复制 competent SIVcpz CRISPR 筛选鉴定成功跨物种传播屏障

《Journal of Virology》：Replication-competent SIVcpz CRISPR screen identifies barriers to successful cross-species transmission

　　

摘要：猿猴免疫缺陷病毒（SIVs）已至少四次从猿类跨物种传播至人类，但仅有一次事件引发了艾滋病大流行。大流行HIV-1 M（major）组毒株在人类中高效传播所克服的宿主屏障仍知之甚少。为鉴定此类屏障，研究人员利用复制 competent 的SIVcpz（HIV-1的猿类前体）驱动CRISPR-Cas9筛选，该病毒在系统发育上与HIV-1 M组毒株密切相关。将靶向500多个编码潜在抗病毒因子的人类基因的向导RNA（sgRNA）文库插入SIVcpz MB897分子克隆中。在表达Cas9的人SupT1 T细胞中增殖，显著富集了靶向AXIN1、CEACAM3、CD72、EHMT2、GRN、HMOX1、HMGA1、ICAM2、IFITM2、MEFV、PCED1B、SGOL2、SMARCA4、SUMO1和TMEM173的sgRNA。这些命中基因与类似HIV-1为基础的筛选所鉴定的基因仅部分重叠，表明存在病毒特异性的限制谱。功能分析证实，在原发性人CD4+T细胞中，IFITM2（干扰素诱导的跨膜蛋白2）、PCED1B（PC-酯酶结构域包含蛋白1B）、MEFV（地中海热蛋白，pyrin/TRIM20）和AXIN1（轴抑制蛋白1）限制了所分析的SIVcpz毒株但不限制HIV-1 M组毒株的复制。这些发现揭示了先前未被识别的限制SIVcpz在人细胞中复制的宿主因子，并强调了至少部分HIV-1 M组毒株在适应大流行传播过程中所克服的屏障。

论文解读：复制 competent SIVcpz CRISPR 筛选揭示跨物种传播屏障

研究背景与意义

猿猴免疫缺陷病毒（SIVs）曾多次从黑猩猩和大猩猩跨物种传播给人类，形成了人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）。然而，在这至少四次独立事件中，仅有一次由SIVcpz Ptt（黑猩猩猿类免疫缺陷病毒）演化而来的HIV-1 M组引发了全球艾滋病大流行。理解为何只有M组病毒能在人类群体中高效传播，对于病毒进化和公共卫生至关重要。现有的HIV-1 M组病毒已高度适应人类宿主，并能有效逃避先天免疫防御，因此不适合用于鉴定早期跨物种传播时所面临的抗病毒机制。为此，研究人员采用了一种基于复制 competent 病毒的“叛徒病毒”（Traitor Virus, TV）CRISPR筛选策略，利用与HIV-1 M组亲缘关系最近的SIVcpz MB897毒株作为工具，旨在发现那些被大流行HIV-1毒株在适应过程中克服的宿主限制因子。该研究成果发表在《Journal of Virology》上。

关键技术方法

本研究核心技术为“叛徒病毒”CRISPR-Cas9筛选平台，通过将sgRNA文库克隆至复制 competent 的SIVcpz MB897分子克隆中，在表达Cas9的SupT1-R5 T细胞系及原代CD4⁺T细胞中进行连续传代，依据sgRNA的富集情况鉴定宿主限制因子。同时，研究结合了下一代测序（NGS）与MAGeCK算法进行生物信息学分析，并利用传统基因敲除（KO）、药物干预（如IWR-1处理）以及蛋白质过表达等手段，在SupT1细胞系和来自健康供体的原代CD4⁺T细胞中验证了候选基因的功能。此外，研究还通过系统发育分析确定了病毒株的进化地位，并利用TZM-bl报告细胞系定量病毒感染滴度。

研究结果

SIVcpz Ptt MB897在SupT1-R5 Cas9细胞中高效复制

研究人员首先评估了SIVcpz Ptt MB897在多种人类细胞系中的感染性，发现仅有SupT1-R5细胞对其易感，这与CCR5共受体的高表达水平直接相关。基于此，构建了三种不同的sgRNA表达盒插入突变体（Mut1, Mut2, Mut3），经测试Mut3在病毒传代过程中sgRNA cassette稳定性最佳，因此被选用于后续的全基因组筛选文库构建。

靶向SIVcpz Ptt MB897的sgRNA构建体的生成

研究人员生成了一个包含靶向510个候选抗病毒基因的1537条sgRNA的文库，并将其克隆至MB897mut3载体中。尽管干扰素（IFN）-β处理会诱导抗病毒基因表达，但也导致sgRNA cassette丢失，因此后续筛选实验均在无IFN条件下进行。

靶向限制SIVcpz Ptt复制基因的sgRNA富集

通过对SupT1-R5 Cas9细胞中的病毒文库进行连续传代和NGS分析，研究人员观察到sgRNA的显著富集。火山图和相关性分析显示，IFITM2、PCED1B、AXIN1、CEACAM3和MEFV等基因在早期时间点富集最为显著。功能验证实验证实，针对AXIN1、BST-2、HMOX1、IFITM2、MEFV和PCED1B的sgRNA均能增强SIVcpz MB897在SupT1-R5 Cas9细胞中的复制。

SIVcpz和HIV-1重叠的sgRNA集合增加复制适应性

通过比较SIVcpz与HIV-1驱动的筛选结果，研究人员发现两者存在部分重叠但也存在显著差异。例如，AXIN1、SUMO1、FOXP3等基因在两种病毒筛选中均表现出一致的效应，而CIITA和MLST8则显示出病毒株特异性。这表明SIVcpz和HIV-1在利用宿主因子方面既共享又独特的策略。

内源性MEFV、AXIN1和IFITM2限制SupT1-R5细胞中的SIVcpz

传统的基因敲除实验进一步证实了上述发现。在SupT1-R5细胞中，敲除MEFV、AXIN1和IFITM2可使SIVcpz MB897的感染产量增加约2至4倍，但对HIV-1 NL4-3的复制无显著影响。这表明这些因子对SIVcpz具有基础性的限制作用。

IFITM2高效限制SIVcpz Ptt及部分HIV-1 M组毒株

令人意外的是，IFITM2在筛选中的富集程度高于IFITM3。体外实验显示，IFITM2对SIVcpz Ptt MB897及四种其他SIVcpz IMCs的抑制效率平均达92%，显著高于其对HIV-1 M组毒株的平均85%抑制率。值得注意的是，不同的HIV-1 M组分离株对IFITM的敏感性存在显著差异，NL4-3和CH077相对耐药，而某些传播者/创始者（TF）毒株则高度敏感。

AXIN1表达增加抑制SIVcpz Ptt和HIV-1复制

虽然AXIN1的sgRNA增强了SIVcpz的复制，但在HEK293T细胞中的过表达并未显示抑制作用。然而，在原代CD4⁺T细胞中，使用Wnt通路抑制剂IWR-1稳定AXIN1蛋白后，研究人员观察到SIVcpz Ptt以及HIV-1 NL4-3和CH077的复制均受到显著抑制，表明AXIN1在原代T细胞中具有广谱的抗逆转录病毒活性。

在原代CD4⁺T细胞中限制SIVcpz Ptt但不限制HIV-1的宿主因子

这是本研究的关键环节。通过在原代CD4⁺T淋巴细胞中利用慢病毒递送Cas9并结合携带sgRNA的SIVcpz感染，研究人员证实，内源性表达的IFITM2、AXIN1、MEFV、PCED1B和BST-2（Tetherin）均能有效限制SIVcpz MB897的复制，而这种限制作用在HIV-1 NL4-3和CH077中完全不存在。这直接证明了HIV-1 M组病毒已经进化出逃逸这些宿主防御机制的策略。

讨论与结论

本研究通过复制 competent 的SIVcpz驱动的CRISPR筛选，鉴定了一系列限制SIVcpz但在人类中已适应良好的HIV-1 M组不受其影响的宿主因子。研究发现，IFITM2、AXIN1、MEFV和PCED1B是主要的限制因子。特别是IFITM2，其过表达对SIVcpz的抑制效力强于IFITM3，且SIVcpz比多数HIV-1 M组毒株对此更敏感。AXIN1作为一种Wnt信号通路的负调控因子，被发现能以细胞类型特异性的方式抑制SIVcpz。MEFV和PCED1B则是此前未被充分认识的抗病毒因子。尽管BST-2（Tetherin）在本筛选中未列为主要命中基因，但其在原代细胞中的敲除显著增强了SIVcpz的释放，再次印证了Vpu介导的BST-2拮抗作用是HIV-1大流行适应的关键步骤。该研究不仅揭示了塑造HIV-1出现的宿主决定因素，也为理解慢病毒跨物种传播的屏障提供了新的视角。研究人员指出，“叛徒病毒”策略是一种强大的工具，可用于发现那些在病毒适应宿主过程中被清除的抗病毒机制。