利用Aptakiss引导的CRISPR/Cas13a信号放大技术，结合基于CsPbBr3@PDA@AuNPs的电化学发光平台，实现超灵敏的FEN1检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Aptakiss-Guided CRISPR/Cas13a Signal Amplification for Ultrasensitive FEN1 Detection Using CsPbBr3@PDA@AuNPs-Based Electrochemiluminescence Platform

　　

Jihua Wei|Jiahui Wang|Runze Wu|Jiayi Zhang|Haozhen Ren|Qianli Tang|Longjian Huang|Kai Zhang|Xianjiu Liao

中国广西百色市右江民族医专附属医院骨与关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室

摘要

灵敏可靠的DNA修复酶检测对于癌症的早期诊断和治疗监测至关重要。本文报道了一种新型电化学发光（ECL）生物传感器，用于超灵敏地检测Flap内切酶1（FEN1），该传感器结合了aptakiss辅助的CRISPR/Cas13a信号放大策略和基于钙钛矿的纳米复合传感器接口。具体而言，构建了一种由CsPbBr₃纳米晶体组成的杂化纳米材料，该材料表面涂覆有多巴胺（PDA）并装饰有金纳米粒子（AuNPs），形成了核-壳-卫星结构（CsPbBr₃@PDA@AuNPs）。PDA涂层提高了CsPbBr₃的水稳定性，并引入了用于探针结合的功能基团，而AuNPs则促进了电子转移和信号放大。当FEN1识别并切割具有翼状结构的DNA底物时，会启动下游的转录反应生成RNA触发剂，进而激活Cas13a系统。Cas13a切割形成aptakiss复合体所需的表面连接RNA链，从而消除了基于铁茂的ECL淬灭效应，恢复了强烈的发光。所设计的生物传感器表现出1.73 fM的优异检测限，对非特异性核酸酶具有高选择性，并显示出显著的重现性和长期稳定性。这项研究不仅为FEN1的检测提供了一个强大的生物传感平台，还展示了CsPbBr₃@PDA@AuNPs作为多功能ECL活性材料的潜力。该纳米复合材料的模块化设计和可调功能使其能够广泛应用于检测各种生物分子，为基于钙钛矿的先进ECL生物传感器在临床和环境诊断中的开发铺平了道路。

引言

Flap内切酶1（FEN1）是一种结构特异性核酸酶，在DNA复制、修复和凋亡过程中起着关键作用，它通过切割Okazaki片段处理和碱基切除修复途径中形成的5′翼状结构来发挥作用。异常的FEN1表达越来越多地被认为是多种癌症的标志，包括乳腺癌、肺癌和前列腺癌，其上调通常与肿瘤进展、基因组不稳定性和患者预后不良相关（Cheng等人2024；He等人2025；Jiang等人2024；Wang等人2024b）。鉴于其在致癌过程中的重要作用，FEN1已成为癌症生物学中一个有前景的诊断生物标志物和治疗靶点。因此，准确且超灵敏地检测生物样本中的FEN1活性对于癌症相关细胞事件的早期诊断和实时监测具有重要意义（Cai等人2022；Cheng等人2024；He等人2025）。

传统的FEN1检测方法主要依赖于凝胶电泳或使用标记DNA底物的荧光读数，这些方法在灵敏度、实时监测和抗背景干扰方面存在局限性（Cheng等人2024；Li等人2023a；Wang等人2024b）。为了克服这些限制，最近的研究策略将CRISPR/Cas13a系统引入信号放大级联中，利用Cas13a独特的RNA引导和跨切割活性来提高灵敏度和选择性（Cheng等人2024；Li等人2024；Pei等人2025；Tang等人2024；Wang等人2024a）。然而，现有的CRISPR集成生物传感器通常缺乏稳健的信号门控模块，这对于减少假阳性结果至关重要，而且它们很少解决需要可逆、可切换接口来调节信号输出的问题（Cheng等人2024；Wei等人2023；Zhang等人2023）。

为了解决这些问题，我们提出了一种新型电化学发光（ECL）生物传感器，该传感器将小分子响应的aptakiss模块与FEN1触发的CRISPR/Cas13a信号放大集成在一个高发射性的纳米平台上（Li等人2023b；Li等人2022b；Liang等人2024；Liu等人2020；Zhang等人2022）。aptakiss（基于适配体的亲吻复合体）是一种独特的核酸组装方式，其灵感来自病毒环-环相互作用，其中发夹适配体（aptaswitch）在配体结合时发生构象变化，从而暴露出一个环序列，与互补的发夹（aptakiss探针）形成亲吻复合体（Zhang等人2017；Zhao等人2018）。这种相互作用可以由小分子（此处为腺苷）的存在精确控制，为调节下游信号传导提供了强有力的工具（Barth等人2016；Durand等人2014；Ennifar等人2001）。尽管aptakiss机制之前已被用于腺苷和酶活性的荧光读数，但其与CRISPR和ECL平台的集成尚未被探索。

在我们的设计中，电极表面修饰了发光复合纳米材料CsPbBr₃@PDA@AuNPs，这种材料结合了钙钛矿纳米晶体（CsPbBr₃的高量子效率、多巴胺（PDA）的生物相容性和功能性以及金纳米粒子（AuNPs）的锚定能力（Li等人2019；Lou等人2019；Qiao等人2017；Wu等人2025）。一种名为Kiss-An的DNA探针被固定在电极表面，其中包含一个腺苷适配体域和一个能够与铁茂标记的互补链Kiss-Rep形成亲吻复合体的环序列。在腺苷存在的情况下，Kiss-An会发生结构转变，使其环暴露出来，从而与Kiss-Rep发生杂交。这使Fc基团靠近钙钛矿纳米晶体，有效降低了它们的ECL信号。

为了实现FEN1响应的信号恢复，引入了三重级联放大系统。当FEN1识别并切割具有翼状结构的DNA底物时，会释放一个触发DNA，启动T4 DNA连接酶介导的环化（Hou等人2013；Jie等人2019；Zhou等人2015）和T7 RNA聚合酶转录（Dousis等人2023；Kim等人2024；Wei等人2023），生成大量的RNA激活剂。这些转录本激活了Cas13a的旁路切割活性，从而降解了固定在电极上的RNA连接器，使Kiss-An探针不再能在电极界面形成稳定的亲吻复合体。这种双重控制机制——需要腺苷的存在和FEN1活性的缺失来抑制信号——赋予了生物传感器高选择性、最小化的背景干扰以及信号开启的输出格式。

与现有的FEN1检测系统相比，本研究提出了几项关键创新：（1）首次将小分子响应的aptakiss模块集成到ECL生物传感平台上；（2）使用腺苷作为开关、FEN1作为触发器的双重门控信号逻辑；（3）应用CsPbBr₃@PDA@AuNPs作为具有淬灭敏感性的高效ECL发光体；（4）使用CRISPR/Cas13a作为强大的正交放大器，将酶活性与核酸降解和信号控制联系起来。

这种生物传感器提供了一个敏感、特定且模块化的平台，用于检测FEN1活性，并且可以通过序列重编程扩展到其他核酸酶、小分子或疾病生物标志物。这里提出的策略为开发集成适配体构象动态、CRISPR酶学和下一代ECL技术的逻辑门控生物传感器提供了一个概念框架，用于先进的临床诊断。

章节片段

材料和化学试剂

溴化铯（CsBr，99.9%）、溴化铅（PbBr₂，99.999%）、油酸（OA）、油胺（OAm）、1-十八烯（ODE）、盐酸多巴胺、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、四氯金（III）酸氢盐三水合物（HAuCl₄·3H₂O）、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、三（4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶）钌（II）二氯化物（Ru(dcbpy)₃Cl₂）和铁茂羧酸（Fc-COOH）均从Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）购买。玻璃碳

所提出的ECL生物传感器的工作原理

所提出的用于Flap内切酶1（FEN1）检测的电化学发光（ECL）生物传感器的工作原理如图1所示，基于 proximity-controlled quenching gate与FEN1驱动的连接-转录-CRISPR级联相结合，将酶活性转化为稳健的“信号开启”ECL恢复。

图1A展示了高发射ECL接口的构建和低背景基线的建立。杂化的CsPbBr₃@PDA@AuNPs纳米材料

结论

总之，我们开发了一种信号开启的ECL生物传感器，用于超灵敏地检测Flap内切酶1（FEN1），该方法通过将高发射性和水稳定的CsPbBr₃@PDA@AuNPs纳米复合接口与腺苷门控的aptakiss proximity-quenching模块和FEN1驱动的连接-T7转录-CRISPR/Cas13a级联相结合来实现。腺苷诱导的aptakiss形成将铁茂置于钙钛矿发光体附近，建立了一个低背景的关闭状态，而FEN1活性则被转导

CRediT作者贡献声明

Jihua Wei：研究，形式分析。Runze Wu：监督，软件。Jiahui Wang：资源，项目管理。Jiayi Zhang：软件，资源。Qianli Tang：项目管理，方法学。Haozhen Ren：可视化，验证。Kai Zhang：可视化，验证。Longjian Huang：项目管理，研究。撰写——审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

5. 致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（82260887）、广西壮族自治区自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、分析化学生命科学国家重点实验室（SKLACLS2314）、广西骨与关节退行性疾病基础和转化研究重点实验室（21-220-06-202205）、百色生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室（2022-38-05）的支持