层分离群体。第三阶段则将室内评估与田间评估相结合，提供在半控制或多环境条件下的基因型性能的中间评估。第4阶段（田间表型分析；F5-F9/R4-R7）包括破坏性评估和均匀性评价（F5/R4）、产量、品质以及病虫害抗性评估（F8/R6），以及多地点适应性试验（F9/R7），以确认在实际且多样的生长条件下的农艺表现。在本研究中，识别出的具有表型稳定性和高温胁迫下高生物量保持能力的基因型（即响应模式1）是最有潜力进入下一研究阶段的候选者。这些基因型需要在第3阶段的桥接试验中优先评估，并在后续的田间验证中确认其幼苗期的稳定性与生产力是否能够转化为成熟植株在夏季生产条件下的农艺产量和产量。

**5. 结论**
这项综合研究表明，传统的破坏性测量方法和先进的非破坏性表型分析技术为 Chinese cabbage（小白菜）的热耐性评估提供了互补的信息。视觉评估、生物量测量和气体交换分析揭示了高温胁迫的严重影响以及根部的脆弱性。通过强相关性分析验证的表型分析技术为劳动密集型破坏性方法提供了高效的高通量替代方案。基于PCA的欧几里得距离分析将多个维度整合到一个定量分类系统中，识别出四种不同的热耐性策略。时间动态分析揭示了作物特有的响应模式，包括明显的急性反应期和适应期。这些发现为加速耐热 Chinese cabbage 的育种工作提供了实际框架，同时也加深了对适应气候变暖的冷季作物耐逆机制的理解。

**作者贡献声明**
Yoonah Jang：撰写-原始草稿、方法论、概念提出。
Roland Schafleitner：撰写-审阅与编辑、资金获取、监督。
Ya-ping Lin：撰写-审阅与编辑、数据管理。
Jinhee Kim：撰写-审阅与编辑、资源准备。
Me Hea：撰写-审阅与编辑、文献综述。

**利益声明**
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或可能影响本文研究的个人关系。

**数据可用性**
本研究收集和使用的数据可在补充材料中获取。用于分析的代码可根据合理请求向通讯作者索取。