《Fisheries Research》：Sequential nanoimmersion and hydrogel-based multivalent vaccination induce durable multilayered immunity against four bacterial pathogens in Nile tilapia (Oreochromis niloticus)
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Benchawan Kumwan|Pakapon Meachasompop|Yosapon Adisornprasert|Chonlatat Rajitdumrong|Pimrawee Chaemlek|Prapansak Srisapoome|Jitraporn Phaksop
Benchawan Kumwan|Pakapon Meachasompop|Yosapon Adisornprasert|Chonlatat Rajitdumrong|Pimrawee Chaemlek|Prapansak Srisapoome|Jitraporn Phaksopa|Wararut Buncharoen|Patcharapong Thangsunan|Pattanapong Thangsunan|Channarong Rodkhum|Natthapong Paankhao|Passakorn Kingwascharapong|Anurak Uchuwittayakul
泰国曼谷卡塞萨特大学渔业学院水产养殖系，水生动物疫苗递送系统开发与应用特别研究孵化器单位，邮编10900
摘要
由Flavobacterium oreochromis、Aeromonas veronii、Streptococcus agalactiae和Edwardsiella tarda引起的细菌感染对尼罗罗非鱼养殖构成了重大威胁。本研究评估了一种多阶段黏膜疫苗策略，该策略结合了序贯纳米乳液浸泡初次免疫和基于水凝胶的口服加强剂，用于针对这四种病原体对Oreochromis niloticus进行免疫。疫苗接种显著增强了黏膜和系统的体液免疫，这通过鳃、皮肤黏液、肠道和血清中的病原体特异性IgM水平升高得到证实。免疫相关基因表达分析显示，在关键免疫组织中ighm、ighd和ight基因的表达显著上调，这与B细胞介导的免疫反应的广泛激活一致。无标记定量蛋白质组学分析显示，接种疫苗的鱼类经历了广泛的免疫重塑，其特征是抗原呈递分子、补体因子、溶菌酶和黏膜防御相关酶的数量增加。肠道微生物组分析表明，疫苗接种使微生物群落组成向更稳定和抗病原体的结构转变，四种目标病原体的定植显著减少。这些免疫和微生物变化与浸泡和腹腔内感染条件下的显著更高的存活率相关。综上所述，这些发现表明，多阶段序贯疫苗接种可能通过协同增强体液免疫、免疫球蛋白基因表达、蛋白质组重塑和微生物组稳定，在尼罗罗非鱼中诱导出广谱、持久的多层保护，为集约化水产养殖中的疾病管理提供了有前景的框架。
引言
尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）是全球最重要的淡水养殖物种之一，因其生长速度快、环境适应性强和市场需求大而受到重视。随着生产规模的扩大以满足全球粮食安全需求，细菌性疾病已成为影响养殖利润和可持续性的主要瓶颈[1]。特别是Streptococcus agalactiae、Flavobacterium oreochromis、Edwardsiella tarda和Aeromonas veronii经常与严重的疫情、高死亡率和巨大的经济损失相关[2],[3],[4]。因此，迫切需要有效的、可持续的疾病控制策略，以减少对抗生素的依赖[5]。疫苗接种是诱导水产养殖中针对特定病原体的持久免疫和支持负责任地使用抗菌剂的关键工具[5]。注射型疫苗可以提供强大的系统保护，但其在罗非鱼养殖中的应用受到劳动力强度、鱼类处理压力以及不适合小型鱼类的限制[6]。通过浸泡或口服途径给予的黏膜疫苗在农场规模上更为实用，可以激发局部和系统免疫，但传统的浸泡疫苗通常只能提供短期保护，而口服抗原在胃肠道中容易降解[6]。这些限制促使人们开发改进的抗原递送系统，以提高抗原的稳定性、吸收和在黏膜组织中的持久性[7]。基于纳米乳液的载体作为浸泡疫苗平台受到了关注[8],[9],[10]，因为它们的纳米级液滴可以促进抗原在鳃和皮肤黏膜中的高效分散和吸收，从而快速且均匀地激活免疫反应[9],[11],[12]。同时，基于水凝胶的递送系统对于口服疫苗也具有吸引力[13],[14],[15]，因为它们的三维聚合物网络可以保护抗原免受胃酸降解，并允许其在肠道（与肠道相关淋巴组织的关键部位）逐渐释放。纳米乳液浸泡和水凝胶口服递送相结合，具有互补的优势，有可能同时增强外部黏膜屏障并随后强化肠道免疫[16],[17],[18]。
一个合理的策略是将这些平台结合在一个序贯疫苗接种方案中。早期的浸泡（纳米乳液浸泡）可以激活与鳃和皮肤相关的淋巴组织[19],[20]，而随后的口服水凝胶加强剂则针对肠道相关的淋巴组织，支持持久的全身性和黏膜免疫反应的发展。然而，这种联合黏膜疫苗接种的免疫机制，特别是在微生物组和蛋白质组水平上，目前在罗非鱼中仍知之甚少[15]。
为了解决这一空白，我们评估了一种多阶段黏膜疫苗接种程序，该程序结合了双纳米乳液浸泡初次免疫和每月一次的基于水凝胶的多价加强剂，针对S. agalactiae、F. oreochromis、E. tarda和A. veronii。采用综合多组学方法，包括病原体特异性IgM测量、免疫基因表达分析、肠道微生物组分析和无标记定量蛋白质组学，我们研究了这种序贯策略如何调节黏膜和系统免疫，以及这些免疫变化如何与对混合细菌感染的防御相关。据我们所知，这是首次评估针对多种细菌病原体的序贯纳米乳液浸泡和水凝胶口服初次免疫-加强疫苗接种策略的研究，为黏膜疫苗诱导的多层免疫提供了新的机制见解，并为集约化水产养殖中的可持续疾病管理开发了实用的、可扩展的疫苗平台。
章节摘要
细菌培养准备
作为尼罗罗非鱼疾病常见致病菌的四种细菌物种Flavobacterium oreochromis（Fo）、Aeromonas veronii（Av）、Streptococcus agalactiae（Sa）和Edwardsiella tarda（Et）被用作疫苗抗原。所有菌株均已在泰国曼谷卡塞萨特大学渔业学院的水生动物健康管理卓越中心（CE AAHM）进行鉴定和保存。S. agalactiae、E. tarda和A. veronii菌株的培养过程如下：
生长表现
在五个月的实验期结束时，评估了尼罗罗非鱼的生长表现（表2）。对照组（18.207 ± 1.275 g）和接种组（18.947 ± 1.368 g）的初始体重相当，证实各处理组之间的基线条件相同。实验结束时，接种组的最终体重为443.974 ± 59.127 g，略高于对照组（436.234 ± 44.484 g），相应地体重增长也更多
讨论
通过ELISA测量的病原体特异性IgM谱表明，多阶段疫苗接种方案在尼罗罗非鱼的黏膜和系统两部分均引发了强烈的IgM反应。接种组的鱼在大多数组织和感染模式下都表现出显著更高的IgM水平，这与通过序贯浸泡和口服加强剂接种反复暴露于抗原所驱动的记忆反应一致[11],[15],[21],[22]。
结论
本研究表明，结合纳米乳液浸泡初次免疫和口服水凝胶加强剂的多阶段疫苗接种策略可以为尼罗罗非鱼提供有效的全层免疫保护，对抗四种主要细菌病原体（F. oreochromis、A. veronii、S. agalactiae和E. tarda）。疫苗接种伴随着强烈的黏膜和系统体液免疫反应，这通过病原体特异性IgM水平的升高和免疫球蛋白基因（ighm等的转录上调得到证实
Benchawan Kumwan：方法学、研究、验证、正式分析、原始草稿撰写。
Pakapon Meachasompop：方法学、研究、撰写及审稿编辑。
Yosapon Adisornprasert：方法学、研究、撰写及审稿编辑。
Chonlatat Rajitdumrong：方法学
Pimrawee Chaemlek：方法学
Jitraporn Phaksopa：撰写及审稿编辑。
Wararut Buncharoen：方法学、研究、撰写及审稿编辑。
Patcharapong Thangsunan：撰写及审稿编辑。
Pattanapong
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
本研究得到了卡塞萨特大学研究与发展研究所（KURDI）（项目编号FF(KU-SRIU)20.67）和泰国国家研究委员会（NRCT）的支持，并与AQUA INNOVAC有限公司合作（合同编号N23G670014）共同完成。
