利用 Electron-driven 有氧生物固氮技术，以蔗糖作为唯一碳源，由 Azotobacter vinelandii 实现蛋白质和铵的production

《Bioresource Technology》：Electro-driven aerobic biological nitrogen fixation for protein and ammonium production by Azotobacter vinelandii with sucrose as the sole carbon source

　　

任丽颖|朱敏|陈奇|邹国华|王新雪|卢伟|林敏|周正富|展玉华|严永亮

中国农业科学院农业微生物国家重点实验室/生物技术研究所，北京100081，中国

摘要

生物固氮技术大规模应用面临的主要挑战是能源需求高以及固氮酶对氧气的高度敏感性。生物电化学固氮（e-BNF）提供了一种有前景的策略来克服这些能源限制，然而，现有的e-BNF系统主要局限于厌氧或微好氧条件，仍无法在高效固氮与高密度细胞培养和工业好氧发酵之间取得平衡。本文开发了一种新型的好氧e-BNF系统，在以蔗糖为唯一碳源的好氧条件下显著提升了Azotobacter vinelandii的固氮性能：生物量和铵产量分别增加了2.73倍和9.36倍。机制研究表明，外源电能特异性激活了Mo–Fe固氮酶系统，这一过程通过广泛的代谢重编程和氧化磷酸化作用实现。研究发现了一种双电子转移机制——主要增强Rnf1–NifF途径（活性超过90%），同时新发现的电子传递旁路恢复约9.3%的活性。代谢工程进一步放大了这些效果：异源OmcS纳米线使电驱动的铵分泌增加了7.23倍；phbB基因的缺失消除了竞争性的PHB合成，减少了57.30%的碳消耗，并使细胞蛋白质含量提高了66.72%。本研究阐明了好氧e-BNF的协同作用机制，并为绿色氨气和单细胞蛋白质生产提供了可再生能源原型。

引言

氮是构成生命体基本生物分子（如蛋白质和核酸）的关键元素。尽管大气中78%的成分是N₂，但其惰性的三键结构阻碍了大多数生物体直接利用它（Minteer等人，2018年）。工业上，Haber–Bosch工艺在高温高压下将N₂转化为NH₃，这消耗了大约1–2%的全球能源，并导致大量温室气体的排放（Milton等人，2017年）。相比之下，由微生物中的固氮酶在常温常压下催化的生物固氮作用是自然氮循环的核心，具有绿色和可持续性的天然优势（Vicente和Dean，2017年）。然而，固氮酶催化的N₂还原过程是一个极其耗能的过程，每固定一个N₂分子至少需要16个ATP分子和8个电子。这种巨大的能源需求大大限制了固氮微生物的生长速率和总产量（Olivares等人，2013年）。

新兴的微生物电合成技术，特别是用于氨气生产（e-BNF），为解决能源挑战提供了有前景的策略（Milton和Mintelner，2017年；Seefeldt等人，2018年）。该技术利用外部电能作为代谢燃料，直接或间接地为固氮酶提供还原当量和ATP，实现由可再生能源驱动的“绿色氨气合成”（Chen等人，2021年）。然而，当前的e-BNF研究仅集中在严格厌氧或微好氧系统中，以防止氧气对固氮酶的损害（Chen等人，2021年；Dong等人，2021a；Liu等人，2025a；Lu等人，2020年；Zhang等人，2024年）。这类系统常常面临微生物生长缓慢、固氮速率低以及与现有好氧工业发酵基础设施兼容性差的问题。更根本的是，完全依赖电能的自养模式通常会抑制细胞生长，导致固氮微生物的生物量极低，难以提高总氨气产量，从而在实际应用中存在显著差距（Chen等人，2021年；Dong等人，2021a；Lu等人，2020年；Zhang等人，2024年）。因此，确定是否以及如何克服好氧条件下的固氮效率限制，并建立一种结合高生物量、高固氮速率和与工业发酵条件兼容性的新e-BNF范式，是推动该技术向实际应用迈进的关键科学问题。

好氧固氮微生物Azotobacter vinelandii为上述挑战提供了独特的生物解决方案。通过一种复杂的“呼吸保护”机制（Poole和Hill，1997年；Oelze，2000年），A. vinelandii利用部分电子传递链快速消耗氧气，为细胞内的固氮酶创造局部厌氧微环境，从而在好氧条件下实现固氮（Martin del Campo等人，2023年）。此外，它还具备完整的异养代谢网络，能够在缺乏固定氮源的环境中快速生长并积累大量生物量。其生物量富含蛋白质（尤其是含铁蛋白质），使其成为高质量的单细胞蛋白质来源。好氧固氮微生物具有生长速度快、氧气保护机制强大和蛋白质价值高的内在优势。通过将这些内在能力与外部电能直接输入相结合，可以构建一种由“协同电子能量和有机碳”驱动的新固氮系统。该系统有望同时克服能源限制、氧气敏感性和与工业发酵兼容性的三大挑战。这将有助于建立高效、高密度和可持续的好氧生物氨气和单细胞蛋白质生产过程。

因此，本研究旨在建立一种由电能和有机碳共同驱动的新型高效好氧固氮范式，解决能源限制、氧气敏感性和与工业发酵兼容性的三个核心问题。以好氧固氮微生物A. vinelandii为研究模型，我们首先筛选出对电能反应最强的菌株并优化系统参数，以建立稳定且高效的电驱动好氧固氮系统。通过多组学分析、基因操作和电化学表征，系统阐明了外源电能驱动固氮的分子机制，特别是其在固氮酶系统选择、能量代谢重编程和电子传递网络中的调控作用。最后，通过引入外源电子传递模块和删除内源性竞争途径，合理工程化了宿主菌株，从而协同增加了铵产量和细胞蛋白质合成。本研究的目的是阐明好氧条件下的电-生物能量耦合新机制，并为开发由可再生能源驱动的下一代生物制造技术奠定基础，这些技术结合了高固氮效率和经济可行性。

章节片段

细胞培养

本研究中使用的所有细菌菌株及其构建信息均列在补充材料中。Azotobacter vinelandii GDMCC No. 1.1487和Bradyrhizobium japonicum ACCC15027存储于广东微生物保藏中心（中国）。Pseudomonas stutzeri A1501从水稻稻田土壤中分离并在我们的实验室保存（Yan等人，2008年）。A. vinelandii在改良的Burk’s培养基中于30°C和220 rpm下培养（Bueno Batista等人，2021年），直至OD₆₀₀达到...

Azotobacter vinelandii与其他固氮微生物相比表现出更强的电响应性

本研究评估了三种代表性固氮微生物——好氧自由生活的Azotobacter vinelandii GDMCC No. 1.1487、微好氧共生固氮微生物Pseudomonas stutzeri A1501以及微好氧联合固氮微生物Bradyrhizobium japonicum ACCC15027——在电化学系统中利用电能进行固氮的能力，以探索外源电能作为克服能量限制的新驱动力的可能性...

结论

本研究成功构建了一种高效且协同作用的阴极电驱动BNF系统，克服了传统电驱动生物固氮（e-BNF）系统通常只能在严格厌氧/微好氧条件下运行的限制。我们全面阐明了其分子机制，并通过定向代谢工程进一步提升了其性能。最佳驱动电位确定为?0.8 V（相对于...

CRediT作者贡献声明

任丽颖：撰写——初稿，软件开发，方法论设计，实验设计，数据分析。朱敏：方法论设计，数据分析。陈奇：方法论设计，数据分析。邹国华：方法论设计，数据分析。王新雪：方法论设计，数据分析。卢伟：结果验证，监督。林敏：结果验证，监督。周正富：撰写——审查与编辑，资金获取，概念构思。展玉华：撰写——审查与编辑，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2024YFA0918200）、国家自然科学基金（32270067和32370091）、海南种业实验室和中国国家种业集团（ZZGS-ZNBM-2025-230）、农业科学技术创新计划（CAAS-ZDRW202303和CAAS-ZDRW202609）以及中国科学院战略性先导科技专项（项目编号XDA28030201）的支持。