一种混合模糊粗糙集、层次CFA和随机森林方法用于建模和验证投票意向：来自2023年泰国大选的证据 Prasit Puttamapadungsak, Sumaman Pankham, Somchai Lekcharoen

《Information》：A Hybrid Fuzzy Rough Set, Hierarchical CFA, and Random Forest Approach for Modeling and Validating Voting Intentions: Evidence from the 2023 Thai General Election Prasit Puttamapadungsak, Sumaman Pankham and Somchai Lekcharoen

　　摘要：本土绵羊品种代表了宝贵的遗传多样性库，这种多样性是长期适应当地环境和管理系统的结果。希腊本土绵羊品种在基因组和功能研究中的代表性仍然不足。本研究的目的是表征和比较三种希腊本土绵羊品种——莱斯沃斯（LES）、塞雷斯（SER）和色雷斯（THR）的编码序列变异，并识别出共有的和与品种相关的功能模式。该研究采用了两阶段方法：发现阶段（探索性研究）和验证阶段。在发现阶段，分析了全基因组测序数据（每个品种一只动物；总共3只；平均测序深度约为36.9×），以识别改变蛋白质的功能外显子变异，重点关注错义单核苷酸多态性（SNPs）和外显子插入/缺失（indels）。这些变异在品种特异性和比较层面上进行了分析，随后使用基因本体论（GO）和KEGG通路进行了功能富集分析。标准化的变异密度指标识别出多态性水平较高的基因。在验证阶段，使用MassARRAY基因分型技术在54只动物（每个品种18只）的独立队列中对一组优先选择的错义SNPs进行了基因分型。携带优先选择错义SNPs的基因在各个品种中显示出保守的富集特征，主要集中在基因组维护、DNA修复、细胞骨架组织和核心调控功能上。还观察到了与品种相关的独特模式：LES在代谢、生物合成和感觉相关过程中表现出富集；SER在调控和信号传导功能中表现出富集；THR在细胞骨架、细胞外基质和细胞器相关通路中表现出富集。多态性密度分析突出了跨品种高度变异的基因，包括嗅觉受体（OR）基因家族、角蛋白相关蛋白基因（KRTAPs）以及参与免疫和调控功能的位点（例如PRKDC、CDH15）。验证阶段确认了大多数优先选择SNPs的预期等位基因频率模式，支持了该方法的可靠性。本研究揭示了希腊本土绵羊品种中具有功能相关性的编码变异，揭示了与代谢、结构和调控过程相关的保守基因组模式和品种特异性特征。

1. 引言
畜牧业在全球农业中发挥着关键作用，为全世界数百万人提供营养、收入和文化价值[1,2]。在这一背景下，绵羊（Ovis aries）因其适应多种环境的能力以及能够生产肉类、牛奶和羊毛等多种产品而特别值得关注。它们能够在边缘地区茁壮成长，因此在地中海和半干旱地区尤为重要，不仅有助于食品生产，还有助于保护农村遗产和景观管理[3]。畜牧业是希腊最普遍的农业活动之一，其中小型反刍动物，尤其是绵羊和山羊，占据了核心地位。具体来说，希腊拥有欧盟第三大的绵羊群[4]。几个世纪以来，由于地理隔离、游牧、自然选择和人为选择、杂交以及遗传漂变，希腊发展出了20多种本土绵羊品种[5]。这些本土品种主要用于牛奶生产，支持了一个充满活力的乳制品行业，生产了许多原产地保护（PDO）和地理标志保护（PGI）产品，而肉类生产则处于次要地位。这些本地品种在表型上具有独特性，并且很好地适应了地中海地区的多样化环境，代表了经过数百年适应希腊环境而形成的宝贵遗传多样性库[6]。这些品种维持了传统的生计和区域经济，同时表现出诸如耐热性、在广泛放牧系统中的高效性以及对地方性疾病的抵抗力等适应性特征。在气候变化和景观变化的背景下，这些属性变得越来越重要[7]。然而，许多希腊本土品种正面临数量减少和遗传侵蚀的问题，主要是由于生产集约化和无节制的杂交所致。因此，保护这些遗传资源对于维持生物多样性和确保希腊动物生产系统的长期可持续性至关重要[6,7]。
在过去的二十年里，分子工具的应用彻底改变了牲畜多样性和适应性的研究。早期的方法依赖于微卫星和线粒体DNA，为系统发育和种群结构提供了有价值的见解，但范围有限[8,9]。高密度SNP阵列的发展加速了绵羊的基因组研究，使得能够表征品种关系、选择特征和全球种群中的近交水平[9,10]。然而，单一平台的基因分型只能捕捉到部分遗传变异，而全基因组测序（WGS）提供了更全面的视图，包括具有潜在功能意义的罕见变异和结构多态性。WGS已被用于研究驯化历史、识别受选择的基因组区域，并揭示来自不同环境的绵羊的适应性特征[11]，使其成为进化研究和可持续育种计划设计的重要工具。尽管希腊拥有丰富的本土绵羊资源，但这些群体的基因组资源与世界其他品种相比仍然稀缺，导致我们对它们的进化历史和适应潜力的理解存在显著的知识空白。最近的努力已经开始解决这些长期存在的空白，最显著的是通过首个涉及多个品种的WGS数据集[12]。然而，对于许多地区重要的品种来说，仍然存在重大空白，而且跨地理和生态多样性的希腊种群的比较WGS仍然不足[6]。这些限制阻碍了对适应机制的科学探索以及将基因组数据实际应用于品种保护、追踪动物起源和根据当地环境条件制定育种计划。尽管扩大对希腊岛屿和大陆绵羊品种的WGS采样对于捕捉全部遗传多样性至关重要，但同样重要的是对这些品种之间的基因组变异进行比较分析，以揭示共有的和独特的适应机制。鉴于气候变化和持续的遗传侵蚀双重挑战，解决这一缺陷尤为紧迫，这些挑战不仅威胁到希腊绵羊养殖的可持续性，也威胁到地中海小型反刍动物生产系统的整体韧性[6,13]。
在这项研究中，我们调查了三种希腊本土绵羊品种——莱斯沃斯（LES）、色雷斯（THR）和塞雷斯（SER），每种品种代表了不同的生态和管理环境。这三个本土品种代表了希腊不同的地理区域和生产系统。LES品种起源于莱斯沃斯岛，其特征是白色毛皮，鼻子和四肢有深色色素沉着，长而半脂肪的尾巴和下垂的耳朵。相比之下，SER品种主要在希腊北部饲养，体型更为健壮，毛皮主要为白色，头部、四肢和腹部有深色色素沉着。动物的头部相对较窄，鼻部略微凸起，耳朵较大且呈水平方向，公羊通常有发达的角。THR品种也原产于希腊北部，体型较小，耳朵较窄，鼻部轮廓直，尾巴长而细。图1展示了每种品种的代表性个体，图2展示了它们的地理分布。图1. 本研究中包含的三种希腊本土绵羊品种的代表性个体：(a) 莱斯沃斯（LES），(b) 塞雷斯（SER），(c) 色雷斯（THR）。图2. 本研究中研究的三种本土绵羊种群的地理分布。采样区域用彩色星号表示：LES（红色），SER（黄色），THR（蓝色）。就种群规模和生产特性而言，LES品种是分布最广的希腊本土绵羊种群之一，估计有大约26万只动物。这个中等体型的品种主要用于牛奶生产，平均每胎产奶量在140到160公斤之间，以其适应恶劣环境的能力和高效利用低质量牧场的能力而闻名。生产的牛奶大部分传统上用于奶酪生产，突显了该品种在当地农牧系统中的经济重要性。成年雄性的体重通常约为65-70公斤，雌性为45-55公斤[14]。
THR品种是一种稀有的遗传资源，纯种个体不到1000只，主要由罗多皮山脉北部地区的Pomak社区在广泛的生产系统中饲养。这个小型品种高度适应恶劣的环境条件，能够高效利用边缘放牧资源。成年雄性的体重通常在45到55公斤之间，雌性为35-45公斤，肩高分别为62-65厘米和55-60厘米。该品种生产的羊毛粗糙但质量良好，主要用于牛奶和肉类生产，采用低投入系统。每胎产奶量在60到100公斤之间，而肉类产量相对较低[15]。最后，SER品种是一个相对较小但重要的种群，约有6000只动物。这是一个大型品种，适合半集约化和广泛的生产系统，既适用于牛奶生产也适用于肉类生产。成年雄性的体重通常约为80-90公斤，雌性为55-65公斤。在生产性能方面，羔羊断奶时体重约为14-17公斤（45-60天），平均每胎产奶量约为130-140公斤，生产周期约为200-220天。该品种很好地适应了山区和半山区环境，能够高效利用可用的放牧资源[14]。
基于全基因组测序（WGS）数据集，我们的目标是研究上述希腊品种（LES、SER、THR）的全基因组变异，特别关注可能改变蛋白质功能并贡献于品种特异性适应特征的错义变异。为了探索这些变异的生物学相关性，我们通过基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）框架进行了功能注释和富集分析。此外，使用MassARRAY基因分型技术在独立动物队列中验证了一组优先选择的错义SNPs，以评估它们在各个品种中的等位基因频率分布。通过将基因组发现与种群水平验证相结合，本研究为希腊本土绵羊的适应性基因组景观提供了新的见解，并加强了其保护和可持续管理的基础。

2. 材料与方法
2.1. 研究设计概述
本研究采用了两阶段方法来研究三种希腊本土绵羊品种（LES、SER、THR）的基因组变异，包括发现阶段和验证阶段。在发现阶段，使用了之前发表的数据集[12]中获得的代表性动物（每个品种一只动物；总共3只）的全基因组测序（WGS）数据，以识别和过滤SNPs和插入/缺失（indels），并在三个种群之间进行比较基因组分析。在验证阶段，使用了由我们团队收集和处理的独立动物队列（n = 54；每个品种18只），以评估所选变异的种群水平分布。具体来说，使用基于MassARRAY的方法对发现阶段识别的一组错义SNPs进行了基因分型。发现阶段和验证阶段所包括的动物是独立的，没有重叠。这种双层策略使得能够在全基因组水平上识别候选变异，并在更大的、具有代表性的种群中对其进行后续评估。图3提供了研究工作流程的示意图。图3. 研究设计和分析工作流程的示意图。分析分为两个阶段：(i) 发现阶段，使用三个代表性动物（每个品种一只：LES、SER、THR）的全基因组测序数据进行变异识别和过滤；(ii) 验证阶段，使用基于MassARRAY的方法对54只动物（每个品种18只）的独立队列中的选定错义SNPs进行基因分型，以评估其在种群水平上的分布。
2.2. 发现数据集：生物材料与全基因组测序
本研究使用了Tsoureki等人（2025年）[12]最初生成的全基因组测序（WGS）数据。具体来说，Tsoureki等人（2025年）[12]从代表三种希腊本土绵羊品种的三种不同动物中收集了血液样本：“莱斯沃斯”（LES）、“塞雷斯”（SER）和“色雷斯”（THR）。选择这些动物是基于它们的形态特征和地理起源，以确保纯种代表性。采样通过颈静脉穿刺进行，收集的血液转移到含有EDTA的试管中，并储存在-20°C。按照制造商的说明，使用NucleoSpin Blood QuickPure试剂盒（MACHEREY-NAGEL，杜伦，德国）提取了基因组DNA。DNA浓度使用Qubit 4荧光计和Qubit dsDNA BR检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）进行测量，DNA完整性通过琼脂糖凝胶电泳进行评估[12]。文库制备和全基因组测序（WGS）也由Tsoureki等人（2025）[12]完成。简而言之，全基因组文库是使用Illumina Nextera DNA Flex试剂盒（Illumina Inc.，San Diego，CA，美国）按照制造商的说明构建的。文库使用AMPure XP Beads（Beckman Coulter，Brea，CA，美国）进行纯化，其浓度使用Qubit 4荧光计和Qubit dsDNA BR检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）进行测量。文库的大小和质量使用5200 Fragment Analyzer系统（Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA，美国）进行评估，而文库的定量则使用Rotor-Gene Q实时PCR系统（Qiagen，Hilden，德国）和KAPA Library Quantification试剂盒（KAPA BIOSYSTEMS，Wilmington，MA，美国）完成。测序是在NovaSeq 6000平台上进行的（Illumina Inc.，San Diego，CA，美国）[12]。

2.3 生物信息学分析
对于本研究，从Tsoureki等人（2025）[12]的公开数据集中获取了三个希腊绵羊品种（LES、THR、SER）的原始测序数据。数据来自NCBI Sequence Read Archive（SRA），BioProject访问号为PRJNA1246525，用于比较全基因组分析。所有下游生物信息学分析，包括变异调用、过滤、注释和变异优先级排序，均由我们的团队在本研究的背景下独立完成。原始FASTQ文件使用FastQC [16]进行质量评估。适配器序列和低质量碱基（PHRED < 30）使用Trimmomatic（v0.39）[17]进行修剪。得到的高质量读段使用Burrows–Wheeler Aligner（BWA）（版本0.7.17）[19]与Ovis aries参考基因组（Oar_rambouillet_v1.0）对齐，该参考基因组来自Ensembl数据库[18]。PCR重复序列使用Picard工具（http://broadinstitute.github.io/picard/，访问日期2026年3月9日）识别并移除，然后进行进一步分析。对齐后的SAM格式文件使用SAMtools（v1.19.2）[20]转换为排序后的BAM文件。变异调用包括单核苷酸多态性（SNPs）和插入/缺失（indels），同样使用SAMtools（v1.19.2）[20]完成。原始变异集根据以下标准进行过滤：（1）变异位置的读段深度（DP）> 4；（2）映射质量（MQ）> 20。每个样本（LES、THR、SER）都生成了VCF（Variant Call Format）文件。使用ANNOVAR（v20191024）[21]对高置信度变异进行功能注释，该工具提供了关于它们的基因组上下文（例如，外显子、内含子、基因间）的信息，以及对蛋白质编码区域的预测影响等。

2.4 变异研究及比较分析
在这项研究中，我们旨在调查三个希腊绵羊品种中的遗传变异，以初步了解共有和独特的变异，并探索可能有助于品种相关适应性特征的变异。为此，我们采用了一种优先考虑错义变异和插入/缺失（indels）的方法，因为它们有可能改变蛋白质功能并促进表型多样性。随后，我们进行了基因本体论（GO）和KEGG通路分析，以评估这些变异的潜在生物学影响。此外，我们还识别了SNP或indel密度高的基因组区域，因为这些区域可能表明选择压力、突变率增加或参与品种特异性适应的功能重要位点。最后，我们进行了比较分析，以检查三个品种之间的遗传相似性和差异。
具体来说，为了便于后续分析，为每个品种生成了两个注释过的变异数据集：一个包含外显子单核苷酸多态性（SNPs），另一个包含外显子插入和缺失（indels）。每个数据集包括关键变异信息，如变异ID（rsID）、染色体（CHR）、基因组位置（POS）、参考等位基因（REF）和替代等位基因（ALT），以及相应的基因注释。初步质量控制包括移除重复条目和缺少或无效基因注释的变异。对于SNPs，仅优先考虑错义变异，因为它们更有可能直接影响蛋白质结构或功能。相比之下，所有外显子indels都被保留下来进行进一步分析，因为它们有可能破坏编码序列。
对于每个品种，分别检索并分析了携带错义SNPs和外显子indels的基因，总共得到六个基因列表（每个品种两个）。这些列表提交给g:Profiler [22]进行探索性功能富集分析，以Ovis aries作为背景生物。使用g:SCS（Set Counts and Sizes）方法进行多重检验校正，显著性阈值设为p < 0.05。分析在“所有已知基因”统计领域下进行。功能类别包括基因本体论（GO）术语（生物过程、分子功能和细胞组分）[23,24]以及KEGG通路[25]，提供了所识别基因的潜在生物学作用的概览。
随后，分别计算SNPs和indels的变异数量，生成每个品种的“每个基因的SNP数量”和“每个基因的indel数量”。基因坐标从Ensembl BioMart [26]获取，并用于计算基因长度（以千碱基计）。然后计算标准化变异密度，即每千碱基的SNPs数量（SNPs/kb）和indels数量（indels/kb）。这些标准化指标有助于识别具有较高多态性密度的基因。
进行了成对比较（LES-THR、LES-SER、THR-SER），以及所有品种之间的三重比较，以识别共有和品种特异性的基因和SNPs。三重分析能够检测出所有品种共有的基因和变异，以及每个品种特有的基因和变异。识别出共有（可能反映保守或必需功能）和品种特异性变异（可能涉及局部适应或独特表型特征）的变异，为了解希腊绵羊群体间的遗传基础提供了宝贵的见解。总共得到了十三个不同的基因列表，每个品种两个列表，代表了来自成对和三重比较的共有和独特元素。最后，每个基因列表提交给g:Profiler [22]进行功能富集分析，使用与之前描述的品种特异性分析相同的参数。这一步旨在揭示跨品种独特或共有的生物过程和通路，进一步初步了解潜在的共有功能或品种特异性适应。
所有分析都是在Python 3.12环境中使用自定义Python脚本完成的，主要使用了Pandas库（v2.2.2）。

2.5 候选错义变异的验证选择
为了评估在全基因组测序（WGS）比较分析中识别出的假定品种特异性编码变异是否在群体水平上分离，从错义SNPs池中选择了一部分进行实验验证。候选变异是从在比较分析中被分类为某一品种特有的错义SNPs中选出的。优先考虑那些在WGS数据集中通过质量过滤标准的高置信度变异，并且位于注释良好的蛋白质编码基因内的变异。当同一基因或基因组区域内存在多个变异时，选择具有代表性的SNPs以减少冗余并确保更广泛的基因组覆盖。在优先排序过程中还考虑了生物学相关性，特别是对于参与代谢过程、免疫功能、感官感知、皮肤和羊毛生物学或其他在功能富集分析中突出的通路的基因。此外，还筛选了适合MassARRAY检测设计的变异，包括没有可能干扰引物结合和基因分型准确性的附近多态性。根据这些标准，选择了46个错义SNPs进行后续分析和基因分型。

2.6 验证队列：动物和DNA样本
为了评估WGS分析中识别的候选错义变异在群体水平上的分布，组建了一个由54只动物组成的独立验证队列。该队列包括来自三个希腊本土绵羊品种（LES、THR、SER）的各18只个体。选择动物时尽可能确保它们之间没有亲缘关系，以减少由于近亲关系导致的潜在偏差。动物处理和实验程序符合欧洲关于动物福利的规定。由于所有程序都是非侵入性的，因此不需要特殊许可证。
对于分析，血液样本收集在EDTA管中，冰上运输，并在-20°C下储存直至DNA提取。基因组DNA使用PureLink Genomic DNA Mini Kit（Invitrogen，Waltham，MA，美国—目录编号：K182002）按照制造商的说明进行分离。DNA浓度使用Qubit 4荧光计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）和Qubit dsDNA BR检测试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）进行测量，而完整性通过琼脂糖凝胶电泳进行评估。只有符合质量要求的样本被纳入下游基因分型分析。

2.7 MassARRAY检测设计和基因分型
46个选定的错义SNPs的分型使用Agena Bioscience MassARRAY?系统（Agena Bioscience，San Diego，CA，美国）完成，该系统基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱技术。MassARRAY检测由Inqaba Biotec?（Inqaba Biotechnical Industries，Pretoria，南非）根据标准iPLEX基因分型协议设计和执行。简而言之，使用每个选定SNP两侧的基因组区域设计引物以实现多重PCR扩增。在检测开发过程中，评估了序列上下文，以最小化附近多态性的潜在干扰，并确保最佳的扩增和延伸效率。基因分型包括目标区域的多重PCR扩增、使用虾碱性磷酸酶（SAP）的酶促清洁，以及使用质量修饰的终止核苷酸的单碱基延伸反应（iPLEX）。延伸产物分配到SpectroCHIP阵列上，并通过MALDI-TOF质谱进行等位基因区分[27]。
原始光谱数据使用MassARRAY Typer软件4.1（Agena Bioscience）处理，基于自动聚类算法分配基因型。随后对基因型调用进行质量和一致性评估，以便进行下游统计分析。

2.8 基因分型质量控制与统计分析
在下游分析之前，对基因型调用进行了质量控制。评估了SNP水平和样本水平的调用率，以确保数据的可靠性。调用率低于90%的变异或样本被排除在进一步分析之外。使用MassARRAY Typer输出直观检查基因型聚类的质量，以确认清晰的等位基因区分。
分别计算每个品种（LES、SER、THR）的等位基因和基因型频率。为了评估品种间的等位基因分布差异，在适当的情况下使用卡方检验或Fisher精确检验进行全局比较。还进行了成对品种比较，以进一步评估特定品种对之间的差异。为了考虑46个SNP的多重假设检验，使用Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）校正方法调整p值。统计显著性定义为校正后的q值< 0.05。
所有统计分析都在R版本4.3.2中使用标准包进行，包括用于列联检验和数据处理的包。

3 结果
3.1 发现数据集
3.1.1 每个品种的变异发现与优先级排序
对研究中包含的每个品种（Lesvos（LES）、Thrace（THR）和Serres（SER）独立进行了全基因组变异发现，共在LES中发现了81,857个SNPs，在SER中发现了78,783个SNPs，在THR中发现了79,312个SNPs。此外，还发现了1996个（LES）、1925个（SER）和2003个（THR）indels。
为了概述SNPs的功能分布，根据预测效应进一步对变异进行了分类。在三个品种中，大多数SNPs属于同义和非同义变异，少数为终止增益、终止丢失和未知效应的变异（表1）。为了关注具有潜在功能相关性的变异，采用了逐步过滤方法。首先，过滤掉保留非同义变异，因为它们更可能影响蛋白质功能。随后，进一步将变异限制在蛋白质编码基因内。在三个品种中，共检测到19,120个错义SNPs，在SER中检测到18,513个，在THR中检测到18,459个。使用相同的变异调用和过滤工作流程，还在LES中检测到1015个外显子indels，在SER中检测到983个，在THR中检测到1016个。表1显示了在三个研究品种（LES、SER、THR）中初始变异数据集中识别的SNPs的功能分类。SNPs根据其在蛋白质水平上的预测效应进行分类，包括同义、非同义（错义）、终止增益、终止丢失和未知注释的变异。为了检查编码变异在整个基因组中的分布，将错义SNPs和外显子indels映射到每个品种对应的蛋白质编码基因上。计算了每个品种所有基因的标准化变异密度指标，表示为每千碱基的SNPs数量（SNPs/kb）和indels数量（indels/kb）。这种方法考虑了基因长度的差异，并能够识别出编码序列多态性水平异常高的基因。根据这些指标，在LES中SNP密度最高的基因是OR10C1、OR1J4、TRAV39、OR9A1P和KRTAP4-2（图4a）；在SER中是KRTAP4-2、OR13A1、OR4E1、TRAV39和SCYGR4（图4c）；在THR中是OR2A12、OR1J4、UCN3、KRTAP36-1和OR8I2（图4e）。同样，在LES中显示最高插入/缺失（indel）密度的基因是SPRR2A、SPRR4、KIAA0040、SCYGR6和OR10C1（图4b）；在SER中是KRTAP4-3、CYP4F21、SPRR4、KIAA0040和SCYGR6（图4d）；在THR中是CYP4F21、SCYGR6、OR10Q1、OR8I2和OR6C68（图4f）。图4显示了三种希腊绵羊品种中变异密度最高的基因。为了考虑基因长度的差异，所有基因的变异密度都进行了标准化处理，表示为每千碱基的单核苷酸多态性（SNPs/kb）和每千碱基的插入/缺失（indels/kb）。图表分别展示了LES中SNP密度最高的基因（a）、插入/缺失密度最高的基因（b）、SER中SNP密度最高的基因（c）、SER中插入/缺失密度最高的基因（d）、THR中SNP密度最高的基因（e）以及THR中插入/缺失密度最高的基因（f）。每个类别只显示了前20个基因。为了便于解释所识别的基因，根据标准化SNP和插入/缺失密度排名的基因在补充表S1a–f中进行了总结，包括它们的相应Ensembl Gene ID和基因描述。

3.1.2. 每个品种的功能富集分析
为了研究具有编码序列变异的基因的潜在生物学意义，对每个品种独立进行了功能富集分析，使用了来自优先选择的错义SNP和外显子插入/缺失的基因集。评估了基因本体（GO）类别，包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC），以及KEGG通路，以识别与每个品种中含变异基因相关的功能类别。对携带优先选择的错义SNP的基因的分析揭示了一组在所有三个品种中都共有的核心生物过程，主要与基因组维护和DNA修复、纤毛组装和组织、以及细胞骨架和细胞投射相关过程有关。在分子功能层面，常见的富集模式包括离子通道和钙信号传导活性、小GTP酶和核苷三磷酸酶活性的调节，以及与核酸相关的和依赖ATP的催化活性，表明这些功能与细胞结构、信号传导和基因组完整性有关。KEGG通路分析进一步支持了这一共同特征，显示出在基因组维护和蛋白质生物合成通路、细胞骨架和肌肉相关通路以及ECM-受体相互作用通路中的重复富集（表2）。

尽管存在这种共同的功能核心，但每个品种仍有特定的富集特征。在LES中，与错义SNP相关的基因还显示出辅因子和代谢过程的额外富集，包括与维生素消化和吸收相关的通路，以及专门的生物过程，如光感受器细胞的维护。在分子功能层面，LES特有的富集包括染色质相关结合和表观遗传调节、糖基转移酶和碳水化合物修饰活性、ABC转运蛋白活性，以及与囊泡运输和小GTP酶信号传导相关的功能。KEGG分析进一步突出了ABC转运蛋白通路和与营养相关的代谢通路（表2）。

在SER中，携带错义SNP的基因的品种特异性富集主要与结构和细胞周期相关过程有关，包括基因组维护与细胞周期调节、基于微管的细胞骨架组织和细胞投射组装。SER中的分子功能富集强调了离子通道和钙信号传导活性、小GTP酶的调节、与核酸相关的催化活性、脂质运输和脂质代谢功能，以及碳-氧裂解酶活性。SER中的KEGG通路富集主要由DNA修复相关通路、细胞骨架和马达蛋白通路以及ECM-受体相互作用通路主导（表2）。

在THR中，与错义SNP相关的基因在基因组维护和DNA修复、纤毛组装和组织、基于微管的细胞骨架过程、细胞投射组装和细胞外结构组织相关的生物过程中富集。在分子功能层面，THR特有的富集包括与核酸相关的和依赖ATP的催化活性、小GTP酶信号传导的调节、离子通道活性，以及脂质代谢和酯水解功能。KEGG通路分析还发现了代谢和细胞器相关通路的富集（表2）。

对携带优先选择的外显子插入/缺失的基因进行功能富集分析显示，不同品种之间的模式更为一致，主要富集在发育和形态发生过程、细胞器组织和细胞对压力或外部刺激的反应上。在LES中，与插入/缺失相关的基因还与代谢过程的调节有关，而SER和THR则一致富集在RNA代谢和基因表达的调节上。在分子功能层面，所有品种中的与插入/缺失相关的基因主要富集在一般催化活性上，包括水解酶和转移酶功能，以及酶结合和调节活性、核苷酸磷酸结合和离子结合，其中guanyl核苷酸交换因子活性在THR中特别富集（表3）。

3.2. 比较分析
为了直接评估三种希腊绵羊品种之间的遗传相似性和差异，在变异和基因水平上进行了比较分析。通过成对比较（Lesvos–Thrace、Lesvos–Serres和Thrace–Serres），以及包括所有群体的三重比较，来识别共享的和品种特异性的错义SNP和与变异相关的基因。三重比较有助于确定所有品种共有的核心变异集以及编码序列变异的群体特异性成分。随后基于基因本体（GO）术语和KEGG通路进行了功能富集分析。

3.2.1. SNP水平的比较分析
对SNP数据集进行了成对和三重比较，以评估LES、SER和THR之间的共享和品种特异性核苷酸变异。成对比较显示了品种之间的显著重叠：LES和SER之间共有11,046个SNP，LES和THR之间共有11,098个SNP，SER和THR之间共有10,827个SNP。每次比较还识别出大量仅属于个别品种的SNP，LES-SER比较中有8074个SNP仅属于LES，7467个属于SER；LES-THR比较中有8022个SNP仅属于LES，7361个属于THR；SER-THR比较中有7686个SNP仅属于SER，7632个属于THR。三重比较确定了8269个所有品种共有的SNP，代表了编码变异的共享核心。品种特有的SNP集包括LES中的5245个SNP，SER中的4909个SNP，THR中的4803个SNP，表明尽管有共同的遗传基础，每个品种仍保留了一组显著的独特变异。结果用文氏图表示（图5）。

3.2.2. 基因水平的比较分析
通过将错义SNP映射到相应的蛋白质编码基因，并检查群体之间的共享和品种特异性基因集的模式，进行了基因水平的比较分析。成对比较显示了品种之间在变异相关基因上的显著重叠。在LES-SER比较中，共有6184个基因，而1559个基因仅属于LES，1385个基因仅属于SER。同样，在LES-THR比较中，共有6132个基因，1611个基因仅属于LES，1374个基因仅属于THR。在SER-THR比较中，6057个基因为两个品种共有，1509个基因仅属于SER，1446个基因仅属于THR。为了进一步表征所有群体之间的基因水平重叠，进行了三重比较。合并后的非冗余基因目录包含9820个基因，其中5378个基因为三个品种共有。品种特有的基因集包括LES中的805个基因，SER中的703个基因，THR中的692个基因，表明尽管在基因水平上有显著的重叠，每个品种仍保留了一组独特的基因。结果用文氏图表示（图6）。

3.2.3. 共享和品种特异性基因集的功能富集分析
对携带错义SNP的基因集进行了功能富集分析，以阐明品种间的功能相似性和差异。使用基因本体（GO）和KEGG通路分析进行了富集评估，重点关注在品种间共享的基因以及仅属于特定品种的基因。在所有成对比较（LES-SER、LES-THR和SER-THR）中，品种间共享的基因表现出高度一致的功能富集特征（补充表S2）。共享的基因集在与纤毛组装和组织、基于微管的细胞骨架过程、细胞投射组装以及DNA损伤响应和修复相关的生物过程中富集。在LES-SER和LES-THR比较中还观察到了细胞外结构组织的富集，而在SER和THR之间共享的基因中特别富集了细胞周期检查点相关过程。在分子功能层面，所有成对比较中，共享的基因集在一系列核心术语中富集，包括小GTP酶和核苷三磷酸酶活性的调节以及与核酸相关的催化活性，通常伴随着离子通道或阳离子运输功能和脂质运输相关功能，具体取决于品种对（补充表S3）。KEGG通路分析在所有品种比较中显示出高度一致的功能富集模式。在LES-SER、LES-THR和SER-THR比较中，品种间共享的基因主要富集在与基因组维护和DNA修复、细胞骨架和肌肉相关过程、膜运输和细胞-基质相互作用相关的通路中。在LES-THR比较中，富集还强调了与细胞骨架组织和马达蛋白功能相关的通路。在SER-THR比较中，富集主要体现在细胞骨架/肌肉相关通路和ECM-受体相互作用上。

相比之下，品种特有的基因集表现出更多异质性的富集模式。LES特有的基因主要与代谢和生物合成过程、脂质代谢、发育和形态发生过程（包括神经系统发育）以及细胞应激反应相关。SER特有的基因在RNA代谢和基因表达的调节中富集。在分子功能层面，所有品种中的与插入/缺失相关的基因主要富集在一般催化活性上，包括水解酶和转移酶功能，以及酶结合和调节活性、核苷酸磷酸结合和离子结合，其中guanyl核苷酸交换因子活性在THR中特别富集（表3）。

3.2.3. 共享和品种特异性基因集的功能富集分析
对携带优先选择的外显子插入/缺失的基因集进行了功能富集分析，以阐明品种间的功能相似性和差异。在所有成对比较（LES-SER、LES-THR和SER-THR）中，共享的基因在生物过程、细胞器组织和细胞对压力或外部刺激的反应方面表现出高度一致的功能富集特征。在LES中，与插入/缺失相关的基因还与代谢过程的调节有关，而SER和THR则一致富集在RNA代谢和基因表达的调节上。在分子功能层面，所有品种中的与插入/缺失相关的基因主要富集在一般催化活性上，包括水解酶和转移酶功能，以及酶结合和调节活性、核苷酸磷酸结合和离子结合，其中guanyl核苷酸交换因子活性在THR中特别富集（表3）。表2和表3分别总结了每个品种中优先选择的SNP和插入/缺失的最多显著富集的GO术语和KEGG通路。

3.3.2 使用独立验证队列对等位基因频率差异和品种间变异差异进行了更详细和统计上支持的评估。表4总结了三种共享和独有基因集的富集结果。表4显示了在LES-SER-THR比较中携带错义SNP的基因的Top GO（BP，MF）和KEGG通路富集结果。3.3. 使用MassARRAY基因分型验证候选错义SNP为了研究在全基因组测序（WGS）分析中鉴定出的疑似品种特异性错义变异是否在群体水平上分离，采用了靶向基因分型方法。选择了46个错义SNP进行验证，并使用MassARRAY平台在由三个希腊本土绵羊品种（LES、SER、THR）各18只动物组成的独立队列中进行了基因分型。具体来说，该组包括在发现阶段被鉴定为品种特异性的30个SNP（每个品种10个）以及在WGS分析中在多个品种中检测到的16个SNP（补充表S5）。这一步骤旨在评估候选变异在各个品种中的分布情况，并确定在WGS中观察到的模式是否可以在群体水平上复制。3.3.1. 基因分型质量和呼叫率使用MassARRAY平台成功地对54只动物的验证队列中的46个候选错义SNP进行了基因分型。整个数据集的分型质量很高，样本呼叫率在90%到100%之间。大多数样本的完整性超过了95%（补充表S6）。SNP级别的覆盖率也很高，因为大多数位点的基因分型成功率达到了100%，所有SNP的呼叫率都超过了预定义的90%阈值（补充表S6）。经过质量控制过滤后，最终的数据集包含了54只动物中的46个SNP，这些SNP被保留下来用于后续的等位基因频率估计和统计分析。3.3.2. 等位基因频率分布和品种差异使用MassARRAY基因分型数据集计算了每个品种（LES、SER和THR）的验证SNP组的等位基因频率。使用Fisher精确检验对品种间的等位基因分布进行了统计比较，随后进行了Benjamini–Hochberg假发现率（FDR）校正。在46个经过验证的SNP中，有17个在FDR校正后显示出品种间的等位基因频率存在统计学上的显著差异（q < 0.05）。这些SNP大多对应于在WGS发现阶段最初被分类为品种特异性的变异。例如，几个与LES相关的变异，如rs422734187（OR10C1）和rs401664668（OR9A1P），在LES中的等位基因频率明显高于SER和THR。同样，与SER相关的SNP，包括rs401183126（OR13A1）和rs409873445（TRAV39），在SER群体中的频率较高，而与THR相关的变异，如rs410875969（OR2A12）和rs594676125（OR1J4），在THR动物中最常见。除了统计学上显著的位点外，还有8个SNP遵循预期的品种特异性等位基因频率模式，但在多重检验校正后没有达到统计学显著性。这些位点在预测的品种中具有最高的等位基因频率，但在群体间的差异较为温和。例如，rs413768160（KRTAP19-5）在LES中，rs421102706（CHD9NB）在SER中。一小部分五个SNP的等位基因频率分布与WGS发现分析预测的模式不一致，表明这些位点没有复制发现数据集中观察到的品种特异性模式（rs399201339、11:41098506、2:229842947、rs1087597447）。最后，最初被分类为常见变异的16个SNP在三个品种间的等位基因频率相当，且在FDR校正后没有显示出显著差异。表5提供了所有经过验证的SNP的详细等位基因频率、统计结果和分类。表5显示了验证队列中三个绵羊品种的46个经过验证SNP的等位基因频率和统计结果。该表包括基因注释、基于WGS的分类（品种特异性或常见）、Lesvos（LES）、Serres（SER）和Thrace（THR）中的等位基因频率（AF），以及从Fisher精确检验获得的FDR调整后的q值。“模式”列指示等位基因分布是否显著支持WGS分类（显著）、遵循预期趋势但没有统计学显著性（一致，NS）、在品种间显示相似频率（共享）或偏离预期模式（不一致）。4. 讨论本土绵羊品种代表了重要的遗传多样性库，这种多样性是由长期适应当地环境、管理实践和生产系统塑造的[6]。全面了解支撑这种多样性的基因组结构对于保护遗传资源、改进育种策略以及在环境和气候挑战面前保持韧性至关重要[28]。全基因组测序的进步使得能够详细描述家畜群体内的遗传变异，从而通过识别保守的和群体特异性的遗传特征为动物基因组学提供了新的机会。在本研究中，我们调查了三个希腊本土绵羊品种（Lesvos、Thrace和Serres）的编码序列变异，以探索当地绵羊群体内的共享和品种相关的功能模式。为了关注具有潜在功能后果的变异，我们优先考虑了改变蛋白质的外显子变异，包括错义SNP和外显子插入/缺失，并通过GO和KEGG通路富集分析在品种水平和比较（成对和三向）框架内检查了它们相关的基因。总体而言，我们的分析揭示了品种间编码变异的显著共享成分，以及独特的品种特异性变异池。按基因长度标准化变异计数进一步识别出每个品种内多态性密度增加的基因，这些基因可能有助于群体间的遗传分化。比较功能富集一致表明，跨品种存在保守的功能基础，主要涉及与基因组维护、纤毛和细胞骨架组织以及核心催化功能相关的通路。同时，品种相关的功能特征也很明显，反映了代谢、结构和调控过程的分化。关于品种特异性差异，在所研究的三个品种中，Lesvos（LES）表现出独特的功能特征，这支持了先前的研究，表明希腊大陆绵羊和岛屿绵羊之间存在遗传分化[29]。这一观察结果与LES品种已知的生产方向一致，该品种主要以奶业为主，并且据报道具有强大的代谢效率和适应低质量饲料条件的能力[14]。与SER和THR不同，LES品种主要局限于希腊-土耳其边境的岛屿环境中，地理隔离和独特的生态条件可能有助于积累品种相关的遗传变异。本研究的结果表明，LES在代谢、生物合成和感觉相关过程以及调控和运输相关分子功能方面表现出富集。这些模式在携带优先错义SNP和插入/缺失的基因的功能富集分析中以及在识别出标准化多态性密度增加的基因中都很明显，同时在比较分析中也得到了体现，表明特定生物系统内的协调变异。具体来说，在生物过程层面，LES在辅因子和代谢过程方面表现出富集，包括与维生素消化和吸收相关的通路，以及光感受器细胞维护等专门过程。这些信号在分子功能和KEGG通路层面得到了进一步的支持，表现为ABC转运蛋白活性、糖基转移酶和碳水化合物修饰功能以及染色质相关结合和表观遗传调控的富集，表明这些过程可能与营养处理、细胞运输和调控控制机制有关。这些过程在奶业品种（如LES）中尤为重要[14]，因为在这些品种中，营养吸收、运输和代谢调节在牛奶合成和整体生产效率中起着关键作用。这些发现共同表明LES品种在功能上强调代谢灵活性和细胞调控，这与它的奶业生产特征一致，尽管这些关联应谨慎解释。在LES中每千碱基显示最高SNP密度的基因强烈富集了嗅觉受体（OR）基因（例如，OR10C1、OR1J4、OR9A1P、OR56A3、OR8I2），以及参与免疫和信号传导功能的基因（例如，TRAV39）和与羊毛和皮肤结构相关的基因（例如，KRTAP4-2、KRTAP36-1、KRTAP19-5）。已知嗅觉受体基因家族由于纯化选择放松和基因家族扩展而能容忍高水平的序列变异，并且已被反复牵涉到哺乳动物的环境感知、觅食行为和饮食适应中[30,31]。OR基因在LES中高度多态性位点中的突出地位表明感觉感知通路中的变异增加，这可能反映了适应异质性放牧环境和多样化的植物资源。LES中插入/缺失密度的分析进一步突出了与表皮分化、屏障形成和结构完整性相关的基因。在SPRR2A和SPRR4等基因中观察到了最高的插入/缺失频率，这些基因编码参与角质形成细胞分化和皮肤屏障组装的小型富含脯氨酸的蛋白质[32]。同样，SCYGR6是另一种与毛发或羊毛结构相关的基因，属于Keratin-Associated Protein（KRTAP）28型家族。此外，在基因组研究中鉴定出的KIAA0040与肉质特征（如剪切力）相关，它与嫩度呈正相关，与大理石花纹/颜色评分呈负相关，表明其在肌肉和脂肪发育中的作用[33]。值得注意的是，OR10C1也出现在具有较高插入/缺失密度的基因中，进一步强化了感觉受体位点内广泛变异的信号。这些模式表明LES中的遗传分化可能主要反映了保守的代谢、感觉和结构系统的调节，可能支持对局部放牧条件和环境异质性的适应。SER是本研究中研究的另一个品种，代表了一个在地理限制较少的条件下饲养的大陆群体，暴露于多样的环境、营养和管理制度中。本研究的结果表明，SER在结构、调控和信号传导相关过程中表现出富集，这种模式在携带优先错义SNP和插入/缺失的基因的功能富集分析以及标准化多态性密度分析和比较分析中一致观察到。这样的功能模式可能与双用途品种（如SER）中观察到的组织发育、生长性能和生理调节的更高需求一致[14]。在生物过程层面，SER在基因组维护和细胞周期调节、纤毛组装和组织、微管基细胞骨架过程以及细胞投射组装方面表现出富集，强调了细胞结构和调控控制机制的重要性。这些发现进一步在分子功能层面得到了支持，表现为离子通道和钙信号传导活性、小GTP酶和核苷三磷酸酶活性、核酸相关和ATP依赖的催化功能以及脂质运输和脂质代谢活性的富集。这些功能直接与能量平衡和代谢效率相关，对于支持生长和泌乳性能至关重要。KEGG通路分析证实了这一功能特征，揭示了DNA损伤修复通路、细胞骨架和运动蛋白通路以及ECM-受体相互作用的富集，表明在细胞信号传导、结构组织和细胞-基质通信相关的通路中存在协调变异。对SER中标准化SNP密度的分析识别出一组表现出增加多态性的基因，主要涉及毛发和皮肤结构、感觉感知和免疫相关信号传导的基因。值得注意的是，与羊毛和毛发纤维相关的KRTAP4-2表现出最高的SNP密度，其次是几个嗅觉受体基因（OR13A1、OR4E1、OR6K6、OR10G2、OR6C68、OR56A3），进一步强化了感觉受体基因家族内高变异性的反复观察。其他多态性位点包括与免疫功能相关的TRAV39[35]，以及SCYGR4，这是一个在研究安纳托利亚绵羊品种的遗传特征时鉴定出的基因[36]。在UCN2中也观察到了大量SNP，这是一种在骨骼肌中高度表达的基因，调节能量平衡、葡萄糖代谢和肌肉质量[37]，支持其与生长性能和体成分等生产特征的潜在相关性。在SER中表现出最高插入/缺失密度的基因进一步突出了与结构完整性、代谢处理和调控控制相关的位点变异。最显著的插入/缺失信号出现在KRTAP4-3中，其次是CYP4F21、SPRR4、KIAA0040和SCYGR6。角蛋白相关蛋白和小型富含脯氨酸的蛋白质在表皮分化和皮肤屏障组装中起关键作用[32,34]。如上所述，KIAA0040与肉质特征相关[33]。此外，CYP4F21是一种特定的细胞色素P450酶，首次在绵羊（ovine）精液囊中被鉴定，作为前列腺素E2 20-羟化酶，对代谢前列腺素至关重要，并可能参与生殖过程[38,39]。值得注意的是，OR10C1也出现在具有较高插入/缺失密度的基因中，进一步强化了感觉受体位点内广泛变异的信号。这些模式表明LES中的遗传分化可能主要反映了保守的代谢、感觉和结构系统的调节，可能支持对局部放牧条件和环境异质性的适应。SER是本研究中研究的另一个品种，代表了一个在地理限制较少的条件下饲养的大陆群体，暴露于多样的环境、营养和管理制度中。本研究的结果表明，SER在结构、调控和信号传导相关过程中表现出富集，这种模式在携带优先错义SNP和插入/缺失的基因的功能富集分析以及标准化多态性密度分析和比较分析中一致观察到。这样的功能模式可能与双用途品种（如SER）中观察到的组织发育、生长性能和生理调节的更高需求一致[14]。在生物过程层面，SER在基因组维护和细胞周期调节、纤毛组装和组织、微管基细胞骨架过程以及细胞投射组装方面表现出富集，强调了细胞结构和调控控制机制的重要性。这些发现进一步在分子功能层面得到了支持，表现为离子通道和钙信号传导活性、小GTP酶和核苷三磷酸酶活性、核酸相关和ATP依赖的催化功能以及脂质运输和脂质代谢活性的富集。这些功能直接与能量平衡和代谢效率相关，对于支持生长和泌乳性能至关重要。KEGG通路分析证实了这一功能特征，揭示了DNA损伤修复通路、细胞骨架和运动蛋白通路以及ECM-受体相互作用的富集，表明在细胞信号传导、结构组织和细胞-基质通信相关的通路中存在协调变异。对SER中标准化SNP密度的分析识别出一组表现出增加多态性的基因，主要涉及毛发和皮肤结构、感觉感知和免疫相关信号传导的基因。值得注意的是，与羊毛和毛发纤维相关的KRTAP4-2表现出最高的SNP密度，其次是几个嗅觉受体基因（OR13A1、OR4E1、OR6K6、OR10G2、OR6C68、OR56A3），进一步强化了感觉受体基因家族内高变异性的反复观察。此外，TRAV39与免疫功能和信号传导相关[35]，SCYGR4是在研究安纳托利亚绵羊品种的遗传特征时鉴定出的基因[36]。在UCN2中也观察到了大量SNP，这是一种在骨骼肌中高度表达的基因，调节能量平衡、葡萄糖代谢和肌肉质量[37]，支持其与生长性能和体成分等生产特征的潜在相关性。在SER中表现出最高插入/缺失密度的基因进一步突出了与结构完整性、代谢处理和调控控制相关的位点变异。最显著的插入/缺失信号出现在KRTAP4-3中，其次是CYP4F21、SPRR4、KIAA0040和SCYGR6。角蛋白相关蛋白和小型富含脯氨酸的蛋白质在表皮分化和毛发结构中起关键作用[32,34]。如上所述，KIAA0040与肉质特征相关[33]。此外，CYP4F21是一种特定的细胞色素P450酶，首次在绵羊（ovine）精液囊中被鉴定，作为前列腺素E2 20-羟化酶，对代谢前列腺素至关重要，并可能参与生殖过程[38,39]。此外，富集插入/缺失的基因DSPP编码一种在牙齿形成中起关键作用的蛋白质，其突变会导致牙本质缺陷[40]。总体而言，SER品种表现出一种遗传分化的模式，其特征是与结构特征、感官感知、免疫信号传导以及代谢和调控功能相关的基因变异增加。这种分化可能与保守的生物系统在应对多样化的大陆环境和管理条件时的精细调节一致。THR是另一种存在于希腊大陆的品种。与LES种群不同，THR生长在具有明显季节性变化、混合放牧系统和多样化管理实践的大陆地区——这些因素可能塑造了与其相关的基因组特征。这与THR品种的特性相符，该品种通常在广阔的放牧系统中饲养，并以其对恶劣环境条件和季节性变化的适应性而闻名[15]。对THR中优先考虑的错义SNP所涉及的基因进行的功能富集分析显示，这些基因在基因组维护和DNA修复、纤毛组装和组织、基于微管的细胞骨架过程、细胞突起组装以及细胞外结构组织等生物过程中富集。在面临环境压力的种群中，这些过程尤为重要，因为高效的细胞维护和修复机制至关重要。在分子功能层面，THR特有的富集包括与核酸相关的催化活性、ATP依赖的催化活性、小GTP酶和核苷三磷酸酶活性的调控、离子通道活性，以及与脂质代谢和酯水解相关的功能。KEGG通路分析进一步支持了这一功能特征，显示出基因组维护和蛋白质生物合成通路、细胞骨架和肌肉相关通路、ABC转运蛋白通路、ECM-受体相互作用以及与氨基酸代谢相关的代谢通路的富集，包括氨基酰-tRNA生物合成和赖氨酸降解。这些通路与代谢适应密切相关，可能有助于生理反应以应对营养供应的波动。

对THR中标准化SNP密度的分析发现了一组多态性较高的基因，主要集中在涉及感官感知、结构特征和免疫相关信号传导的位点上。嗅觉受体基因（如OR2A12、OR1J4、OR8I2、OR56A5、OR6C68、OR6N1、OR2T1和OR13A1）的SNP密度最高，这可能与适应异质性和季节性变化的放牧环境有关。其他高度多态性的位点包括KRTAP36-1（与羊毛和毛发纤维相关[34]）、TRAV39和TRDV3（与免疫功能和T细胞受体信号传导相关[35]），这些基因在广阔的管理条件下对维持健康和适应性至关重要，以及UCN3（参与调节应激反应、食欲和葡萄糖稳态[41,42]），表明它们可能在生理适应环境压力和资源变化中发挥作用。这些发现共同表明，THR中与环境感知、结构特征和免疫反应相关的基因具有较高的变异水平。在THR中表现出最高插入/缺失密度的基因进一步强调了与代谢处理、调控控制和细胞组织相关的位点的变异。最强的插入/缺失信号出现在CYP4F21中，其次是SCYGR6、OR10Q1、OR8I2和OR6C68。如前所述，CYP4F21编码一种参与前列腺素代谢的细胞色素P450酶，表明其与生殖和代谢过程可能相关[38,39]。其他富含插入/缺失的基因还包括FOXL2（对卵巢发育和功能至关重要的转录因子[43]）和BHLHE41（被认为是关键的转录调节因子，其重要性在免疫细胞功能研究中得到证实[44]）。同样值得注意的是CDK5R2和ZNF688，它们参与转录调控、发育过程和细胞应激反应，这与功能层面观察到的调控和细胞器相关生物过程的富集一致。这些发现表明，THR在与环境感知、结构特征和免疫反应相关的基因中积累了较高的变异。

此外，对SNP密度的分析还揭示了一组多态性较高的基因，主要位于涉及感官感知、结构特征和免疫相关信号传导的位点上。嗅觉受体基因（如OR2A12、OR1J4、OR8I2、OR56A5、OR6C68、OR6N1、OR2T1和OR13A1）的SNP密度最高，这可能与适应异质性和季节性变化的放牧环境有关。其他高度多态性的位点还包括KRTAP36-1（与羊毛和毛发纤维相关[34]）、TRAV39和TRDV3（与免疫功能和T细胞受体信号传导相关[35]），这些基因在广阔的管理条件下对维持健康和适应性至关重要，以及UCN3（参与调节应激反应、食欲和葡萄糖稳态[41,42]），表明它们可能在生理适应环境压力和资源变化中发挥作用。这些发现共同表明，THR在与环境感知、结构特征和免疫反应相关的基因中具有较高的变异水平。在THR中表现出最高插入/缺失密度的基因进一步强调了与代谢处理、调控控制和细胞组织相关的位点的变异。最强的插入/缺失信号出现在CYP4F21中，其次是SCYGR6、OR10Q1、OR8I2和OR6C68。如前所述，CYP4F21编码一种参与前列腺素代谢的细胞色素P450酶，表明其与生殖和代谢过程可能相关[38,39]。其他富含插入/缺失的基因还包括FOXL2（对卵巢发育和功能至关重要的转录因子[43]）和BHLHE41（被认为是关键的转录调节因子，其重要性在免疫细胞功能研究中得到证实[44]）。CDK5R2和ZNF688也值得注意，它们参与转录调控、发育过程和细胞应激反应，这与功能层面观察到的调控和细胞器相关生物过程的富集一致。这些发现表明，THR在与细胞结构、代谢、免疫信号传导和环境感知相关的基因中积累了较高的变异，这可能与适应多变的大陆环境和社会生产条件有关，尽管这种解释应谨慎对待。

除了全基因组测序（WGS）分析外，对优先考虑的错义SNP的群体水平验证进一步支持了发现阶段的发现结果的可靠性。大多数位点的等位基因频率模式与基于WGS的分类一致，且一些变异在品种间表现出显著差异。这些结果表明，许多优先考虑的变异反映了真实的群体水平遗传差异，而非个体特异性变异。同时，一部分位点没有复制预期的模式，这可能反映了随机变异、小群体中的等位基因频率波动或发现阶段包含的个体数量有限。这种差异在探索性基因组研究中很常见，突显了在更广泛的群体样本中验证候选变异的重要性。总体而言，验证分析增强了人们对所识别位点生物学相关性的信心，并为未来群体遗传学和育种研究提供了基础。对候选变异的群体水平分布分析提供了关于品种遗传分化的宝贵见解，即使在没有直接基因型-表型关联的情况下也是如此。一些经过验证的变异位于具有已知生物学功能的基因中，这些功能与经济重要性和适应性特征相关。具体来说，角蛋白相关蛋白基因（KRTAP家族）中的变异可能与羊毛和纤维特性有关，因为这些基因是影响羊毛质量和毛皮特性的关键结构成分[45,46]。此外，KRTAPs中的氨基酸变化已被证明会影响翻译后修饰和蛋白质电荷，从而可能影响纤维结构[47]，而特定的KRTAP变异已与不同绵羊品种的羊毛特性相关[48,49]。同样，CDH15参与肌肉发育和细胞增殖[50]，并且据报道在不同肉质特征的绵羊中表达不同[51]。AURKA和ADAMTS3等基因也与绵羊的生殖和发育过程有关[52,53]，表明它们可能与生产特性相关。此外，PRKDC基因（编码DNA依赖性蛋白激酶的460 kDa催化亚基）的变异与绵羊的生长相关特性有关[54]，而IL17B可能与免疫功能和适应性相关，这些特性对动物健康和适应环境压力至关重要[55]。值得注意的是，大量经过验证的变异位于嗅觉受体（OR）基因中（例如OR10C1、OR1J4、OR9A1P）。已知嗅觉受体基因家族在物种和环境之间表现出高进化周转率和变异性，反映了生态位的适应。最近的证据表明，包括绵羊在内的哺乳动物物种适应了特定环境（如高海拔栖息地），表现出功能嗅觉受体库的趋同减少，表明嗅觉基因受到环境驱动的选择压力[56]。这支持了嗅觉基因的变异可能反映生态适应而非直接生产特性的假设。

尽管这些观察结果没有建立特定变异与表型之间的直接因果关系，但它们提供了与经济和适应性特征相关的生物学上的合理联系。这些变异在群体水平上的分布代表了向未来基因型-表型关联和功能研究探索的候选标记的第一步。然而，这些特定变异对蛋白质结构和功能的直接功能效应尚未通过实验得到验证。因此，这些解释仍然属于假设生成阶段。基于已识别的品种特异性功能和基因水平特征，希腊本土绵羊品种之间共享和独特的编码变异模式对于保护、可追溯性和育种策略具有重要意义。虽然品种间保守的功能基础突显了保护对群体适应性至关重要的核心遗传多样性的必要性，但存在独特的、品种特异性的变异集，特别是在与感官感知、生产特性、代谢和免疫功能相关的基因中，强调了每个群体的遗传独特性。表现出较高多态性密度的基因和变异，特别是在嗅觉受体家族、角蛋白相关蛋白和调控位点中，可能代表有价值的基因组标记，有助于品种的可追溯性和认证，从而支持本土遗传资源的保护。此外，对选定错义SNP的群体水平验证确认了大多数位点的预期等位基因频率模式，进一步支持了发现阶段识别的优先变异的相关性。同时，这些变异的功能注释为未来的标记辅助或基因组选择策略提供了有价值的框架，这些策略尊重品种身份，同时针对当地环境背景下的适应性、适应性和生产力特征。总体而言，这些发现突显了将基因组信息整合到保护和育种计划中的潜在价值，旨在保障希腊绵羊品种的长期可持续性和适应能力。

目前，还将我们的发现与Tsoureki等人（2025年）[12]的研究进行比较也很重要。虽然Tsoureki等人（2025年）[12]提供了希腊绵羊品种的首个全基因组测序数据集，并专注于变异发现和数据集特征描述，但本研究通过优先考虑功能相关的编码变异并在独立群体中验证选定的SNP，从而提供了额外的生物学和应用见解。具体来说，我们研究的新颖之处在于：(i) 有针对性地识别和优先考虑具有潜在功能影响的编码变异，特别是错义SNP和插入/缺失；(ii) 应用专门的生物信息学过滤和比较框架来识别品种特异性和共享变异；(iii) 使用MassARRAY基因分型方法在独立群体（每个品种18只动物，共54只）中验证选定的候选SNP。最后，应承认本研究的几个优点和局限性。一个主要优点是专注于希腊本土绵羊品种，这些品种在基因组和功能注释研究中相对较少被研究。据我们所知，这项研究是首次系统地描述、功能注释并比较多个本土希腊绵羊品种的SNP和插入/缺失变异的努力之一。该研究的另一个优点是使用MassARRAY基因分型对优先考虑的错义SNP进行了群体水平验证，确认了许多候选变异的等位基因频率模式，并进一步支持了发现阶段发现结果的生物学相关性。这些分析为未来的保护、可追溯性和育种计划提供了宝贵的基因组资源。然而，相对有限的测序个体数量限制了个体水平变异的分辨率，并限制了检测稳健选择特征或建立直接基因型-表型关联的能力。尽管如此，跨品种水平、成对和三重比较分析中观察到的功能富集模式的一致性，以及优先SNP的群体水平验证，支持了所报告功能类别的生物学相关性。本研究的另一个局限性是专注于编码变异，特别是错义SNP和插入/缺失，而未探索调控区域（如UTR和上游/下游元件）。尽管这些变异可能在基因表达和表型变异中起重要作用，但其解释仍然复杂。此外，目前家畜物种的基因组注释通常基于广泛研究的或商业化的群体，可能无法完全捕捉本土品种的调控变异。

关于未来的研究方向，未来的工作应扩展基因组分析范围，包括更多本土希腊绵羊品种，以提供更全面的遗传多样性和适应性变异视图。本研究关注了三个代表性品种（莱斯沃斯、塞雷斯和色雷斯），选择这些品种是基于样本可用性和它们的地理及表型多样性。最近希腊的绵羊痘爆发对样本收集造成了重大限制，由于移动限制和动物扑杀，包括本地品种。在这种情况下，记录现有的基因组变异对于支持这些遗传资源的保护和可持续管理尤为重要。未来的研究还应扩展分析范围，包括调控区域，并整合额外的基因组信息（如转录组或表观遗传数据），以改善非编码变异的功能解释，特别是在代表性不足的本土群体中。未来的研究可以结合群体遗传学方法，如主成分分析（PCA）、混合分析、系统发育重建和选择测试，以进一步研究塑造品种间遗传变异的进化力量。这样的分析将提供关于群体结构、基因流和潜在选择特征的更深入见解，补充了本研究中采用的以变异为中心的方法。包括更大的群体和全基因组数据集对于在本土品种背景下进行稳健的群体水平推断至关重要。最后，未来的研究应重点关注使用蛋白质结构建模、体外检测和综合多组学分析等方法对候选变异体进行功能表征，这将有助于更深入地了解它们的潜在生物学和表型效应。总体而言，本研究为探索希腊绵羊基因组变异的功能景观提供了一个初步框架，并强调了未来研究的必要性，即需要更大的样本量、整合的表型和环境数据以及更广泛的验证工作，以进一步阐明品种特异性特征和局部适应性的遗传基础。

**5. 结论**

在这项研究中，我们利用全基因组测序技术对三个希腊本土绵羊品种的编码序列变异进行了表征和比较，重点关注了影响蛋白质结构的SNP和外显子插入/缺失（indels）变异。我们的分析显示，这些品种在功能上具有高度保守性，主要涉及基因组维持、细胞骨架组织和核心调控过程等通路，同时还发现了一些与品种相关的功能模式。通过将功能富集分析与多态性密度分析相结合，我们识别出可能与感官感知、结构特征、代谢调节和环境响应相关的基因和通路。为了进一步评估发现阶段鉴定出的候选变异在群体水平上的相关性，我们在另一个独立队列中使用了MassARRAY基因分型技术对这些错义SNP进行了验证。大多数位点的等位基因频率模式与基于全基因组测序的分类结果一致，其中一些变异在不同品种之间存在显著差异，而另一些则表现出预期的趋势但未达到统计学显著性。这些结果支持了变异优先级方法的可靠性，并突出了可能对所研究群体间的遗传分化有贡献的位点。

综上所述，这些发现为希腊本土绵羊品种的基因组变异功能景观提供了新的见解，并为未来探索遗传多样性与表型特征、局部适应性和可持续育种策略之间联系的研究奠定了基础。我们强调，本研究中提出的功能解释应谨慎对待，并将其视为假设生成的过程，因为需要直接的基因型-表型关系和实验验证来确认这些关联。虽然某些观察到的模式可能与所研究品种的独特地理起源和环境条件相符，但这些关联不应被解释为适应性的直接证据，而应被视为需要进一步研究的潜在生物学过程的指示。

**补充材料**

以下支持性信息可在此处下载：**
https://www.mdpi.com/article/10.3390/cimb48050480/s1