结构化水分子驱动GPR174受体的激活和G蛋白选择性

《PLOS Biology》：Structured water molecules drive activation and G protein selectivity in the GPR174 receptor

　　

摘要 G蛋白偶联受体174 (G protein-coupled receptor 174, GPR174) 是自身免疫反应的关键调节因子，它通过不同的G蛋白信号通路，特别是Gs和Gi，来维持免疫稳态。尽管溶血磷脂酰丝氨酸 (lysophosphatidylserine, LysoPS) 激活的GPR174在Gs通路中的结构机制已被阐明，但水化介导的相互作用如何影响GPR174的激活和信号选择性仍不清楚。在此，研究人员解析了LysoPS激活的人源GPR174分别与Gs(2.0 ?) 和Gi(3.4 ?) 结合的高分辨率冷冻电镜 (cryo-electron microscopy, cryo-EM) 结构，揭示了一个连续的水化介导信号转导网络，该网络桥接了钠离子结合口袋、NPxxY和DRY基序以及G蛋白结合界面。这个网络稳定了GPR174的激活态构象，并动态重塑了细胞内腔，从而实现了对Gs和Gi的不同结合。分子动力学模拟和功能实验表明，水化网络对于受体激活至关重要，并能选择性地调节G蛋白偶联。为了评估其保守性，研究人员对A类G蛋白偶联受体进行了序列比对和结构分析，定义了三个水化腔：保守水腔 (conserved water cavity, CWC)、连接水腔 (junctional water cavity, JWC) 和延伸水腔 (extended water cavity, EWC)，其中EWC的水化状态由5.58位点残基的性质决定。综上，本研究揭示了驱动GPR174激活及其双重G蛋白选择性的水化分子机制。这些发现增进了对GPR174中水化介导信号转导的理解，并为研究水介导的A类G蛋白偶联受体调控提供了框架。

研究背景、问题与动机

G蛋白偶联受体 (G Protein-Coupled Receptors, GPCRs) 是重要的跨膜传感器，通过构象激活和选择性G蛋白偶联，将细胞外信号转化为细胞内反应。GPR174是一种A类GPCR，主要在淋巴组织中表达，并与格雷夫斯病、艾迪生病等自身免疫性疾病遗传相关。它在T细胞和B淋巴细胞中通过差异性偶联G_s和G_i蛋白来维持免疫稳态。G_s信号通路促进T细胞耗竭和免疫抑制，而G_i信号则通过降低细胞内cAMP水平来增强效应T细胞分化和细胞毒功能。尽管其生理病理功能重要，并且已知其内源性配体为溶血磷脂酰丝氨酸 (LysoPS)，但GPR174如何被LysoPS激活，以及如何实现对不同G蛋白（尤其是G_s和G_i）的选择性偶联，其分子机制尚不清楚。特别是，内部水分子网络在GPCR信号转导中的作用日益受到关注，被认为是变构调节的关键因素，但这些水网络的组成、保守性及其如何影响G蛋白选择性仍是未解之谜。为了揭示GPR174的活化与信号选择性的结构基础，特别是水分子在其中的作用，研究人员开展了此项研究，相关成果发表在《PLOS Biology》上。

关键技术方法

本研究主要采用了以下关键实验技术：

1. 1.
   信号谱分析：利用NanoLuc Binary Technology (NanoBiT) G蛋白解离实验，量化LysoPS激活GPR174后对不同G蛋白亚型的偶联偏好，证实其对G_s和G_i的强效激活。
2. 2.
   结构生物学解析：通过冷冻电镜技术，分别解析了LysoPS结合的人源GPR174与G_s蛋白复合物（分辨率2.0 ?）和与G_i蛋白复合物（分辨率3.4 ?）的高分辨率三维结构。利用NanoBiT拴链策略辅助复合物组装。
3. 3.
   功能验证与突变分析：对结构识别出的关键残基（如水化网络配位残基、配体相互作用残基、G蛋白界面残基）进行定点突变，并通过NanoBiT G蛋白解离实验和cAMP检测实验（GloSensor assay）评估突变体对受体激活和G蛋白信号转导的影响。
4. 4.
   分子动力学模拟：基于解析的冷冻电镜结构，对GPR174-G_s和GPR174-G_i复合物进行微秒级的分子动力学模拟，分析内部水分子（W_S1–W_S8， W_G1）的稳定性、氢键寿命以及网络动态。
5. 5.
   生物信息学与比较结构分析：使用GPCRdb进行跨A类GPCR的序列比对，利用parKVFinder进行空腔分析，比较不同受体中水化相关空腔的保守性与变异性。

研究结果

信号谱和GPR174的结构表征

通过NanoBiT实验发现，LysoPS激活GPR174表现出强烈的G_s偶联偏好，对G_i也有激活，但对G_q无反应，对G₁₃激活较弱。这支持了高效组装并解析GPR174-G_s复合物结构。

鉴定GPR174中的水化介导网络

在2.0 ?分辨率的GPR174-G_s结构中，研究人员发现了一个由14个有序水分子构成的明确内部水化网络。这些水分子分布在三个功能区域：5个水分子 (W_L1–W_L5) 位于正构结合口袋，稳定LysoPS的极性头部；8个水分子 (W_S1–W_S8) 参与形成和稳定关键激活基序（如DRY和NPxxY）；1个水分子 (W_G1) 介导GPR174细胞内口袋与Gα_sC末端α5螺旋界面间的相互作用网络。这些水分子形成了一个连续的氢键“项链”，将钠离子结合口袋、NPxxY基序、DRY基序和G蛋白结合界面桥接起来。

功能实验表明，突变水分子配位的关键极性残基（如D65^2.50, R116^3.50, D288^7.49, Y292^7.53等）会破坏氢键连接性并损害受体激活。分子动力学模拟显示，这些内部水分子具有较长的停留时间，且在人为移除后能在大约50纳秒内自发重新占据其位点并重建网络，证明了该水化网络的动态稳定性。

A类GPCR中的水化腔和变构水网络

为探究此类水化网络在A类GPCR中的普遍性，研究人员基于GPR174结构定义了三个水化腔：保守水腔 (靠近钠离子结合口袋，由2.50、3.39、7.45位点塑造)、连接水腔 (邻近Y^7.53，连接保守基序) 和延伸水腔 (靠近TM5和TM6的胞质端，由3.50、5.58、5.61位点定义)。

序列比对和空腔体积分析表明，CWC和JWC的塑造残基在A类GPCR中高度保守。而EWC的体积和含水状态则高度可变，其主要决定因素是5.58位点的残基性质。具有短侧链极性不带电残基（如Ser, Thr, Cys）的受体（如GPR174, GPR55）倾向于拥有较大的、充满水分的EWC；而具有庞大疏水/芳香族残基（如Tyr, Phe）的受体（如P2Y₁R, β₂AR）则EWC体积受限，水分子占据有限。

这表明，在受体激活TM6外移过程中，TM5-TM6间的空腔扩大，其稳定可以通过两种方式实现：一是由5.58位点的小极性残基允许水分子进入形成“水支架”；二是由5.58位点的庞大残基提供空间支撑。

GPR174中G蛋白选择性的结构和水化决定因素

通过比较GPR174-G_s和GPR174-G_i的结构，研究人员发现了导致G蛋白选择性的几个关键差异：

1. 1.
   界面大小与疏水口袋：G_s复合物的G蛋白结合界面（1560 ?²）显著大于G_i复合物（890 ?²）。Gα_s的α5螺旋更深地插入一个由TM2和TM3形成的疏水口袋，而Gα_i的α5螺旋则更暴露于表面。突变该疏水口袋的关键残基会严重损害G_s信号，但对G_i信号影响较小。
2. 2.
   水分子桥：仅在G_s复合物中观察到一个结构化的水分子W_G1，它在DRY基序的R116^3.50和Gα_sα5螺旋的骨架羰基之间形成氢键桥。突变R116^3.50会削弱G_s偶联。
3. 3.
   盐桥：在G_s结构中，R115^3.49和D134^4.42之间形成了一个盐桥，这在G_i结构中不存在。破坏此盐桥会显著降低G_s信号，但反而增强了G_i活性，表明该相互作用具有双重作用：促进G_s选择，同时约束G_i激活。
   这些发现表明，GPR174主要通过构象和水化介导的机制，而非配体识别差异，来实现G蛋白选择性。

讨论与结论

本研究通过结构、功能和计算分析，揭示了一种水化介导的信号机制，该机制稳定了GPR174的活性构象并有助于其G蛋白选择性。高分辨率冷冻电镜结构捕捉到了连接保守基序与细胞内G蛋白界面的长停留水分子。突变和分子动力学模拟证实了这些水分子及其配位残基对受体激活和G蛋白选择性的关键作用。

研究人员建立了一个基于空腔的框架来描述内部水网络，定义了CWC、JWC和EWC三个水化腔。研究发现，CWC和JWC在A类GPCR中高度保守，而EWC的水化状态则由5.58位点残基的性质主导，这代表了受体激活时稳定TM5-TM6空腔的两种不同策略：水支架或庞大侧链的空间支撑。

此外，水化也参与了选择性G蛋白的偶联。在GPR174-G_s结构中特有的水桥W_G1、R115^3.49-D134^4.42盐桥以及特定的疏水口袋共同塑造了偏向G_s的细胞内界面。

研究结论：总之，我们的研究建立了一个模块化的水化网络，其中保守的空腔稳定了激活基序，而由5.58位残基塑造的延伸水腔等可变空腔调节了空腔结构和水化。此外，细胞内界面的水分子有助于G蛋白的选择性。总之，这些结果为水化介导的受体激活和G蛋白选择性调控提供了机制性见解。更广泛地说，我们的研究强调了水化介导的信号传导是A类GPCR调控的一个潜在通用机制，激励未来通过高分辨率结构和分子动力学模拟来验证该框架在A类GPCR中的普遍适用性。