使用钌(II)修饰的玻璃碳电极对食品样品中的四环素进行电化学检测的方法

《Results in Chemistry》：Electrochemical landscape for screening tetracycline in food samples using ruthenium(II) modified glassy carbon electrode

　　P. Jeba Sagana | S. Shailajha | R. Vimala | N. Bhuvanesh | K. Swarnalatha
印度泰米尔纳德邦蒂鲁内尔维利-12，阿比塞卡帕蒂，马诺曼尼亚姆·孙达拉纳尔大学化学系光化学研究实验室

**摘要**
四环素（TC）是一种常用的抗生素，在兽医医学中发挥着重要作用，用于治疗动物的各种传染病。由于其广泛应用，需要先进的检测方法来识别牛奶、鸡蛋等实际样品中的四环素残留。因此，开发一种能够准确检测这些残留的灵敏电化学传感器至关重要。在我们的研究中，我们合成了一种含有肼配体的Ru(II)配合物（RONH），并使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、高分辨率质谱（HRMS）和单晶X射线衍射（SC-XRD）等技术对其进行了表征。此外，我们采用滴涂法将合成的Ru(II)配合物（RONH）制成玻璃碳电极（GCE）。这种改性显著提高了电极（RONH/GCE）对四环素残留的检测灵敏度和选择性。然后，在优化条件下，通过循环伏安法（CV）和线性扫描伏安法（LSV）监测了该改型传感器对四环素的电化学性能。研究结果显示，检测限低至0.009 μmol L?1，定量范围为1 μmol L?1至10 μmol L?1，并具有良好的选择性和抗干扰能力。

**1. 引言**
抗生素是由生物体产生或在实验室条件下合成的化合物，具有杀死或抑制微生物生长的能力。它们在对抗感染方面发挥着重要作用，因此在医疗领域的临床和研究应用中都非常重要[1]。尽管抗生素对改善动物和人类的健康至关重要，但过度使用会导致严重后果，尤其是抗生素耐药性微生物的发展[2]。在食品工业中，大约80%的动物被给予抗生素、抗菌剂和抗病毒剂等药物，这些药物通常用于预防疾病、促进生长，有时也用于提高产量[3]。虽然这些做法对动物和生产者有益，但也带来了各种环境和伦理问题[4]。
在兽医医学领域，多种抗生素在维护牛和鸡的健康方面发挥着关键作用。其中，四环素是一类重要的抗生素。四环素对多种细菌（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌）都有效，其广谱效力使其成为兽医的常用选择。四环素不仅易于获得且成本低廉，而且在治疗家禽和牛场的常见疾病方面也非常高效。这些抗生素对于管理呼吸道感染、消化系统疾病和败血症疾病尤为重要，从而保证了动物的健康以及家禽生产的稳定性[5]、[6]。
最近的研究表明，全球所有畜牧生产系统中都存在微量四环素（TC）污染，尽管各国的使用强度有所不同。这些污染物可在所有动物源性产品（包括牛奶、肉类和鸡蛋）中检测到。值得注意的是，即使在实施法规和监测措施的国家，这一问题仍然存在[7]。四环素（TC）残留逐渐积累在常见的食品中，对人类健康构成重大风险，并可能削弱免疫系统的效力。一份报告指出，约有200万人受到对抗生素产生耐药性的细菌引起的传染病的困扰[8]。这一情况导致了许多死亡病例，凸显了亟需一种能够有效检测食品样品中TC残留的传感器和材料。
通过多种分析技术（包括微生物检测[9]、高效液相色谱（HPLC）[10]、毛细管电泳（CE）[11]、酶联免疫吸附测定（ELISA）和液相色谱-质谱（LC/MS）[12]）来识别和定量食品和环境基质中的四环素（TC）残留。尽管这些方法有效，但它们通常耗时较长、需要复杂的仪器并且操作成本高，限制了其常规监测的适用性[13]、[14]。基于比色阵列的方法也用于TC检测，操作简单且读数直观，但易受基质着色影响，定量精度有限，动态范围較窄[15]。相比之下，电化学方法具有快速分析、高灵敏度、良好的信号重现性和较高的定量可靠性，非常适合抗生素残留的监测[15]、[16]。
在报道的用于TC检测的电化学传感器材料中，大多数依赖于多组分纳米复合材料，如石墨烯衍生物、金属氧化物、金属有机框架和贵金属纳米粒子[17]、[18]、[19]、[20]。尽管这些平台通常具有较低的检测限，但其制备过程复杂，涉及多步骤表面修饰和纳米粒子聚集问题，以及再现性差，这些因素共同影响了实际应用的可扩展性。基于钌的材料因具有明确定义的Ru(II)/Ru(III)氧化还原对、快速电子转移动力学以及通过配体设计的结构可调性而受到广泛关注[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，大多数报道的系统依赖于经典的Ru(bpy)?2?型支架或纳米结构Ru材料。含有肼衍生物配体的结构定制Ru(II)配位复合物尚未得到充分研究，系统性的比较电化学研究也很少，这表明电化学传感器材料设计方面存在明显空白。
为填补这一空白，本研究介绍了一种新合成的钌(II)配位复合物（RONH），该复合物包含一种结构独特的肼衍生物配体（ONH），作为玻璃碳电极（GCE）上的氧化还原活性电极修饰剂。与传统基于纳米复合材料的放大策略不同，RONH复合物提供了一个明确的配位环境，促进了通过Ru(II)/Ru(III)氧化还原对的高效电子转移。其天然的化学稳定性、对电极表面的强附着力以及富含电子的配体框架使其能够在生理条件下选择性地与TC分子相互作用[26]、[27]。重要的是，这项工作直接比较了游离配体ONH及其Ru(II)复合物RONH的电化学性能，阐明了检测性能提升的结构基础，这是文献中尚未探讨的方面。这种方法代表了一种概念上简化但分析上具有竞争力的多组分纳米复合电极替代方案。
RONH/GCE传感器在无需使用复杂纳米结构或多步骤制备过程的情况下，实现了0.009 μmol L?1的理论检测限，确认的线性范围为1–10 μmol L?1。该传感器成功应用于实际食品基质（牛奶和生鸡蛋）中的TC分析，证明了其在食品安全监测中的实用价值。除了分析性能外，这项工作还扩展了基于配位复合物的传感界面机制理解，并丰富了电化学抗生素检测的材料设计工具箱，对制药和环境监测应用具有广泛意义。

**2. 实验部分**
2.1. 材料与方法
本研究使用高纯度化学物质以确保结果准确可靠。研究中使用的化学物质包括：2,2'-联吡啶（97%）、吲哚-2,3-二酮、烟酸肼（98%）、乙酰水杨酸（2-[2-[2-(2,6-二氯苯胺)苯]乙酰]氧乙酸）（97%）、氯化钾（97%）、磺胺甲噁唑（≥98%）、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠（均购自Sigma Aldrich）；三水合氯化钌(III)（RuCl?·3H?O）和卵白蛋白（来自Himedia Pvt. Ltd., 印度）；高氯酸四丁基铵和二甲亚砜（DMF）（来自Merck）；以及抗坏血酸、葡萄糖、柠檬酸、氯化钙、氯化镍、咖啡酸和硫酸钠（来自Sd Fine Chemicals Ltd.）。此外，四环素（TC）、羟四环素（OTC）和多西环素（DXY）购自Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.。市售牛奶和生鸡蛋购自印度泰米尔纳德邦的当地市场。所有水溶液均使用去离子水配制，所购化学物质均无需进一步纯化。

2.2. 仪器
电化学实验使用来自美国德克萨斯州奥斯汀的CHI6005E电位计进行。合成化合物的吸收光谱使用Lambda UV-VIS光谱仪（PerkinElmer, Shelton, Connecticut, USA）精确记录。化合物的荧光光谱使用JASCO FP-8500荧光光度计精确记录。该仪器可详细分析发射光谱，评估化合物的各种光物理性质。对于结构表征，使用XtaLAB Synergy Dualflex HyPix衍射仪（日本）获取合成化合物的单晶数据。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）使用Agilent Cary 630 FTIR Benchtop System（Santa Clara, USA）记录，有助于识别化合物中的官能团。合成化合物的质谱使用XEVO-G2-XS-QTOF（Waters, USA）获得，提供分子量和碎片模式的全面信息。为了检查表面形态，使用OXFORD MFP 3D ORIGIN显微镜在敲击模式下捕捉改性电极的原子力显微镜（AFM）图像，获得了电极表面的高分辨率细节和纳米级相互作用。

2.3. Schiff碱N′-(2-氧代吲哚-3-亚烯)烟酸肼（ONH）的合成
肼Schiff碱（ONH）通过甲醇作为溶剂进行缩合反应合成。将0.2 g（0.0014 mol）烟酸肼溶解在10 mL无水甲醇中，并在磁力搅拌下获得澄清溶液。随后加入10 mL含有0.23 g（0.0014 mol）吲哚-2,3-二酮的甲醇溶液。接着加入两滴冰醋酸作为催化剂，溶液颜色逐渐从无色变为黄色，表明Schiff碱的形成。反应混合物在70°C下回流5小时并持续搅拌。反应完成后，混合物冷却至室温（25°C），过滤黄色沉淀物，用冷甲醇洗涤以去除未反应的杂质，并在室温下干燥。粗产品通过乙醇重结晶进一步纯化，最终得到黄色结晶固体ONH[28]。ONH的分子式为C??H??N?O?（图1）。
合成产物的产率为90%。通过薄层色谱（TLC）使用氯仿:甲醇（8:2）作为流动相确认了化合物的纯度。

2.4. [Ru(bpy)?(ONH)]??复合物（RONH）的合成
按照Sullivan在1978年提出的方法[24]首先合成cis-(bpy)?RuCl?·2H?O。然后，将1 mmol的ONH配体加入1 mmol的cis-(bpy)?RuCl?·2H?O溶液中（50 mL DMF）。混合物在氮气氛围下于110°C至130°C之间回流8小时。回流后，紫色溶液变为红棕色，表明RONH的形成。反应混合物冷却至室温（25°C）。使用旋蒸仪在真空条件下完全蒸干DMF溶剂。所得固体产物用乙醚洗涤三次，化学式为C??H??N?O?Ru（见图2）。反应产率为85%[29]、[30]。

2.5. 玻璃碳电极（GCE）的改性
首先使用氧化铝浆料对裸露的玻璃碳电极（GCE）进行抛光，使其表面光滑如镜面。接着，电极分别在蒸馏水和乙醇中超声处理5分钟以去除残留污染物，然后彻底冲洗并在室温下干燥[31]、[32]。用氮气轻轻吹扫以去除表面水分后，GCE准备好进行表面改性。为了制备改性悬浮液，将5 mg/mL的RONH溶液在乙醇中超声处理5分钟以确保均匀分散。然后将每种悬浮液的5 μL滴涂在单独的GCE表面上，并在室温下干燥一小时，之后进行电化学分析。图3提供了该程序的视觉概览。下载：下载高清晰度图片（52KB）下载：下载全尺寸图片

图3. 用于改性玻璃碳电极（GCE）的滴铸方法的示意图。

2.6. 实际样品制备
2.6.1. 牛奶样品
为了评估所提出传感器的实际应用性，从印度泰米尔纳德邦的蒂鲁内尔韦利获取了一个本地牛奶样品。将100毫升牛奶轻轻加热10分钟后，加入10毫升1克/升的盐酸（HCl），在持续搅拌下使酪蛋白和其他蛋白质沉淀。所得混合物通过0.2微米的Whatman滤纸过滤，以获得无蛋白质的上清液。向滤液中加入4克碳酸钙（CaCO?），并将溶液轻轻煮沸5分钟以中和多余的酸。冷却至室温后，通过过滤去除剩余的固体，得到澄清的溶液[33][34][35]。然后向这种制备好的牛奶基质中加入已知浓度的四环素（TC），使用RONH/GCE传感器进行电化学分析。

2.6.2. 生鸡蛋样品
从蒂鲁内尔韦利附近的市场购买了一个完整的鸡蛋（包含蛋黄和蛋白），使用搅拌器与50毫升去离子水混合15分钟，形成均匀的混合物。从这种均匀混合物中取出20毫升放入50毫升容量瓶中，用乙醇稀释至刻度线。加入乙醇有助于蛋白质沉淀，并减少基质的复杂性。随后在室温（25°C）下强烈摇晃混合物15分钟以促进蛋白质凝结，随后以7000转/分钟离心30分钟。收集得到的澄清上清液作为分析基质。向此滤液中加入不同浓度的抗生素，以评估改性电极在实际样品条件下的性能[36][37]。

3. 结果与讨论
3.1. ONH配体的光物理特性
使用UV-Vis和发射光谱仪研究了在DMF中浓度为1×10^-4摩尔/升的合成ONH配体的光物理特性。UV-Vis光谱在275纳米和330纳米处显示出两个明显的吸收带（见图S1（红色），表明发生了π-π*和n-π*跃迁[38]，证实了Schiff碱的形成。此外，荧光在464纳米处显示出双峰，并在570纳米处有一个小峰（见图S1（蓝色）），这与局部激发态和分子内电荷转移态相关。存在红移的分子内电荷转移（ICT）带表明从肼供体到异嗪受体的有效电子离域，从而增强了该分子的荧光性能[39][40]。

3.2. RONH复合物的光物理行为
通过UV-可见光吸收和荧光发射光谱研究了RONH复合物的光物理特性。该复合物的UV-可见光谱在229纳米、291纳米和346纳米处有三个吸收带，在493纳米处有一个较弱的吸收带（见图S2（红色）。这些吸收带分别由配体骨架中的芳香族和杂芳香族原子（如异嗪、硝基肼和联吡啶）引起的π→π*和n→π*跃迁所致。346纳米的吸收带对应于扩展的π-共轭，表明在配体结构中电子显著离域，尤其是在与Ru(II)中心配位后。493纳米处的弱吸收带（见图S2（蓝色）是金属-配体电荷转移（MLCT）跃迁的特征，这一MLCT带证实了ONH配体与Ru(II)联吡啶核之间的配位[41][42]，证实了RONH复合物的形成。
观察到的光物理跃迁为ONH及其Ru(II)复合物（RONH）的电子结构提供了重要见解，这直接影响它们的电化学行为。配体（ONH）观察到的π-π*和n-π*跃迁表明存在共轭系统和富含电子的官能团，这些官能团有助于配体中心的氧化还原活性。与Ru(II)中心配位后，观察到额外的金属-配体电荷转移（MLCT）跃迁，反映了金属中心和配体框架之间的增强电子离域。这种电子结构的改变在电极界面促进电荷转移过程中起着关键作用。RONH中MLCT跃迁的存在增强了电荷转移能力并提高了电子迁移率，这与观察到的电化学响应和对四环素检测的增强的灵敏度一致。因此，复合物的光物理性质与其电化学传感性能密切相关。

3.3. FTIR光谱分析
FTIR光谱确定了配体（ONH）中的官能团，并展示了它如何与金属复合物配位。FTIR光谱揭示了NH、CO和CN的显著吸收带，表明了异嗪和硝基肼的存在。1661厘米^-1处的峰代表异嗪的CO伸缩，1615厘米^-1处的峰是偶氮甲基（C=N）的伸缩。NH伸缩在3271–3035厘米^-1范围内较宽。与钌（Ru）配位后，光谱发生了显著变化，反映了通过偶氮甲基氮和可能的羰基氧的键合，出现了一个表示RuN伸缩的新峰（见图S3）[43][44][45]。这些变化证明了金属配体复合物的存在。表1列出了ONH和RONH复合物的完整FTIR分析解释。

表1. ONH和RONH的FTIR分析解释
官能团 | ONH（配体） | 峰值（厘米^-1） | RONH（复合物） | 峰值（厘米^-1） | 解释
--------|---------|-----------|--------------|---------|
N–H伸缩（肼） | 3271–3039（宽） | 3230（宽，减弱） | 由于参与配位，峰值略微移动并减弱 |
C=O伸缩（异嗪羰基） | 1661 | 1642 | 峰值向低频移动，表明配位或电子离域 |
C=N伸缩（偶氮甲基） | 1615 | 1581 | 峰值向低频移动，表明通过偶氮甲基氮配位 |
C–N/N–N伸缩 | 1270 | 1250 | 由于配位时电子密度的变化，峰值略有移动 |
芳香族CC伸缩 | 1450–1500 | ~1455 | 保留；轻微移动，证实芳香环完好 |
Bpy环振动（Ru–bpy） | -1150 | 新峰，由于复合物中联吡啶配体的振动 |
Ru–N（金属-配体键合） | -480–520 | 新峰，证实了ONH配体与Ru(II)联吡啶核的键合 [41][42] |

3.4. 通过HRMS确定分子量
使用高分辨率质谱通过正模式电喷雾离子化（ESI+）确认了合成ONH配体和RONH复合物的分子结构。m/z 267.08处的显著峰对应于配体的质子化离子（[M+1]+），而m/z 289.0697处的峰与钠加合物[M+Na+]相关，支持了图S4中显示的配体身份。RONH复合物显示了一个679克/摩尔的离子峰，证实了Ru(II)复合物的形成。此外，m/z 715处的峰表明存在氯化物加合物[46][47]。这些结果证实了ONH配体及其Ru(II)复合物RONH的成功合成（见图S5）。

3.5. N′-(2-氧杂吲哚-3-亚基)硝基肼（ONH）的晶体结构
通过SCXRD分析了ONH配体的分子几何结构和固态结构。通过缓慢蒸发DMF-乙醇混合物获得了黄色块状晶体。选择了尺寸为0.19×0.12×0.08毫米3的特定晶体进行研究。数据在100.00(10) K的温度下使用XtaLAB Synergy Dualflex diffractometer收集，以最小化热振动。ONH化合物以P2?/c空间群的单斜晶系存在，其单元格参数为：a=8.7093(1) ?, b=11.7982(1) ?, c=11.6418(1) ?, β=95.821(1) ?。研究包含了关于原子坐标、键角和长度的全面信息。分析证实了所建议的结构，并提供了配体相互作用的信息，为未来的研究提供了参考。晶体结构进一步使用ORTEP（热椭球）图进行了可视化（见图1），包括有无氢原子的情况。包括分数原子坐标、各向同性和各向异性位移参数、键长、键角和氢键相互作用在内的全面结构数据列在表S1至S7中，提供了对ONH分子几何结构和堆积的详细了解[48]。晶体学信息将在后续提供，CCDC编号为2469694。

图1. ONH a）无氢原子和b）含氢原子的ORTEP视图。

3.6. ONH/GCE和RONH/GCE改性电极的形貌表征
使用原子力显微镜（AFM）研究了ONH和RONH改性玻璃碳电极的表面纹理。图像采用非接触模式拍摄以保护柔软的表面。扫描范围约为2微米，ONH/GCE的高度尺度为0至±165纳米，RONH/GCE的高度尺度为0至±215纳米（见图2a和b）。ONH/GCE的RMS粗糙度为80纳米，表明表面更为粗糙，而RONH/GCE的RMS粗糙度为66纳米，表明表面更为平滑。更平滑的RONH薄膜可能意味着更好的分子堆积和电极相互作用。表面测量还显示了与平坦轮廓的显著粗糙度偏差。这种粗糙度增加了电极的有效表面积及其电化学活性，促进了电子转移，并在传感过程中创造了更多的活性位点。结果证实了钌复合物在电极上的成功固定，支持其在电分析系统中的使用[49]。

图2. a）涂有ONH的玻璃碳电极表面和b）涂有RONH复合物的玻璃碳电极表面的2D AFM图像。

4. 电化学研究
4.1. ONH和RONH的电化学行为
使用环伏安法在DMF和ACN中分析了ONH配体及其钌复合物RONH的电化学性质，以四丁基铵高氯酸盐为电解质，玻璃碳电极为工作电极。在此过程中，ONH在-0.442伏处显示阴极峰（Epc），在+0.819伏处显示阳极峰（Epa），峰对分离（ΔEp）为1.261伏（见图S6a）。相比之下，RONH在-0.230伏处显示阴极峰，在+0.486伏处显示阳极峰（见图S6b），ΔEp显著降低至0.716伏。半峰值电位（E1/2）计算为（Epa+Epc）/2，ONH为0.189伏，RONH为0.128伏。两种化合物观察到的较大ΔEp值超过了25°C下可逆单电子转移的理论值59毫伏，清楚地表明了动力学上不可逆的氧化还原过程。然而，配位后ΔEp的显著降低（从1.261伏降至0.716伏）表明金属配位增强了电子转移特性，可能是由于电子离域的改善和配位框架内氧化态的稳定。RONH改性后电子转移动力学的改善与表面限制的有机或配位修饰剂增加碳表面活性电子转移位点的理论一致[50]。
为了确定参与氧化还原过程的电子数量，应用了不可逆峰关系Ep?Ep/2=47.7αn，其中Epis是峰电位，Ep/2是半峰电流处的电位，α是电荷转移系数，n是转移的电子数。对于ONH，Ep?Ep/2的差值为0.080伏，αn值为0.596；对于RONH，相应的值为0.077伏，αn=0.619。假设不可逆系统的典型α值为0.5，两种情况下计算出的电子转移数大约为一个（n≈1）。这些结果证实ONH经历了以配体为中心的单电子氧化还原过程，而RONH表现出一个电子的Ru(II)/Ru(III)氧化还原转变[51][52]。此外，阳极峰始终出现在比相应的阴极峰更正的电位上，这与电化学原理完全一致。总体而言，数据表明ONH与Ru(II)中心的配位调节了电子环境并提高了电荷转移效率，而不改变氧化还原过程的基本单电子性质。ONH和RONH的计算电化学参数，包括峰电位（Epc和Epa）、峰对分离（ΔEp）和中点电位（E1/2）以及估计的电子转移数（n），总结在表2中以便直接比较。

表2. 在DMF和ACN中ONH和RONH的半峰值电位（E1/2）和峰电位（Ep）
化合物 | Epa（伏） | Epc（伏） | ΔE（伏） | E1/2（伏）
--------|---------|---------|---------|--------|
ONH | +0.819 | -0.442 | 1.261 | 0.189 |
RONH | +0.486 | -0.230 | 0.716 | 0.128 |

结构表征数据为观察到的电化学行为提供了重要见解。FT-IR分析显示，在ONH与Ru(II)中心配位后，ν(C=N)和ν(C=O)伸缩频率发生了显著变化，证实了金属配体键的形成和共轭框架内电子密度的重新分布。与Ru(II)离子的配位引入了π-π*供体和金属配体轨道之间的相互作用，增强了整个复合物的电子离域。这种电子调制合理解释了观察到的氧化还原电位的改变以及ΔEp从1.261伏（ONH）降至0.716伏（RONH）的显著降低，表明配位后电荷转移特性的改善。ONH的单晶X射线结构证实了一个刚性的共轭骨架，能够支持以配体为中心的氧化还原活性。在金属配位过程中，配体π轨道与Ru d轨道之间的相互作用稳定了氧化态，并促进了电子转移，从而建立了结构改变与电化学响应之间的直接关联。这些结果突显了配位化学对电化学动力学的影响，因为Ru中心作为一个氧化还原节点，促进了电子转移和氧化态的稳定性。这是电极修饰剂的关键特性[53]。4.2. 使用RONH/GCE对TC的电化学响应研究

四环素（TC）等抗生素在兽医和医疗中的无差别使用导致其在食品和环境样本中的残留。这些抗生素对人体健康有严重影响，包括引发抗生素耐药性、过敏反应和改变肠道微生物群。因此，监管机构对其在食品和水中的允许含量设定了严格限制。因此，开发选择性高且灵敏的TC检测方法至关重要。电化学传感提供了一种快速、低成本且高度敏感的检测机制[54]。为了评估RONH/GCE修饰电极在50 μmol L^-1浓度下对TC的电化学响应，我们在0.1 M PBS（pH 7.0）中进行了一线扫描伏安法（LSV）实验（图3a）。峰值以条形图形式展示，图3b显示了不同电极分析物的最大电流响应。裸露的GCE通常表现出不足的电催化活性，需要通过表面功能化来增强电化学响应[55]。加入TC后，裸露GCE的电流有轻微增加，表明电子转移动力学有限。因此，在GCE表面固定氧化还原活性配合物（如RONH）可以创建额外的活性电子转移位点，从而提高灵敏度和选择性[50]。然而，含有RONH复合物的修饰电极显示出比裸露电极更大的电流响应，反映了来自氧化还原活性复合物的增强电化学活性[56]。仅暴露于TC的RONH/GCE电极电流有所改善，但仍低于完全修饰的系统。最显著的改进是在含有钌复合物和分析物的电极（RONH/GCE/TC）上，其最大电流响应约为15 μA。这表明当它们在电极表面修饰时，复合物与分析物之间存在强烈的协同作用[57]。Ru(II) hydrazide系统的选择性可以根据众所周知的Ru(II)复合物的氧化还原稳定性和电子结构来解释。Ru(II)通常采用低自旋d6构型，并具有强配体场稳定作用，导致可逆的Ru(II)/Ru(III)氧化还原行为和高效的电子媒介[42],[58]。hydrazide配体提供氮和氧供体原子，能够与四环素中存在的官能团形成氢键和静电相互作用，这可能促进在电极表面的优先吸附和电子转移[59],[60]。这些结果验证了RONH复合物作为竞争性电极材料和电化学传感平台在真实样本中检测TC的有效性。

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图3. a) 在0.1 M PBS（pH 7.0）中，记录的裸露GCE、GCE/TC RONH/GCE以及含有50 μmol L^-1 TC的修饰电极的一线扫描伏安图。b) 对应的条形图显示了每个LSV伏安图的峰值电流响应。

4.3. 扫描速率的影响
为了研究TC在RONH/GCE界面上的电化学动力学，在0.1 M PBS缓冲液（pH 7.0）中进行了扫描速率依赖的CV实验，如图5a所示。扫描速率范围从10到170 mV/s，峰值电流的增加表明活跃的氧化还原过程受电子转移速率的影响。峰值电流（Ip）与扫描速率的平方根（√ν）的线性图表明，电化学氧化在电极电解质界面是扩散控制的（图4b和b）[61]。使用Randles Sevcik方程估算，TC的电子转移量约为2个电子（见方案4），这与涉及抗生素中胺、羟基或酚基团的已知氧化还原反应一致。
IP=2.69×10^5·n^3·A·C/V·√ν
其中，Ip是氧化还原反应的峰值电流，n是电极表面积，C是溶液浓度，V是扫描速率。

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图4. a) 在0.1 M PBS（pH 7.0）中，在不同扫描速率下记录的RONH/GCE的循环伏安图（用于四环素（TC）。b) TC的峰值电流（Ip）与扫描速率（mV）的图表；c) 峰值电流（Ip）与扫描速率的平方根（√ν）的图表。

方案4. 四环素的合理氧化
修饰电极的电活性表面积估计为0.57 cm^2，远大于未修饰的玻璃碳电极。总体而言，这些发现表明RONH/GCE是一种高导电性和电活性的抗生素检测基底，确保在生理条件下可靠地定量测量TC。

4.4. pH研究
为了确定四环素（TC）电化学检测的最佳pH值，在pH范围为3到11的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行了线性扫描伏安法（LSV）实验。结果显示强烈的pH依赖性，峰值电流在pH 7时达到最大（图5a），之后在更高pH值时下降[62]。这种钟形响应表明pH 7是RONH/GCE电极上TC氧化的最有效环境（见图5b）。在pH 7时，分析物和RONH复合物表面官能团的最佳质子化状态增强了电化学活性。较低的pH值导致过度质子化，而较高的pH值导致脱质子化，这两种情况都会降低电流。相比之下，pH 7保持了稳定的氧化还原活性位点和有利于电子转移的离子化状态[63],[64]。TC与Ru(II)中心之间的相互作用，包括氢键和电子捐赠，促进了向Ru(III)的氧化，这体现在测量的电流中。因此，pH 7被确定为后续电化学研究的最佳条件。

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图5. pH对RONH/GCE对四环素（TC）电化学响应的影响：(a) 不同pH值下TC的LSV曲线；(b) TC的电流与pH的对应图表。

4.5. TC浓度的影响
使用线性扫描伏安法（LSV）对浓度在1到10 μmol L^-1之间的抗生素四环素（TC）进行了电化学行为研究，溶液为0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.0。所得伏安图显示，随着TC浓度的增加，氧化峰值电流显著增加（见图6a）。这种电流的增加不仅是强烈的电化学响应，也表明了传感设备的高度重现性。RONH/GCE对四环素的选择性响应归因于分析物与配位复合物之间的有利界面相互作用。四环素的芳香框架和RONH的共轭配体系统可能促进π–π堆叠相互作用，而富电子的Ru(II)中心可以促进供体-受体相互作用，有助于电子转移。RONH的分子结构提供了与四环素的酰胺和芳香基团相互作用的活性位点，有利于吸附和氧化。这就是高电流响应和低检测限的原因。此外，为TC获得的校准线性图的 correlation coefficient（R^2 = 0.99）非常高（见图6b）。这些发现强烈证明了所开发的电化学传感方法的可行性和重现性[65],[66]。

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图6. a) 在0.1 M PBS（pH 7.0）中，随着四环素（TC）浓度在1–10 μmol L^-1范围内增加的RONH/GCE的线性扫描伏安图（LSV）；b) 峰值电流（Ip）与TC浓度的校准图。

关于灵敏度，基于校准曲线的斜率，传感器的值达到了1.765 × 10^5 μA·L·mol^-1，这表明RONH/GCE对TC的检测具有高度敏感性，超过了多种传统方法。修饰电极对TC的检测也表现出优异的电催化活性，证实了其作为TC残留物检测传感器的可行性。这些结果不仅支持了所开发修饰电极的改进灵敏度，还强调了电极的分子结构及其电子特性在决定分析物与电极表面相互作用中的重要作用。特别设计的RONH复合物为TC提供了一个高度通用的传感平台，便于对其在真实样本矩阵中的多重检测和彻底分析。

4.6. 检测限（LOD）和定量限（LOQ）的确定
为了评估RONH/GCE传感器在现实世界应用中的适用性，将其检测限（LOD）与FDA等监管机构设定的国际公认的最大残留限量（MRLs）进行比较是至关重要的。对于四环素（TC），FDA在食品（如牛奶和鸡蛋）中建立了0.1–0.2 μg/mL的MRL[67]。为了评估和比较RONH修饰GCE在传感应用中的分析性能，使用标准公式计算了检测限（LOD）和定量限（LOQ）：
LOD=3σ/S
LOQ=10σ/S
其中，σ是响应的标准差，S是校准曲线的斜率。在本研究中，RONH/GCE传感器显示出0.009 μmol L^-1的显著LOD和0.035 μmol L^-1的LOQ。这些值显著低于食品中四环素的监管MRLs（例如，牛奶中为100 μg kg^-1 ≈ 0.2–0.25 μmol L^-1）[68]，表明传感器能够安全地检测到低于危险水平的抗生素残留。这种性能使得可以定期筛查牛奶、鸡蛋、肉类和水等食品中的污染，符合食品安全标准和监管质量控制要求。为了进一步展示所提出的传感器的性能，将LOD值与其他文献中报道的TC电化学传感器进行了比较（见表3）。

表3. RONH/GCE与其他文献中报道的修饰电极在TC检测性能上的比较。
电极/修饰剂
分析物
真实样本
LOD（μmol L^-1）
参考文献
AuNP/氧化石墨烯/模板分子印记聚合物（MIP）复合材料
DPVTC
牛奶
0.002
[69]
Cu-MOF
CV, DPV
TC
自来水
1.007
[70]
Mo/Cr修饰的钯金属烯（MoCr-Pdene）
DPVTC
–0.027
[71]
电化学还原的氧化石墨烯基（ERGO）丝网印刷电极（SPE）
DPVTC
牛奶
12
[72]
石墨-聚氨酯复合材料
DPVTC
药物制剂
2.700
[73]
MIP-Pt/Ti
CVTCD
药物
2.200
[74]
单壁碳纳米管网络（SWCNTs）/TEMPO氧化纤维素纳米纤维-聚乙烯胺杂化物（TOCNFs-PEI）
DPVTC
环境污染
0.180
[75]
掺硼金刚石电极
CV, SWV
TC
尿样
2.300
[76]
RONH/GCE
CV, LSV
牛奶，生鸡蛋
0.009
本工作

4.7. 重复性和再现性
评估了RONH/GCE在50 μmol L^-1浓度下检测四环素（TC）的电化学性能，重点关注重复性和再现性。使用单个修饰电极（标记为R1至R5）进行了五次线性扫描伏安法（LSV）测量，显示出几乎重合的曲线轮廓，阳极峰位于+0.85 V，峰值电流在33至35 μA之间，如图7a所示，显示出优异的稳定性。条形图显示电流响应始终接近100%（图7b），反映了强烈的表面稳定性和均匀的分析物相互作用[77]。这种稳定性源于基于Ru的配位复合物促进的强π–π堆叠和静电相互作用[78]。对于再现性，测试了五个独立制备的RONH/GCE传感器（M1至M5），显示出一致的氧化峰位置和批次间电流响应的最小变化（见图7c）。另一个条形图确认了制造的均匀性，所有响应均接近100%（图7d）。总体而言，电极修饰简单、可扩展且高度再现，RSD值低于3%，使RONH/GCE成为监测食品和环境样本中抗生素（如四环素）的可靠平台。

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图7. RONH/GCE检测四环素（50 μmol L^-1）的重复性和再现性。(a) 使用相同电极（R1–R5）进行五次连续扫描的LSV曲线；(c) 五个独立制造的电极（M1–M5）的LSV响应。(b, d) 相应的条形图显示电流响应（%），确认了出色的信号稳定性和制造一致性（RSD < 3%）。

4.8. 干扰研究
为了评估所开发传感器对四环素（TC）检测的选择性和特异性，以结构上和电化学上相关的化合物进行了干扰研究。在优化条件下，使用线性扫描伏安法（LSV）记录了RONH/GCE对某些其他抗生素（如氧四环素（OTC）和多西环素（DXY）、常用药物（如葡萄糖和双氯芬酸）、生物活性酸（如咖啡酸和抗坏血酸）以及一般生理阳离子（如Na+、K+、Ni2+和Ca2+）的响应。在此研究中，干扰物的浓度是四环素的50倍[79],[80]。如图8a所示，测试的干扰物对RONH/GCE对四环素（TC）的电化学响应没有产生不良影响。图8b中的条形图显示了每个干扰物相对于目标分析物的计算相对误差（%）。TC的相对误差超过95%，但所有干扰物的变化都小于6%。这验证了该传感器具有高度选择性，即使面对结构相关的化合物和其他电活性物种也是如此。本研究表明，结构相关的抗生素（OTC和DXY）、常见的药物化合物、有机酸和生理阳离子不会显著影响TC的氧化信号，表明传感响应是由特定的氧化还原介导的相互作用控制的，而非非特异性吸附。考虑到Ru(II) ONH复合物是预配位的并且动力学上稳定，溶液中自由ONH配体的存在不太可能引起配体交换或显著的信号干扰[81]。因此，选择性来源于Ru(II)中心受控的电子转移过程，而不是竞争性配位效应[61]。这些发现表明，RONH复合物为TC检测提供了一个可控且选择性的电化学界面。选择性在现实世界的应用中非常重要，特别是在食品或生物流体等复杂样品基质中，不同的共存物质会干扰精确检测。因此，RONH/GCE作为一个稳定的基质，可以实现无干扰且敏感的四环素检测。

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图8. a) 在不含和含有各种干扰物（50倍过量）的50 μmol L?1四环素（TC）溶液中记录的RONH/GCE的LSV曲线。b) 在潜在干扰物存在下，TC电流响应的干扰物与相对误差（%）的条形图。

4.9. 实际样品分析
为了评估所开发的RONH/GCE传感器在复杂食品基质中检测四环素（TC）的实际应用能力，使用蛋清（商业样品）、生牛奶和整个生鸡蛋进行了实验。在分析之前，所有样品都按实验部分描述的方法进行了适当的预处理，以去除蛋白质并最小化基质干扰。这些食品样品由于兽药的广泛使用，通常会存在抗生素污染。分析采用标准添加法，将已知浓度的TC（10–100 μmol L?1）加入预处理后的样品中，然后使用线性扫描伏安法（LSV）在优化条件下进行检测（PBS，pH 7，扫描速率50 mV/s），如图9(a–c)所示。电化学响应显示出随着TC浓度的增加，阳极峰电流系统性地增加，证实了即使在复杂的生物基质中也能有效检测出分析物。在+0.68 V附近观察到的阳极峰对应于TC在修饰电极表面的氧化。每个样品基质获得的校准图显示出极好的线性，相关系数（R2）分别为蛋清0.99、牛奶0.98和整个鸡蛋0.99（图9(d–f)），表明在不同基质中的分析性能可靠。这些样品中线性响应和灵敏度的保持证明了RONH/GCE传感器在潜在干扰物存在的情况下仍保持其电催化活性。

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图9. 使用RONH/GCE传感器检测TC的实际样品分析。(a-c) 分别向蛋清、牛奶和整个生鸡蛋中加入不同浓度（10–100 μM）的TC的LSV响应，以及(d-f) 每个基质的相应校准图，显示出极好的线性及相关系数（R2）。

通过以下公式计算回收率（%）来评估方法的准确性：回收率 = 找到/加入 × 100
结果总结在表4中。回收率范围为97.4%至98.2%，相对标准偏差（RSD）值低于3%，显示出出色的精确度、重现性和分析可靠性。这些值在食品样品残留分析的可接受范围内，证实了样品预处理程序的有效性，并表明基质干扰最小。

表4. 使用RONH/GCE传感器对TC的实际样品分析。

分析物 样品基质 加入（μM） 找到（μM） 回收率（%）
TCE 蛋清（商业样品） 50 48.7 97.4
TC 生牛奶 50 49.1 98.2
TC 整个生鸡蛋 50 48.9 97.8

所提出的电化学传感器在真实样品基质中的性能进一步得到了评估，并与高效液相色谱（HPLC）等传统分析技术进行了比较。虽然HPLC是一种成熟的方法，具有高灵敏度和选择性，但它通常需要大量的样品制备、复杂的仪器、较长的分析时间以及较高的操作成本。相比之下，当前的电化学传感方法提供了一个快速、经济且简单的替代方案，用于四环素的检测，并且样品预处理要求较低。牛奶和鸡蛋样品得到的满意回收率表明，所开发的RONH/GCE传感器适用于实际应用，在复杂基质中提供了可靠的检测性能。因此，尽管HPLC仍是一种参考方法，但所提出的电化学传感器在 simplicity、速度和现场适用性方面具有显著优势。

5. 结论
在这项研究中，合成了基于Ru(II)的肼复合物（RONH），并对其进行了全面表征，随后将其作为有效的电活性材料用于修饰玻璃碳电极（RONH/GCE）。开发的传感器在电化学检测四环素（TC）方面表现出出色的性能，响应了食品样品中对快速、灵敏和选择性药物残留监测设备日益增长的需求。RONH/GCE通过稳定的Ru(II)/Ru(III)偶联、良好的导电性以及由于其肼主导的和芳香族的配位 sphere而增强了分子识别能力。电极表面与TC的多功能结构之间的π–π相互作用促进了高灵敏度的检测，检测限非常低，为0.009 μmol L?1，远低于国际安全标准。通过对复杂食品基质（蛋清、牛奶、生鸡蛋）中实际样品的干扰耐受性、验证以及高回收率（97.4%–98.6%）和良好的线性（R2 ≥ 0.98），实现了强大的分析可靠性。总的来说，RONH/GCE传感器是一种有前景的可调电化学传感器，适用于痕量抗生素的测定。其卓越的灵敏度、结构可调性和对复杂样品的多功能性使其成为未来在食品安全、环境监测和药品质量控制中有价值的候选者。

CRediT作者贡献声明
P. Jeba Sagana：方法学、研究。
S. Shailajha：形式分析。
R. Vimala：形式分析。
N. Bhuvanesh：数据管理。
K. Swarnalatha：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、概念化。