随着对准确诊断、治疗和公共卫生监测需求的增加，开发简单、成本效益高且灵敏度高的免疫测定方法在生物化学和临床分析中变得至关重要。[1],[2] 作为最常见的生物标志物之一，异常的蛋白质表达水平常常与疾病的发病和进展密切相关。因此，检测蛋白质生物标志物（尤其是低丰度蛋白质）对于疾病的早期诊断和治疗至关重要。[3],[4] 尽管迄今为止已经报道了许多蛋白质检测方法，但每种方法都有其独特的优势和局限性。[5],[6] 传统的酶联免疫吸附测定（ELISA）仍然是最经典的蛋白质检测方法。然而，其灵敏度通常仅达到ng/mL级别，无法满足超低丰度生物标志物的分析需求。[7]
为了提高微量蛋白质的检测灵敏度，出现了多种结合信号放大和新高灵敏度检测技术的策略，包括数字ELISA[8],[9]、核酸扩增辅助检测[10],[11],[12]以及酶催化放大[13],[14],[15]。其中，数字ELISA技术[8],[9]通过在微反应室中分离单个目标分子并通过计数进行定量，从而实现单分子检测，达到超高灵敏度。然而，数字ELISA需要高成本的仪器和试剂、复杂的操作程序以及严格的技术要求，这限制了其常规和广泛应用。核酸扩增辅助检测通过将免疫识别与核酸扩增技术相结合，实现了微量蛋白质的高灵敏度检测[10],[11],[12]。尽管该技术具有显著的灵敏度优势，但其复杂的操作程序、昂贵的设备和探针以及对终点污染的敏感性限制了其在常规实验室和大规模应用中的采用。酶和纳米酶可以通过催化信号分子的富集或组装在免疫测定中实现信号放大[6],[15]。这些方法在保持现有ELISA工作流程的同时显著提高了灵敏度，具有出色的兼容性和广阔的应用前景。然而，纳米材料的制备和表面修饰涉及复杂的过程，并且由于批次变化性、不稳定性和生物安全问题仍存在挑战。通常，酪胺信号放大（TSA）依赖于辣根过氧化物酶（HRP）在过氧化氢的作用下催化标记的酪胺分子（如荧光基团或生物素）在目标抗原或抗体附近的沉积，从而实现显著的信号放大[16],[17],[18],[19]。然而，TSA方法容易受到信号扩散和非特异性沉积反应的影响，导致背景信号增加、灵敏度降低以及相对较高的成本[16],[17],[18],[19]
最近，多巴胺（DA）介导的信号放大（DASA）因能够通过DA氧化产生的醌中间体与目标蛋白质之间的共价结合实现高灵敏度蛋白质检测而受到广泛关注[20],[21]。通过DA自聚合形成的多巴胺聚合物（PDA）表现出强的粘附性和光学特性[22],[23]。它选择性地与蛋白质中的胺基和巯基反应[24]，从而结合并组装大量酶，从而提高免疫测定的灵敏度。与传统HRP底物相比，DA可使聚合速率提高300多倍[25]。因此，基于DA的放大免疫测定方法因其简单性、快速性和高效性而越来越受欢迎。
与此同时，随着生物技术的快速发展，简便、成本高效和高通量信号输出模式已成为免疫测定发展的关键方向。目前，研究重点是通过利用广泛可用、易于操作和低成本的商业仪器或试剂（如个人血糖仪和 pregnancy 测试条）来开发通用检测平台[26]。
Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂基于水溶性四唑盐WST-8的还原反应，广泛用于实时监测细胞活力[27]。在该试剂的作用下，细胞中的线粒体脱氢酶在电子介质1-甲氧基-5-甲基吩嗪二甲硫酸盐（1-Methoxy PMS）的作用下发生还原反应，生成水溶性的橙黄色甲酚兰产物[28],[29]。光密度值与存活细胞数量呈线性相关。由于其操作简便、成本低廉、易获得和高通量，CCK-8测定方法为比色免疫测定提供了实用的解决方案，并且在其在生物分析和分子诊断中的应用方面越来越受到关注。
本文报告了一种新型比色免疫测定方法，该方法将DA介导的信号放大与CCK-8读数检测相结合。通过构建夹心免疫测定系统，连接到检测抗体的HRP在H?O?存在下快速催化多巴胺的沉积和原位自聚合。所得PDA层随后与引入的乳酸脱氢酶（LDH）结合。加入L-乳酸和NAD+后，LDH催化L-乳酸转化为丙酮酸并还原NAD+为NADH，从而引起CCK-8的颜色变化。这种方法提供了一种简单、高灵敏度和高通量的比色免疫检测方法，适用于微量蛋白质的检测。
