综述：杜氏肌营养不良症的基因编辑策略：从分子机制到临床转化

《Cells》：Gene Editing Strategies for Duchenne Muscular Dystrophy: From Molecular Mechanisms to Clinical Translation Ayesha Siddika, Jo?l Rousseau, Félix Veillette, Camille Bouchard, Yaoyao Lu and Jacques P. Tremblay

　　

杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）因其在终末分化的肌肉组织中实现持久、全身性抗肌萎缩蛋白恢复的困难，在遗传医学领域仍是一个重大挑战。尽管目前的疗法——包括外显子跳跃和微抗肌萎缩蛋白基因替代——已证明了临床可行性，但其益处受限于疗效不完全、突变特异性以及需要重复或高剂量干预。这些局限性凸显了对能够直接、永久纠正潜在遗传缺陷的策略的需求。基因组编辑的最新进展使得基于CRISPR的技术成为实现此目标的有希望的候选者。基因编辑平台并非作为单一方法发挥作用，而是包含了一系列策略——包括外显子删除、外显子重构、碱基编辑和先导编辑——每种策略根据突变背景具有不同的优势。特别是，精确编辑工具的出现实现了可控的核苷酸水平修饰，扩大了可纠正的突变范围，同时减少了对双链DNA断裂的依赖。在本综述中，我们采用比较和转化的视角来评估DMD的基因编辑策略。研究人员考察了不同方法如何与特定的突变类型相匹配，总结了临床前研究的关键发现，并分析了临床实施的主要障碍，包括递送效率、免疫反应、编辑持久性和基因组安全性。我们进一步讨论了旨在解决这些局限性的编辑技术和递送系统方面的新兴创新。总的来说，这项工作将基因编辑重新定义为一个以决策为导向和应用驱动的治疗框架。基因组工程、递送平台和肌肉生物学方面进展的持续整合，对于将这些技术转化为能够改变DMD临床进程的安全、有效和持久的治疗至关重要。

论文主体内容总结

1. 引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是遗传医学中最严峻的挑战之一，这不仅由于其严重性和进行性，还因为在骨骼肌和心肌等有丝分裂后组织中实现持久治疗性校正的困难。当前疗法（如外显子跳跃、基因替代）虽可行，但受限于不完全的蛋白恢复、短暂疗效和递送效率低，无法实现持续、全身性的抗肌萎缩蛋白（dystrophin）恢复。这推动了对可直接、永久纠正基因缺陷的基因组靶向干预的关注。基因编辑技术，特别是基于CRISPR的系统，已成为有希望的候选方案。然而，并非所有编辑策略都提供同等优势。依赖双链DNA断裂（如CRISPR/Cas9介导的编辑）的方法可恢复阅读框，但伴有修复结果的变异性和潜在安全问题，包括脱靶效应和非预期的插入/缺失。相比之下，新一代精确编辑平台（包括碱基编辑和先导编辑）可进行更可控、可预测的序列修饰，而无需引入双链断裂，从而可能提高安全性和通用性。本综述旨在从比较和转化相关性的角度，探讨哪些基因编辑策略最适合解决DMD的多样化突变谱，并分析决定其转化成功的关键因素。

2. DMD的遗传基础和病理生理机制

DMD是一种X连锁隐性抗肌萎缩蛋白病，由位于Xp21.2-p21.1的DMD基因编码的抗肌萎缩蛋白缺失引起。抗肌萎缩蛋白是位于肌膜胞质面的杆状细胞骨架蛋白，是抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合体（DAPC）的组织中心。DMD基因巨大（约2.2 Mb），包含79个外显子，高发新生突变。常见的致病突变包括全外显子缺失（约68%）、外显子重复（约11%）和无义突变（约10%）。突变可遍布全基因，但在外显子3-19和外显子45-55之间存在两个突变热点。抗肌萎缩蛋白包含四个主要功能域：N端肌动蛋白结合域（ABD，外显子1-8编码）、由24个血影蛋白样重复序列和四个铰链区组成的中央杆状域（外显子8-64编码）、富含半胱氨酸域（CR，外显子64-70编码）和C端域（CT，外显子71-79编码）。其通过C端富含半胱氨酸域与跨膜蛋白β-抗肌萎缩蛋白聚糖（β-dystroglycan）相互作用，并通过N端域与胞质内的肌动蛋白等连接，从而在细胞外基质和肌动蛋白细胞骨架之间建立机械连接。抗肌萎缩蛋白的主要功能是作为“减震器”保护肌纤维免受收缩诱导的损伤，并参与多种信号通路。抗肌萎缩蛋白的缺失会破坏DAPC，导致其成分从肌膜上错误定位和下调，引发钙内流增加、氧化应激和肌坏死。病理特征包括持续的退化和再生循环、炎症、广泛的纤维化和脂肪组织沉积，最终导致卫星细胞耗竭和功能衰退。保留翻译阅读框的框内（in-frame）外显子缺失会产生内部缺失但部分功能的抗肌萎缩蛋白，与较温和的贝克型肌营养不良症（BMD）表型相关，这启发了旨在将严重DMD表型转化为温和BMD表型的治疗策略。

3. 已批准的DMD疗法

目前的DMD临床实践采用多学科方法，包括皮质类固醇、截短抗肌萎缩蛋白（微/小型）基因治疗、外显子跳跃疗法、支持疗法等。皮质类固醇可缓解继发症状，但非根治性且有显著副作用。表达半功能抗肌萎缩蛋白以模拟BMD样表型是有前景的策略，AAV（腺相关病毒）介导的微抗肌萎缩蛋白基因治疗（如delandistrogene moxeparvovec）已在2023年获FDA加速批准。外显子跳跃疗法通过反义寡核苷酸（AONs，如eteplirsen、golodirsen、viltolarsen、casimersen）恢复开放阅读框（ORF），但存在短暂效应、递送效率低、突变特异性强、治疗成本高等局限。所有这些疗法均未解决疾病的根本遗传病因，无法实现终生的抗肌萎缩蛋白表达恢复。相比之下，基因编辑疗法有潜力一次性永久纠正DMD基因，克服现有疗法的许多局限性。

4. 基因编辑治疗策略

基因编辑技术通过实现对基因组的精确修饰，为DMD提供了新的治疗机会。这些技术包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas9系统、碱基编辑和先导编辑，提供了靶向和修复DMD致病变异的工具。

4.1. CRISPR/Cas9系统

CRISPR系统起源于细菌适应性免疫机制，已被改造为可编程基因组编辑平台。其核心是sgRNA（单导RNA）和Cas核酸内切酶协同作用，在存在PAM（前间区序列邻近基序）序列的情况下识别基因组靶标并诱导DNA双链断裂（DSBs）。不同Cas直系同源物（如SpCas9、SaCas9、CjCas9）具有不同的PAM序列和大小，提供了不同的靶向灵活性、效率和递送兼容性。通过结构引导和定向进化改造可扩展PAM兼容性和识别保真度。催化修饰的Cas9形式，如切口酶（nCas9）和核酸酶失活Cas9（dCas9），可减少或消除双链切割，提高安全性，并与功能域融合后实现碱基编辑和转录调控等新类别基因组操作。

4.2. 碱基编辑

碱基编辑（BE）无需创建DNA DSBs即可实现精确、永久的基因组修饰，克服了CRISPR/Cas系统的局限性。它使用Cas9切口酶切割单链DNA，并结合胞嘧啶脱氨酶或脱氧腺苷脱氨酶等特殊酶来修饰特定碱基。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）催化胞嘧啶（C）脱氨为尿嘧啶（U），最终将C:G碱基对转换为T:A。腺嘌呤碱基编辑器（ABE）催化腺嘌呤（A）脱氨为肌苷（I），最终将A:T转换为G:C。尽管具有低插入/缺失（indel）风险和高效率，BE仍存在脱靶效应、旁观者编辑和PAM要求严格等潜在风险。

4.3. 先导编辑

先导编辑（PE）是另一种无需DNA双链切割即可实现精确、永久基因组修饰的核苷酸编辑技术。PE系统包含三个关键元件：Cas9切口酶与工程化逆转录酶（RT）的融合蛋白、先导编辑向导RNA（pegRNA）和切口向导RNA（ngRNA）。pegRNA引导融合蛋白至靶DNA链，Cas9切口酶产生切口。pegRNA的引物结合位点（PBS）与切口链杂交后，其逆转录酶模板（RTT）序列作为逆转录模板，合成新DNA片，实现精确遗传修饰。随后，ngRNA引导Cas9切口酶在含有编辑片段的链对面产生切口，促进非编辑链的修复，最终产生完全编辑的同源双链DNA。PE旨在解决碱基编辑器和CRISPR/Cas9系统的局限性，可纠正几乎所有类型的不期望变化，包括所有12种类型的点突变（转换和颠换）以及插入/缺失，而无需DSBs或供体DNA模板。然而，挑战包括对PAM序列的依赖。

5. DMD的基因编辑治疗

5.1. 基于CRISPR/Cas9的基因编辑

CRISPR/Cas9基因编辑有潜力永久纠正DMD致病变异。Cas9诱导的DSBs主要通过两种内源途径修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。HDR依赖外源DNA模板实现精确编辑，在DMD中可通过外显子敲入（knock-in）恢复全长抗肌萎缩蛋白，但在有丝分裂后细胞（如骨骼肌细胞）中效率极低。NHEJ是这些细胞中的主要修复途径，虽不精确，但可通过引入小的插入/缺失实现抗肌萎缩蛋白表达恢复，机制包括：外显子跳跃（单切口）、外显子删除（双切口）和外显子重构（单切口）。

5.2. 体内和体外DMD基因编辑

首个体内CRISPR介导的DMD基因编辑概念验证于2014年在mdx小鼠模型（外显子23无义突变）中实现，通过向受精卵显微注射SpCas9、sgRNA和供体模板进行HDR，子代表现出不同比例的镶嵌性抗肌萎缩蛋白表达。该研究表明，即使在仅有约15%的基因编辑时，也能恢复功能性野生型抗肌萎缩蛋白水平，这得益于骨骼肌的合胞体结构，使校正的细胞核产生的蛋白可扩散至整个肌纤维。

5.3. 单切口外显子编辑

5.3.1. 外显子跳跃策略

单切口外显子跳跃策略具有突变依赖性。该方法使用单一sgRNA和CRISPR/Cas9在DMD基因的内含子-外显子交界处或剪接信号序列引入单次DSB。NHEJ修复产生的小插入/缺失破坏剪接供体或受体位点，导致靶向外显子在mRNA加工中被跳过，从而恢复ORF。与双切口编辑相比，该方法更简单、安全，仅需一个sgRNA。针对特定外显子（如45、51、55等）的单切口策略已在多种体外（如患者来源iPSCs分化的肌肉细胞、心肌细胞）和体内模型（如ΔEx50小鼠、狗、ΔEx44小鼠、Δ52-54 DMD小鼠）中证明可高效恢复抗肌萎缩蛋白表达，改善肌肉功能和病理。但疗效因突变类型、sgRNA设计和递送系统而异，需进一步优化。

5.3.2. 外显子重构策略

外显子重构是一种单切口CRISPR/Cas9基因组编辑策略，旨在通过NHEJ修复产生的小插入/缺失，恢复因移码突变破坏的ORF。该方法利用约三分之一的NHEJ介导的插入/缺失可重新对齐阅读框的特性。序列背景（如PAM上游的第四个核苷酸）可部分影响NHEJ结果的预测性。通过优化sgRNA设计（如工程化产生单腺嘌呤插入），可提高重构效率。在DMD中，研究表明单切口CRISPR/Cas9介导的外显子重构可在患者来源iPSC衍生心肌细胞和DMD小鼠模型中恢复抗肌萎缩蛋白ORF，表达内部截短但功能性的抗肌萎缩蛋白，改善肌肉性能，且校正和表达可持久长达18个月。

5.4. 双切口外显子删除

双切口外显子删除是一种旨在将严重DMD突变转化为BMD样表型的策略。它通过使用两个靶向目标区域两侧的sgRNAs来删除选定外显子，理论上可适用于多种突变类型（缺失、重复、某些点突变），具有广泛的适用性。但其成功与否取决于抗肌萎缩蛋白对内部删除的结构耐受性。并非所有外显子组合都能产生功能结果，因此选择适当的基因组区域进行切除至关重要。已研究的热点区域包括N端（如外显子3-9）和外显子45-55区域。例如，Δ3-9删除、Δ45-55删除等策略已在体外和体内模型（包括小鼠、大动物模型）中证明可恢复抗肌萎缩蛋白表达，改善肌肉病理和功能。然而，双切口方法技术要求更高，编辑效率通常低于单切口策略，且使用多个sgRNA增加了脱靶效应和染色体重排的风险。

5.5. 碱基编辑和先导编辑

碱基编辑和先导编辑扩展了DMD的治疗范围，特别适用于携带单核苷酸变异（约占病例的25-35%）的患者。碱基编辑无需DSBs即可直接转换特定核苷酸，在多个实验系统（如iPSC衍生细胞、小鼠模型）中已证明可有效、持久地恢复抗肌萎缩蛋白，包括通过校正无义突变或调控剪接位点。但受限于PAM序列、编辑器尺寸较大以及潜在的脱靶脱氨等问题。先导编辑则更为通用，无需供体模板或DSBs即可引入所有类型的核苷酸替换以及小插入/缺失，在DMD中已成功用于通过精确核苷酸插入恢复阅读框。但编辑效率受切口位点与所需编辑之间空间关系的影响。对逆转录模板的优化可提高效率。两者代表了精准基因组工程中的互补方法，碱基编辑对特定突变类别效率高，而先导编辑范围更广、更通用。

6. 同源定向外显子替换策略

同源定向外显子替换策略通过HDR实现精确的外显子替换，可能恢复全长抗肌萎缩蛋白。这对于影响抗肌萎缩蛋白N端或C端功能域的突变尤为重要，因为这些区域的删除会破坏功能。然而，HDR在有丝分裂后组织中效率极低，限制了其直接体内应用。该策略已在早期胚胎系统、增殖性祖细胞和多能干细胞中成功实施。例如，在mdx小鼠受精卵中通过HDR校正外显子23突变，在患者来源iPSCs中通过CRISPR/Cas9和供体DNA模板重新插入外显子44。但在成熟肌纤维中，HDR效率远低于NHEJ，且在大动物模型（如GRMD狗）中，部分抗肌萎缩蛋白恢复并未转化为有意义的组织病理学改善或肌力增强，突显了其临床转化的挑战。

7. 同源非依赖性靶向整合

为克服HDR对细胞周期的依赖，同源非依赖性靶向整合（HITI）策略被开发出来。HITI利用在分裂和非分裂细胞中都活跃的NHEJ途径。供体DNA工程化带有Cas9识别位点，Cas9同时切割基因组靶位点和供体构建体后，NHEJ机制促进供体序列的定向整合。在DMD背景下，HITI介导的外显子替换（如插入人外显子52）已在小鼠模型中实现骨骼肌和心肌中全长抗肌萎缩蛋白的恢复，表明其作为一种结合了靶向插入精度和NHEJ广泛适用性的外显子敲入平台的潜力。

8. DMD中突变非依赖性治疗策略

除了直接校正抗肌萎缩蛋白基因突变，另一种策略是靶向独立于特定遗传缺陷的修饰通路来减轻疾病病理。研究最广泛的修饰因子是抗肌萎缩蛋白同源物（utrophin, UTRN）。提高肌营养不良肌肉中utrophin水平可以部分补偿抗肌萎缩蛋白的缺失。由于全长utrophin编码序列超过常用病毒载体的包装极限，策略已转向转录激活内源性UTRN基因座。CRISPR激活（CRISPRa）平台（如dCas9-VP160、dCas9-VP64）已在体外和体内模型（包括患者来源iPSC衍生心肌细胞、mdx小鼠）中证明可有效上调utrophin表达，并带来功能益处。此外，通过CRISPR/Cas9删除UTRN3‘非翻译区内的抑制性microRNA靶区（IMTR）也可增加utrophin表达。针对抗肌萎缩蛋白表达的基因激活也已进入临床试验（针对外显子1缺失患者的“n-of-1”试验）。这些突变非依赖性策略为更广泛的DMD患者群体提供了补充性治疗途径。

9. CRISPR工程的DMD动物模型

CRISPR/Cas9极大地促进了DMD动物模型的生成，能够快速、精确地在受精卵中引入特定突变，模拟患者突变。已建立超过60个跨物种模型，包括小鼠、大鼠、兔子、猪、狗和非人灵长类动物。小鼠模型应用最广泛，包括ΔEx50、ΔEx44、ΔEx8-34、人源化（如hDMDdel45、Δ52-54）等模型，用于研究疾病机制和测试疗法。大鼠模型具有更大的体型和持续的疾病进展。兔、猪模型在生理和心脏方面与人类更相似，但猪模型常伴有早期死亡。自然发生的犬类模型（如GRMD狗）在疾病进展方面与人类非常接近。非人灵长类模型（如恒河猴）提供了最接近人类的遗传和生理匹配。这些模型各有优缺点，共同构成了理解疾病生物学和评估新兴治疗策略的互补系统。

10. 基于CRISPR的DMD疗法面临的挑战与未来展望

将基因组编辑技术转化为有效的DMD疗法需克服一系列相互关联的生物和技术挑战。关键目标是在所有受影响的肌肉组织中实现安全、高效、持久的抗肌萎缩蛋白恢复。研究表明，仅需将抗肌萎缩蛋白恢复至正常水平的4-50%即可显著改善疾病严重程度。然而，肌肉的动态退化和再生可能导致校正细胞核随时间被稀释，因此靶向作为再生储备的卫星细胞对持久疗效至关重要。免疫相容性是系统基因组编辑的主要障碍。当前递送策略严重依赖AAV载体，存在预存免疫和剂量依赖性毒性问题。针对Cas蛋白的免疫反应也是关注点。基因组安全性方面，脱靶编辑风险仍需通过高保真核酸酶、优化的sgRNA设计和全基因组脱靶分析来缓解。高效递送是另一个核心瓶颈，AAV的有限包装容量常需使用更小的Cas变体或双载体系统。非病毒递送方法（如脂质纳米颗粒、金纳米颗粒、病毒样颗粒）正受到越来越多的关注。未来，基因组编辑、递送技术和肌肉生物学方面的持续跨学科创新，以及组合策略（如基因编辑与utrophin上调或微抗肌萎缩蛋白递送相结合）的应用，对于实现其作为DMD变革性、持久性疗法的承诺至关重要。

11. 结论

基因组编辑重新定义了DMD的治疗前景，将重点从症状管理转向实现持久的基因校正可能性。基于CRISPR/Cas9的策略通过直接靶向疾病的根本原因，与当前批准的疗法相比具有明显优势。在单基因疾病（如镰状细胞病）中最近的临床成功为这些方法的转化潜力提供了有力验证。在DMD中，临床前研究已证明在多种模型中可显著恢复抗肌萎缩蛋白。然而，要广泛应用，必须解决高效系统递送、编辑的长期持久性以及减轻免疫和脱靶效应等关键挑战。这些领域的持续进步正逐步克服这些障碍。最终，这些创新的成功整合可能使基因组编辑发展成为能够从根本上改变DMD临床进程的变革性、疾病修正疗法。