HILIC-MS/MS方法在细胞培养中用于分析谷胱甘肽代谢的开发和验证

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Development and validation of HILIC-MS/MS method for the analysis of glutathione metabolism in cell cultures

　　摘要：谷胱甘肽是一种关键的细胞内抗氧化剂，能够中和活性氧并参与解毒过程。其两种形式（还原型和二硫化物）的比例可作为细胞氧化应激的指标，这与急性和慢性疾病都有关。监测细胞内谷胱甘肽及其代谢相关的硫醇的水平对于正确表征细胞损伤非常重要。然而，现有的分析方法通常需要繁琐的化学衍生化处理，对高极性分析物的保留力和选择性不足，或者在分析复杂的代谢途径时会出现严重的基质效应。在这项研究中，开发并优化了一种基于亲水相互作用液相色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）的方法，无需进行化学衍生化即可全面分析细胞样本中的谷胱甘肽代谢。该方法专注于21种关键代谢物的无标记定量，包括完整的谷胱甘肽和其他硫醇、它们的氧化形式、前体氨基酸以及相关的含硫化合物。使用磺丁胺两性离子固定相，在HILIC模式下系统研究了色谱性能。最终方法采用0.05%的二氟乙酸作为流动相，并使用5%的5-磺osalicylic acid进行样品制备，以确保蛋白质的有效沉淀、硫醇的稳定以及与电喷雾离子化的兼容性。该方法表现出高分析性能，所有目标分析物的日内和日间精度（≤5%）和准确度（≤15%）均令人满意。将该方法应用于与CdCl2和顺铂共同培养24小时和48小时的A549肺癌细胞后，发现谷胱甘肽显著减少，并伴随着多种代谢改变，包括γ-谷氨酰半胱氨酸水平的升高。

引言：谷胱甘肽（GSH）是一种在细菌、植物和动物细胞中合成的关键低分子量抗氧化剂。它发挥多种重要作用，包括通过迈克尔加成反应解毒亲电试剂；还原活性氧；调节细胞周期、增殖和凋亡；回收其他抗氧化剂[1,2,3,4]；以及作为半胱氨酸（Cys）的储存库[5]。大多数细胞内的GSH浓度通常在1到2 mmol/L之间，而在肝细胞中可达到10 mmol/L[6, 7]。细胞外的浓度大约低1000倍[8, 9]，但有些例外情况，例如胆汁（0.5–10 mmol/L）[10]和支气管肺泡灌洗液（约400 μmol/L）[11]。GSH主要以巯基还原形式存在，但也可以通过氧化反应形成谷胱甘肽二硫化物（GSSG）[12]。在细胞内，GSSG占总谷胱甘肽的约1%[13]，GSH与GSSG的比例由谷胱甘肽还原酶利用NADPH维持[6]。NADPH的耗尽是细胞氧化应激的关键指标，尤其是在囊性纤维化[14]、白内障[15]、心血管疾病[16]、肾脏疾病[17]、骨关节炎、神经退行性疾病[18]、肺炎、肝感染和重金属中毒[8]中。GSH由三种氨基酸通过两个依赖ATP的酶促步骤合成。谷氨酸-半胱氨酸连接酶（GCL）催化从谷氨酸（Glu）和半胱氨酸（Cys）生成γ-谷氨酰半胱氨酸（gGC），随后谷胱甘肽合成酶添加甘氨酸（Gly）形成GSH[19,20,21]。GSH的合成受到gGC可用性的限制，这由GCL的活性决定[22]，GCL的活性可以被GSH抑制[20]，或者受到半胱氨酸可用性的限制[19]。最近的研究指出gGC是一种有前景的提高细胞GSH水平的物质[23]，即使口服给药也有效[24]，其细胞外浓度可达1–5 μmol/L[25]，细胞内浓度可达5–10 μmol/L[26]。由于GSH的浓度梯度很大，细胞外输出比细胞内导入更受青睐[27, 28]。在生理pH下，GSH带负电荷，无法自由穿过脂质膜，因此依赖于多种类型的膜转运蛋白进行导入和输出[13]。GSH的降解发生在细胞外，γ-谷氨酰转移酶会切割GSH、GSSG及其中的γ键，释放出半胱氨酸，形成γ-谷氨酰氨基酸和胱氨酰甘氨酸（CG）。在此过程中形成的gGC很容易被吸收并转化为GSH[19, 29]。

许多分析方法用于评估GSH的代谢，主要关注GSH与GSSG的水平及氧化应激的测定[30,31,32,33,34]。非分离型的生化方法主要使用分光光度或荧光光谱检测，因其灵敏度高而被广泛采用，但由于其他硫醇（如Cys、同型半胱氨酸、gGC、CG、蛋白质硫醇）的干扰而通常缺乏特异性[35,36,37]。相比之下，分离技术如高效液相色谱（HPLC）结合质谱（MS）或串联质谱（MS/MS）提供了极高的选择性和灵敏度，适用于GSH代谢的全面分析[38, 39]。大多数HPLC方法旨在评估GSH与GSSG的比例[32,33,34,40]，只有少数方法同时分析GSH、GSSG和其他硫醇或相关化合物[41,42,43,44]。反相（RP）HPLC通常使用十八烷基硅烷（C18）柱子和酸性流动相（由乙腈/水组成[32, 41,42,43]），并添加甲酸（FA）[41, 43, 45, 46]、甲酸铵[42, 45, 47, 48]、乙酸（AcA）[49]、乙酸铵[32, 50]、三氯乙酸（TCA）[38, 51]、三氟乙酸（TFA）[32, 50, 52]或磷酸铵[53]等添加剂。酸性pH可以减少硫醇的自氧化并增强分析物与固定相的相互作用。TFA还起到离子配对试剂的作用，改善峰形和选择性[39]。由于GSH、硫醇、氨基酸和肽的极性，通常需要通过N-乙基马来酰亚胺（NEM）[31, 50, 54]、5,5'-二硫代(2-硝基苯甲酸]（Ellman试剂）[33, 55]、碘乙酸[56]、邻苯二甲醛[34, 35]、单氯联胺[49]或单溴联胺[35]等试剂进行衍生化，以实现RP分离、提取或UV/荧光检测。尽管可以进行非衍生化的RP分离，但通常保留力差且峰容量低[43, 47]。

亲水相互作用液相色谱（HILIC）更适合于无需衍生化的分离极性化合物，结合了含有高有机溶剂的亲水固定相和流动相[42, 58]，这也增强了MS离子源中的溶剂脱附[39]。例如ZIC-HILIC柱中的磺丁胺固定相具有离子交换特性，从而提高了选择性[58, 59]。尽管有这些优势，许多现有的HILIC方法仍然依赖化学衍生化来获得足够的灵敏度[48, 59,60,61]，或者完全依赖于MS/MS的特异性而忽视了最佳的分离效果，这可能导致严重的基质干扰和离子抑制[41]。Lafaye等人早期尝试使用非衍生化的HILIC进行GSH代谢分析[42]。虽然他们的方法成功地使用了LC-MS进行代谢分析，但它依赖于体内15N均匀标记以实现准确的定量。尽管这种方法对在特定培养基中生长的酵母（Saccharomyces cerevisiae）非常有效，但全局同位素标记成本高昂、耗时较长，且实际上不适用于复杂的哺乳动物细胞培养模型或临床样本。因此，仍然迫切需要一种稳健的、无标记的HILIC-MS/MS方法，能够同时在复杂的生物基质中可靠地定量多种含硫代谢物。

HPLC分析的样品制备对于防止GSH和硫醇在生理pH下的自氧化至关重要。通过屏蔽硫醇基团[31, 50, 54]或使用5-磺osalicylic acid（SSA）[46, 55, 62]、苯磺酸[63]、TFA[32]、TCA[64]、高氯酸[38]或偏磷酸（MPA）[65]等酸降低pH值来实现稳定。酸还可以诱导细胞裂解和蛋白质沉淀，因此非常适合GSH分析。然而，MPA和卤化酸（TFA除外）不适合MS检测。另一种方法是先在液氮中淬灭细胞代谢，然后在冰冻甲醇中沉淀[41]。最近有综述详细介绍了GSH代谢和分析方法，特别是HPLC[66]。为了克服现有分析策略的局限性，本研究旨在开发并验证一种全面的、无标记的HILIC-MS/MS方法，用于同时定量21种参与谷胱甘肽和硫代谢的关键代谢物。据我们所知，这是首份无需化学衍生化即可测定细胞材料中大量代谢物的方法。通过结合优化的磺丁胺两性离子固定相和简单的基于酸的样品制备方法，该方法确保了易氧化的硫醇在细胞样本中的快速提取和稳定性，无需预先进行化学衍生化。此外，采用了多重标准添加法有效克服了基质干扰，从而消除了对昂贵或无法商业购买的同位素标记标准的依赖。通过针对重金属诱导的氧化应激下A549人类肺腺癌细胞的目标代谢组分析，证明了所开发方法的适用性和范围。

材料与方法：所有标准品（图1中显示的结构）包括l-谷胱甘肽（GSH）、l-谷胱甘肽二硫化物（GSSG）、γ-谷氨酰-l-半胱氨酸（gGC）、l-胱氨酰-l-甘氨酸（CG）、l-半胱氨酸（Cys）、l-半胱氨酸（CysS）、l-同型半胱氨酸（HCys）、l-同型半胱氨酸（HCysS）、l-胱硫氨酸（CT）、l-甘氨酸（Gly）、l-谷氨酸（Glu）、l-吡 glutamic acid（PGlu）、l-谷氨酰胺（Gln）、l-甲硫氨酸（Met）、l-甲硫氨酸亚砜（MetSO）、l-甲硫氨酸砜（MetSO2）、N-乙酰-l-半胱氨酸（NAC）、N-乙酰-l-甲硫氨酸（NAM）、S-腺苷酰-l-同型半胱氨酸（SAH）、S-腺苷酰-l-甲硫氨酸（SAM）、牛磺酸（Tau）、硒代-l-甲硫氨酸（SeMet）、硒代-l-半胱氨酸（SeCysS）、l-谷胱甘肽-(glycine-13C2,15N)（GSH IS）、l-谷氨酸-2,3,3,4,4-d5 (Glu IS）、acenaphthene和硫脲，均从Merck（德国达姆施塔特）购买。用于制备流动相（所有纯度适用于LC-MS）和样品准备的化学品，包括乙腈（ACN）、超纯去离子水、甲酸（FA）、二氟乙酸（DFA）、TFA、SSA、MPA、牛血清白蛋白（BSA）和基础必需培养基，也从Merck（德国达姆施塔特）获得。A549细胞系（人肺腺癌基底上皮细胞）购自美国典型培养物收藏中心（ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯）。

图1：该图像的替代文本可能是通过人工智能生成的。

分析物的化学结构及其缩写：GSH，l-谷胱甘肽；GSSG，l-谷胱甘肽二硫化物；gGC，γ-谷氨酰-l-半胱氨酸；CG，l-胱氨酰-l-甘氨酸；Cys，l-半胱氨酸；CysS，l-半胱氨酸；HCys，l-同型半胱氨酸；HCysS，l-同型半胱氨酸；CT，l-胱硫氨酸；Gly，l-甘氨酸；Glu，l-谷氨酸；PGlu，l-吡 glutamic acid；Gln，l-谷氨酰胺；Met，l-甲硫氨酸；MetSO，l-甲硫氨酸亚砜；MetSO2，l-甲硫氨酸砜；NAC，N-乙酰-l-半胱氨酸；NAM，N-乙酰-l-甲硫氨酸；SAH，S-腺苷酰-l-同型半胱氨酸；SAM，S-腺苷酰-l-甲硫氨酸；Tau，牛磺酸；SeMet，硒代-l-甲硫氨酸；SeCysS，硒代-l-半胱氨酸。

标准溶液的制备：每种分析物的标准溶液是通过将精确称量的标准品溶解在超纯去离子水中制备的。工作溶液和标准混合物随后通过用ACN稀释至所需浓度来制备，所有最终稀释均使用ACN/水混合物（9:1, v/v）进行。在提取步骤之前，向每个样品中加入含有GSH IS和Glu IS（0.5 mg/L）的内标（IS）混合物。为了验证和使用多重标准添加法进行样品分析，制备了一系列 spiked混合物溶液（低、中、高浓度用于验证，以及调整后的浓度用于样品分析）。所有标准添加 spiked溶液的详细组成和确切浓度在补充信息中的表S1中提供。

仪器和分析条件：包括固定相和流动相的选择在内的初步实验，使用了配备四级高压泵、自动进样器、柱温控制器和UV二极管阵列检测器的Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱系统进行。高效液相色谱（HPLC）系统与iQ/MSD检测器相连，该检测器工作在电喷雾离子化（ESI）模式下。数据采集和仪器控制是通过OpenLab CDS 2.5软件（Agilent公司，美国加州帕洛阿尔托）来执行的。正离子检测采用混合模式进行，其中50%为扫描模式（m/z 50–700），50%为选择离子监测（SIM），采集频率为5 Hz。监测的离子包括m/z 251±1（gGC）、308±1（GSH）、122±1（Cys）、76±1（Gly）、148±1（Glu）、241±1（半胱氨酸；CysS）和613±1（GSSG）。仪器参数自动设置如下：周期时间201毫秒；裂解电压90–120伏；气体温度325摄氏度；气体流量11升/分钟；喷雾器压力50磅/平方英寸；毛细管电压3.5千伏。

为了确定最佳的色谱柱用于分离分析物，对各种固定相（表S2）和流动相进行了全面筛选。评估的固定相包括传统的反相色谱柱（C18）、混合模式色谱柱、裸硅柱和专用的HILIC色谱柱。流动相由去离子水和乙腈混合而成，测试了不同浓度的多种挥发性添加剂，如FA、AcA、甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵、TFA和DFA。

对每种固定相和流动相组合进行了等效分离实验，以评估整体色谱性能，主要关注保留时间、选择性和两个模型分析物GSH和gGC的峰形。色谱柱的死时间t0是通过在HILIC模式下使用苝和在反相模式下使用硫脲来测定的。注射体积为5微升，柱温保持在30摄氏度，流速设定为0.4毫升/分钟。

### HPLC-MS/MS条件的优化
所有实验均使用Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统（Agilent公司，美国加州帕洛阿尔托）进行，该系统配备了四元高压泵、恒温自动进样器、恒温柱室和二极管阵列紫外检测器。液相色谱仪与工作在ESI模式下的Agilent 6475三重四极杆质谱仪相连。系统由MassHunter 12软件（Agilent公司，美国加州帕洛阿尔托）进行控制。

在选择最佳的固定相和流动相组合时，考虑了几个物理化学特性，包括单同位素质量（MM）；辛醇/水分配系数的对数（疏水性因子；log P）；酸解离常数的负十进制对数（pKa）；以及亲水性因子（Hy），后者反映了分子通过氢键或偶极相互作用与水相互作用的能力，这些数据是通过alvaDesc软件（Alvascience公司，意大利莱科）计算得出的。这些分子描述符的概要总结在表S3中。

### 最终方法
色谱分离是在ZIC-HILIC色谱柱上进行的（150×2.1毫米，3.5微米，100埃；Merck公司，德国达姆施塔特）。使用非保留标记物苝确定了柱子的保留体积，结果为0.33毫升。流动相由水（流动相A）和乙腈（流动相B）组成，两者都含有0.1%（体积比）的FA、0.05%（体积比）的DFA和0.05%（体积比）的TFA。流动相流量为0.4毫升/分钟。在20分钟内从2%到70%流动相A应用线性梯度，随后进行8分钟的平衡步骤，恢复到初始梯度条件。柱室温度保持在30摄氏度，自动进样器温度设定为10摄氏度。注射体积为1微升。每次进样循环前后都使用ACN/水（8:2，体积比）溶剂进行注射器和阀门的清洗。

**ESI源**工作在正离子化模式下，三重四极杆质谱仪配置为MRM模式。每个分析物（定量离子和定性离子）的优化MRM过渡、裂解电压和碰撞能量在表S4中提供。ESI源参数手动优化如下：毛细管电压3.5千伏；喷嘴电压600伏；气体流量11升/分钟；鞘气流量10升/分钟；喷雾器压力35磅/平方英寸；气体温度300摄氏度；鞘气温度250摄氏度。

### 样品制备
A549细胞系用于方法优化、验证和应用。细胞在添加了10%（体积比）胎牛血清、2毫摩尔/升L-谷氨酰胺、1毫摩尔/升丙酮酸钠、10毫摩尔/升HEPES和50微摩尔/升青霉素/链霉素的最小必需培养基中培养，并在含有5%二氧化碳的无菌湿润环境中保持在37摄氏度。A549细胞以每孔0.2×10^6个细胞的密度接种到24孔板中。24小时后，去除培养基，并按照以下样品制备程序处理细胞。

评估了三种去蛋白化方法，以优化提取回收率、样品纯化效率和检测器响应。提取溶液由乙腈/水（1:1，体积比）组成，其中含有5%（体积比）的MPA、5%（体积比）的SSA或5%（体积比）的TFA。这些酸有助于细胞裂解、去蛋白化和防止巯基氧化。所有三种提取溶液的样品制备程序是相同的。

向每个细胞团块中加入200微升提取溶液和10微升内标（IS）混合物。样品在4摄氏度下 vortex 10分钟，然后再次 vortex。随后用孔径为0.2微米的尼龙过滤器过滤样品，并在装有离心机的微管中以20,000×g离心10分钟，温度为4摄氏度。上清液用乙腈稀释5倍，以达到大约9:1（体积比）的乙腈/水比例。制备好的样品储存在-20摄氏度下直至分析。

### 方法验证
评估了上述三种提取溶剂（MPA、SSA和TFA）的样品制备效率、提取回收率、基质效应、酸效应和去蛋白化效率。除非另有说明，否则所有实验都以1微克/毫升的浓度进行重复实验。提取回收率（ER）是通过比较提取前添加了标准品的细胞样本与提取完成后添加了标准品的匹配细胞样本的 analyte 峰面积来确定的，计算公式如下：
$$\text{ER}(\text{\%}) = \frac{\text{提取前添加的标准品的 analyte 峰面积}}{\text{提取后添加了标准品的 analyte 峰面积}} \times 100$$
(1)

基质效应（ME）是通过比较提取后的细胞样本、未添加标准品的细胞样本和在提取溶剂中的标准品溶液来评估的，计算公式如下：
$$\text{ME}(\text{\%}) = \frac{\text{提取后添加了标准品的 analyte 峰面积} - \text{未添加标准品的 analyte 峰面积}}{\text{含有提取溶液的标准品的 analyte 峰面积}} \times 100$$
(2)

酸效应（AE）是通过测量在酸性提取溶剂中制备的标准品溶液中的 analyte 峰面积与在无酸溶剂中制备的相同标准品的峰面积的百分比比来评估的。

去蛋白化效率是通过测量每次提取等分液中的蛋白质含量来确定的，在用乙腈稀释5倍之前进行。蛋白质含量使用Bradford测定法 [67] 进行定量。

### 多标准添加法
在验证过程中，新鲜制备了混合的A549细胞提取物。使用多标准添加（SA）方法进行方法验证。为了同时评估三种浓度水平（低、中、高）的准确性和精度，准备了未添加标准品的样本以及代表这三个水平的第一标准添加（SA1 low、SA1 med、SA1 high）的样本。为了对这些SA1样本进行定量，向各自的等分液中添加了两个后续的标准添加（SA2和SA3）。这种验证设计允许使用未添加标准品的样本、SA2和SA3构建校准曲线，以准确量化SA1样本并通过决定系数（R2）验证线性。对于常规样品分析，使用了调整后的浓度水平的简化两点标准添加方法。样品的浓度c?是使用公式(3)计算的：
$$c_x = \frac{\text{SA1的 analyte 峰面积}}{\text{未添加标准品的 sample的 analyte 峰面积的斜率}}$$
(3)

所有标准添加在低、中、高水平的验证浓度列在表S1中。定量限（LOQ）和检测限（LOD）是基于信号与噪声比为10:1（LOQ）和3:1（LOD）通过实验确定的。

### 准确性和精度
使用混合的A549细胞提取物在三种浓度水平（SA1 low、SA1 med、SA1 high）下评估准确性和精度。日内精度和准确性是在单日内确定的（n=3），而日间精度和准确性是在连续三天内评估的（n=9）。准确性表示为理论添加浓度的百分比回收率（RE），而精度则通过变异系数（CV）来评估。

### 分析化合物的稳定性
在添加了一个标准添加（Adj. SA1）的调整后的浓度下，评估了分析物的稳定性，如表S1所列。短期至中期稳定性是通过在自动进样器中以10摄氏度存放24小时、3天和6小时的样品的峰面积恢复百分比来评估的，相对于初始测量的峰面积。

### 样品分析
该方法应用于在含有CdCl?（50和100微摩尔/升）或顺铂（100和200微摩尔/升）中培养的A549细胞，培养时间为24小时和48小时，并与未经处理的对照组进行了比较。为了定量，每个样品准备了三个等分液：未添加任何添加剂的和添加了两个调整后的标准添加（Adj. SA1、Adj. SA2）的。调整后的添加溶液的确切浓度列在表S1中。分析物浓度是使用前面描述的标准添加方法（公式(3)计算的。结果表示为与对照样品相比的分析物水平的百分比变化。使用标准的双样本t检验（p<0.05）评估了毒素处理样品与对照样品之间的统计显著性。

### 结果与讨论
#### 分离和分析条件的优化
对固定相和流动相进行了初步筛选（表S2），并结合了各种流动相添加剂（例如FA、甲酸铵/碳酸氢铵、TFA、DFA），以分离GSH和gGC。传统的反相和混合模式色谱柱缺乏足够的保留能力，而在HILIC模式下操作的裸硅柱提供了较强的保留能力，但在测试条件下峰形较宽。使用专用的HILIC色谱柱获得了更好的分离效率。在所有测试的组合中，ZIC-HILIC色谱柱在保留能力和选择性方面表现最佳，这体现在两种分析物的明显保留因子（图S1）以及由于离子型固定相的高水和饱和能力而产生的优异峰形[68]。此外，在最初的实验中，通过在乙腈/水混合液中（9:1；体积比）制备所有标准品和提取物，成功消除了由于样品中含有高水量而导致的宽峰或畸变峰。通过减少样品注射量也可以达到类似的效果。

#### 梯度和HPLC-MS/MS条件的优化
分析物结构中的各种极性官能团，如羧基、胺基或巯基，使它们适合在极性固定相上的HILIC模式下进行分析。ZIC-HILIC色谱柱提供了最佳的保留能力和选择性。核壳颗粒相比全多孔颗粒提供了更好的峰形、更快的分离速度和更低的背压。然而，由于在核壳HILIC色谱柱上观察到的GSSG峰宽化，选择了带有全多孔颗粒的ZIC-HILIC色谱柱，这可能是由于空间效应所致。流动相由水相（流动相A）和乙腈（流动相B）组成。虽然可以在碱性pH下进行分离，但由于提高了柱子的稳定性和大多数分析物的检测器响应，更倾向于使用酸性pH。评估了0.1%（体积比）FA、0.05%（体积比）DFA和0.05%（体积比）TFA在流动相A和B中的添加效果，对它们的保留时间（图2）、峰宽（图S1）和检测器响应（图S2）进行了评估。

#### 流动相中酸性添加剂的效果
流动相中酸性添加剂对选定分析物的保留时间和检测器响应的影响。在ZIC-HILIC色谱柱（150×2.1毫米，3.5微米，100埃）上进行了梯度分离，流动相由0.05% DFA/TFA、0.1% FA（体积比）组成，线性梯度洗脱（从2%（体积比）到70%（体积比）流动相A，持续20分钟；8分钟平衡）。选择0.05%（体积比）DFA作为最佳添加剂，它在分离性能和检测器响应之间取得了平衡。更高的DFA浓度（≥0.1%；体积比）会导致显著的离子抑制。应用从2%（体积比）到70%（体积比）流动相A的线性梯度，以保留较少极性的化合物，包括NAC、NAM和PGlu，同时确保强保留化合物在合理的时间内洗脱。需要至少2%（体积比）的水相含量来维持固定相表面的亲水相互作用机制。优化的分离过程显示在图3A中。尽管某些化合物在色谱分离上未能完全分离，但使用MS/MS检测条件并结合MRM模式后，这些化合物得到了完全分离。对于每个化合物，检测窗口设置为3分钟（GSSG的检测窗口为4分钟）。图3B展示了一个热图，显示了重叠检测窗口的数量。在任何给定的保留时间内，同时发生的MRM转捂数量最多不超过10个，这完全在仪器的理论和实际限制范围内。这确保了每个色谱峰有足够的停留时间和数据点数量，从而避免了方差显著增加或灵敏度下降的问题。

图3
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
原始尺寸图像

A 一种标准溶液混合物的色谱图（1 μg/mL），包括1，NAM；2，NAC；3，PGlu；4，SeMet；5，Met；6，HCys；7，Cys；8，gGC；9，CG；10，MetSO2；11，Gly；12，Glu；13，GSH；14，Gln；15，MetSO；16，Tau；17，SAH；18，HCysS；19，GSSG；20，SeCysS；21，CT；22，CysS；23，SAM；分离是在ZIC-HILIC柱子上进行的（150 × 2.1 mm，3.5 μm，100 ?），流动相由0.05%（v/v）的DFA组成，在水（流动相A）和乙腈（流动相B）中。采用了线性梯度洗脱（2%到70%的流动相A在20分钟内；8分钟平衡时间）。

B MS/MS检测中化合物保留窗口重叠的热图。每个化合物的检测窗口为3分钟（包括GSH IS和Glu IS），GSSG为4分钟窗口。

通过将纯标准溶液直接注入质谱仪，对每个分析物的MRM转换进行了优化。选择丰度最高的产物离子进行定量，而第二丰度的离子被优化为次要鉴定转换。所有分析物在正ESI模式下的响应明显更好，这与酸性流动相一致。除了GSSG外，所有分析物的前体离子都是单电荷[M+H]?，GSSG同时显示了单电荷（[M+H]?，m/z = 613）和双电荷（[M+2H]2?，m/z = 307）离子。双电荷的GSSG前体离子提供了显著更好的检测器响应，正如Sun等人之前报道的[31]。尽管在未表征的基质中进行严格痕量分析通常会使用次要（确认/鉴定）MRM转换，但在细胞培养物的常规分析过程中，我们仅监控了主要定量转换。选择这种方法是为了简化数百次样品注射所需的大量数据处理，因为定义明确、可预测的体外细胞培养基质，加上精确的保留时间匹配，足以提供分析物鉴定的信心。然而，如果将该方法应用于高度变化的临床或环境样品（如来自不同个体的组织或血浆），其中基质干扰的风险显著增加，定量和鉴定转换都可以轻松实现。所有优化的转换、碎片器电压和碰撞能量都列在表S4中。分析的最佳锥形电压为3.5 kV。

样品制备条件的优化
为了确保有效的细胞裂解、蛋白质沉淀以及在低pH下对易氧化巯基的稳定，评估了三种常见的酸性提取溶液在去蛋白效率（图4A）、提取回收率（图4B）、基质效应（图S3）以及所用酸的影响（图S4）方面的表现。提取溶剂由乙腈/水（1:1，v/v）组成，其中含有5%（v/v）的MPA、5%（v/v）的SSA或5%（v/v）的TFA。MPA提供了最高的去蛋白效率，但导致了显著的离子抑制，特别是对于SAH和SAM，其信号被完全抑制。相比之下，SSA和TFA的影响较温和，SSA显著增强了多个分析物的检测器响应。TFA的去蛋白效率最低。因此，由于SSA在去蛋白效率和大多数分析物的检测器响应方面表现优异，被选为最佳提取溶液。

图4
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
原始尺寸图像

A 使用Bradford测定法[67]测定的不同酸溶液去蛋白后的蛋白质含量；MPA（焦磷酸），SSA（5-磺osalicylic acid），TFA（三氟乙酸）。

B 不同酸溶液的提取回收率；MPA，焦磷酸，TFA，三氟乙酸

三种酸的提取回收率和基质效应相当。Gly观察到了显著的基质效应（回收率<30%），可能是由于与样品基质中其他极性离子化合物或金属离子的相互作用。测试的酸溶解在ACN/水混合物（1:1，v/v）中，以最大化所有分析物的提取效率，同时通过有机溶剂促进蛋白质沉淀。选择ACN/水的比例是为了避免分析前过度稀释样品的需要。由于HILIC分离需要注射样品中较高的有机含量（9:1，v/v，ACN/水）以保持最佳的峰形和选择性，使用初始高比例的乙腈可以实现最小的最终稀释。这种方法确保了痕量级别分析物的足够浓度，即使稀释程度较低的样品也会导致较高的基质效应。

方法验证
在A549人类肺腺癌细胞系中，通过对GSH及相关化合物的分析，验证了所开发的方法。A549细胞提取物（以及一般细胞提取物）的复杂性作为基质，使得使用不含内源性分析物和细胞碎片的商业可用基质变得困难，这使得传统的外部校准难以处理基质效应。在初步实验中，比较了加标A549细胞提取物、加标BSA溶液和加标提取溶剂（提取前）在三个浓度水平（40、200和1000 ng/mL）下的校准曲线斜率。对于BSA溶液，提取溶剂中加入10 μL的4 mg/mL BSA溶液来模拟细胞提取物中的蛋白质含量。结果显示，加标BSA溶液的斜率与加标提取溶剂（无基质）的斜率非常接近，而加标A549细胞提取物的斜率则有显著差异，表明在每500 μL含有0.2 × 10?个细胞的细胞密度下存在强烈的基质效应（图5A中展示了GSH和Glu的例子）。这些发现表明基质效应主要是由非蛋白质干扰引起的，从而证实了有效的去蛋白效果。因此，BSA溶液被认为不适合作为外部校准的基质替代品。

图5
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。
原始尺寸图像

细胞基质、BSA基质和空白样品中A谷胱甘肽（GSH）和谷氨酸（Glu）的校准曲线斜率，未使用同位素标记的内部标准（IS）；B 使用同位素标记的IS的GSH和Glu

当采用同位素稀释方法时，使用HPLC-MS/MS进行定量分析非常可靠，其中稳定的同位素标记内部标准（IS）可以有效补偿基质效应（图5B中展示了GSH和Glu的例子）。相反，传统的外部校准（不使用内部标准）通常仅限于量化基质效应可以忽略的高度稀释样品。然而，同位素标记的IS通常价格昂贵或对于某些化合物不可用，而且对于结构多样的化合物使用单一同位素标记的IS是不合适的，因为它们在保留时间、基质效应、离子抑制、碎片化和电离效率方面存在差异。在本研究中，只有谷胱甘肽（GSH IS）和谷氨酸（Glu IS）有同位素标记的IS。因此，采用了多重标准添加方法进行方法验证，即使存在显著的基质效应，也能实现准确的定量。

通过用乙腈稀释将样品中的最终细胞密度调整至每1000 μL 0.2 × 10?个细胞，以达到9:1（v/v）的乙腈/水比例，如上所述，确保了HILIC分离中的峰形对称。使用基于标准添加SA1、SA2以及未加标样品的低、中、高浓度水平的决定系数（R2）来验证线性（表S1和S5）。定量限（LOQ）和检测限（LOD）是根据实验确定的，使用低浓度标准溶液时信号与噪声比为10:1（LOQ），使用3:1（LOD），如表S5所报告。实验确定的LOD范围从0.15到1.5 ng/mL，而相应的LOQ范围从0.5到5 ng/mL，具体取决于分析物。这种灵敏度水平与之前发布的HPLC-MS/MS方法相当，这些方法用于巯基分析。特别是，我们获得的限值与其他先进的非衍生化HILIC-MS/MS方法完全一致，这些方法的目标代谢谱谱通常报告的LOD范围在0.1–25 ng/mL [41, 42]。虽然某些方法采用繁琐的柱前化学衍生化结合荧光或MS/MS检测可以达到fmol/L或pmol/L范围的更低限值 [57, 69]，但它们通常会牺牲分析化合物的范围和分析通量。此外，与通常在μmol/L范围内的传统UV或电化学方法[51, 70]相比，我们的方法提供了显著更高的灵敏度。最重要的是，这些定量限对于我们的应用来说是完全足够的，因为A549细胞系中目标分析物的内源性浓度远高于各自的LOQ，确保了稳健和准确的定量，无需进一步样品预浓缩。两种化合物，包括SeCysS和SeMet，由于它们主要结合在蛋白质中，在去蛋白步骤中被有效去除，因此在制备的细胞样品中的浓度低于检测到的LOD，因此不进一步验证。

准确性和精度
该方法在三天内（n = 3）和三天间（n = 9）对三种浓度水平（低、中、高；表S1）的准确性和精度进行了评估。准确性表示为平均回收率（RE），精度表示为变异系数（CV）。日内精度（CV）分别为低（L）、中（M）和高（H）浓度水平的0.4–4.4%、0.4–2.9%和0.4–4.8%。日间精度分别为L、M和H水平的1.9–11%、0.9–6.8%和1.0–5.3%。日内准确性（回收率）分别为L、M和H水平的85–125%、88–115%和92–117%，而日间准确性分别为89–120%、88–112%和93–114%。验证标准是根据广泛接受的生物分析方法验证指南建立的，例如FDA行业指南[71]。具体来说，可接受的限值为精度（CV）≤15%和准确性（回收率）在85–115%范围内，而在接近LOQ的低浓度水平下允许稍微宽的限值（CV ≤ 20%，回收率80–120%）。此外，还使用了稳定的同位素标记内部标准来验证验证方法的总体可靠性。比较显示，无论是否使用内部标准，计算出的数据在准确性和精度上没有显著差异。如表S6和S7所示，所获得的参数几乎满足了所有目标分析物的严格标准。

当使用多重标准添加方法时，如果添加的标准浓度是样品中分析物浓度的整数倍时，可以获得最佳的准确性。对于天然存在于高浓度水平的分析物（如Gln、Glu和GSH），在低浓度水平进行验证可能具有挑战性，因为低浓度SA的响应可能与内源性浓度没有显著差异，从而导致不准确的结果。因此，为了建立一个现实且高效的工作流程来处理未知生物样品，首先对代表性混合样品进行定性筛选运行，以估计所有分析物的基线浓度。根据这些估计，定制了一种优化的标准添加混合物，使得添加量接近内源性浓度的整数倍，从而最大化了方法的准确性。这种针对性方法显著简化了过程：对于实际的定量样品分析，每个样本重复只需要三次注射（未加标、Adj. SA1、Adj. SA2）。表S1列出了方法验证和样品分析的所有标准添加的确切浓度。

A549细胞提取物中分析物的稳定性在调整后的浓度水平（Adj. SA1）下进行了评估，如表S1所列。稳定性通过样品在10°C下储存24小时、3天和7天后，相对于初始分析的峰面积回收百分比来评估。大多数分析物的回收率在7天后仍在可接受范围内（图S5A）。对于两种分析物，即Gln和PGlu，观察到浓度有显著变化。7天后，谷氨酰胺（Gln）的回收率下降到大约30%，而聚谷氨酸（PGlu）的浓度显著增加，超过了700%的回收率（见图S5B）。这种现象很可能是相互关联的，因为谷氨酰胺可以通过其侧链酰胺基团失去铵离子而自发地、非酶促地环化形成聚谷氨酸。这一过程在稳定的谷胱甘肽（GSH）和其他巯基化合物所需的酸性pH条件下得到放大。尽管如此，包括谷氨酰胺和聚谷氨酸在内的所有分析物在样本制备后的前24小时内都表现出优异的回收率。

为了证明所开发方法的实际应用能力，我们选择了一个特征明确的生物模型：暴露于氯化镉（CdCl?）和顺式二氨基二氯铂（cis-[Pt(NH?)?Cl?]，简称cisPt）的A549人肺腺癌细胞。这两种基于重金属的化合物已被广泛记录为能诱导严重的氧化应激并破坏细胞内的谷胱甘肽水平 [72, 73]。因此，它们作为测试我们方法分析性能的理想阳性对照。然而，虽然这些毒素导致谷胱甘肽池的耗尽是一个已知现象，但大多数传统研究仅限于测量谷胱甘肽（GSH）和二硫代谷胱甘肽（GSSG）。我们全面的HILIC-MS/MS方法的重要附加值在于它能够同时定量硫诱导途径中广泛的上下游代谢物。因此，除了确认谷胱甘肽的耗尽外，我们的方法还揭示了很少直接量化的复杂代谢变化 [74]，例如gGC在细胞内的显著积累以及CG、CT和Tau的特定变化。这种代谢分辨率水平表明了该方法在揭示毒理学机制方面的潜力。

A549细胞在两种重金属毒素的作用下分别孵育24小时和48小时，剂量分别为50 μmol/L和100 μmol/L的CdCl?以及100 μmol/L和200 μmol/L的cisPt，并设置了两个未加毒素的对照样本。监测了毒素处理样本与对照样本中分析物浓度的变化，并以百分比回收率表示。结果展示在图S6–S8中。进行了双样本t检验，以评估处理样本与对照样本之间的显著差异；显著性用p值表示。处理样本和对照样本的绝对浓度总结在表S8中，相应的p值列在表S9中。

通过HPLC-MS/MS测定，两种毒素均显著改变了硫代谢。随着毒素浓度和暴露时间的增加，观察到GSH、Tau、CT、HCys、HCysS和NAM的显著减少（见图S6–S8）。相反，CysS显著增加，而GSSG仅观察到轻微的、统计上不显著的增加（见图S8）。在暴露于100 μmol/L的CdCl?或100/200 μmol/L的cisPt 48小时后，观察到谷氨酰胺（Gln）的显著增加。在暴露于50或100 μmol/L的CdCl? 24小时后，观察到gGC的显著增加，这与Nyvltova等人的研究结果一致 [75]，表明GCL的上调以补偿谷胱甘肽的耗尽。然而，在暴露于100或200 μmol/L的cisPt 48小时后，gGC显著下降。同样，CG（一种谷胱甘肽的降解产物）在暴露于50或100 μmol/L的CdCl? 24和48小时后显示出显著增加，而在暴露于100或200 μmol/L的cisPt的样本中则显示出显著下降。其他分析物的变化在统计上不显著；尽管如此，这些数据也被包括在内：Cys、Gly、Glu、PGlu、Met、MetSO、MetSO?、SAH和SAM（见图S6–S8）。为了更精确的定量，理想情况下可以将处理细胞中的分析物浓度标准化到DNA含量或反映细胞活力的蛋白质标记物，因为毒素会对细胞分裂产生影响（持续24和48小时）。尽管本研究使用了绝对浓度，但多个分析物都观察到了明显的趋势和显著变化。此外，为了验证所采用的多种标准添加法的稳健性，比较了使用和不使用相应稳定同位素标记内标时的GSH和Glu的回收率。如图S6所示，两种方法之间的差异很小，证实了我们定量策略的可靠性。这两种毒素对谷胱甘肽耗尽的影响与先前的研究结果一致 [76, 77]。

在这项研究中，我们开发并验证了一种新型的无标记HPLC-MS/MS方法，用于同时定量参与谷胱甘肽和硫代谢的21种关键代谢物。虽然存在许多用于GSH/GSSG分析的方法，但它们通常依赖于繁琐的化学衍生化，或者对极性强的前体氨基酸和巯基化合物的保留力或选择性较差。我们的方法通过结合一种磺丁胺ZIC-HILIC固定相和0.05% DFA添加剂的酸性流动相来克服这些限制。这种特定的配置利用了亲水性和离子相互作用的结合，确保了所有关键极性分析物的优异保留、分离和对称的峰形，而无需任何预先的化学修饰。

多分析物MS/MS定量中的一个主要瓶颈是，大多数这些特定硫代谢物的稳定同位素标记内标要么价格昂贵，要么在市场上难以获得。为了在不依赖这些标记类似物的情况下补偿严重的基质效应，我们成功实施了一种稳健的多标准添加法，并结合了简单的5% SSA提取技术。这种策略提供了一种高度可靠且经济有效的替代方案，优于传统的外部校准和同位素稀释技术，即使对于受到严重基质抑制的分析物也能达到高精度（≤?5%）和准确性（≤?15%）。

通过分析暴露于CdCl?和cisPt的A549人肺腺癌细胞中的毒素诱导的变化，成功展示了这种新开发方法的适用性和优越的分析覆盖范围。该分析提供了氧化应激下谷胱甘肽和硫代谢的详细图谱，不仅捕捉到了预期的谷胱甘肽耗尽，更重要的是，还捕捉到了gGC和CG的急性上调及其随后的急性耗尽。与谷胱甘肽类似，其他化合物（Tau、CT、HCys、HCysS、NAM）逐渐减少，而CysS和Gln则逐渐积累。最终，这种方法为复杂生物样本中硫代谢的靶向代谢组学研究提供了一种强大、易于使用且高度可靠的分析工具。