《Food Bioscience》：Development of a Logic-Engineered CRISPR/Cas12a Aptasensor with Catalytic Hairpin Assembly for Multiplexed Mycotoxin Detection
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作者：Precious Asumadu, Liuchan He, Dingyu Xue, Shujun Li, Ziyi Yan, Nishat Tasnim Sarker, Shijie Li, Dezhao Kong, Hua Ye
单位：江苏科技大学粮食科学与技术学院，镇江
作者：Precious Asumadu, Liuchan He, Dingyu Xue, Shujun Li, Ziyi Yan, Nishat Tasnim Sarker, Shijie Li, Dezhao Kong, Hua Ye
单位：江苏科技大学粮食科学与技术学院，镇江，212003，中国
摘要
黄曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉酮（ZEN）等霉菌毒素在食品中广泛存在，对人类健康构成严重威胁，因此迫切需要开发智能、灵敏且可靠的检测方法。本研究开发了一种基于分子逻辑门的适配体传感器，该传感器利用CRISPR-Cas12a和催化发夹组装（CHA）的双重放大原理同时检测OTA和ZEN。该传感平台作为OR逻辑门运作，根据8000 RFU的荧光阈值将霉菌毒素的存在转换为二进制输出（‘1’或‘0’），从而实现直观和智能的监测。在优化条件下，该适配体传感器对OTA和ZEN的检测范围分别为0至50 ng/mL^-1，检测限分别为0.6 ng/mL^-1和0.3 ng/mL^-1。该方法在小麦样本中表现出优异的分析性能，单个添加分析物的回收率分别为99.7%至102.8%（OTA）和97.0%至106.0%（ZEN），相对标准偏差低于3%，显示出良好的准确性和精确度。OR逻辑门的成功运行进一步体现了其在智能多重检测中的潜力。这项工作为食品安全中的多重污染物监测提供了一个多功能传感平台。
引言
霉菌毒素是食品安全检测中的关键分析物。黄曲霉毒素A（OTA）和玉米赤霉酮（ZEN）是常见的霉菌毒素，已知具有严重的健康风险（Deliklitas & Gokbulut, 2025; Gao et al., 2025; Ullah et al., 2025）。OTA主要由Aspergillus和Penicillium真菌产生，具有肾毒性和致癌性（W. Chen et al., 2024; H. Deng et al., 2025; Pinton et al., 2025; Yao et al., 2025; Y. Zhou et al., 2025）。OTA常见于谷物、干果和咖啡中；而ZEN则由Fusarium真菌产生，与雌激素活性相关，可能导致动物和人类的生殖障碍（Budagova et al., 2025）。由于其结构稳定性，这些霉菌毒素能够在多种环境条件下保持稳定，因此存在于生食品和加工食品中（Xue et al., 2025）。鉴于其普遍性和重大健康风险，亟需一种可靠的生物传感平台来实现它们的同时检测，以确保公共卫生和食品安全。
传统的霉菌毒素检测方法包括高效液相色谱（HPLC）和酶联免疫吸附测定（ELISA）（X. Zhou et al., 2025）。尽管这些方法应用广泛且可靠，但存在成本高、处理时间长以及需要专用设备等局限性。相反，针对霉菌毒素等目标的新兴分子生物传感器设计趋势侧重于整合新型系统，如分子逻辑门、CRISPR系统和包括催化发夹组装在内的放大技术（Haowei et al., 2023; Liu et al., 2025）。这些系统已被证明是生物传感器设计的强大工具。
近年来，OR、AND、INHIBIT、NOT等逻辑门系统或它们的组合作为多重检测的创新方法出现，可以在一次检测中追踪多个目标分子，节省成本和时间（Asumadu et al., 2025）。已有报道指出基于适配体的逻辑门在多重检测中的应用（B. Chen et al., 2024）。一个显著的例子是Yuan et al.（2018）的研究，他们开发了一种基于‘OR’逻辑原理的精氨酸（Arg）对映体的检测系统。同样，F. Deng et al.（2023）评估了OR、AND和INHIBIT逻辑门原理在水样中多氯联苯检测中的应用，实现了灵活和动态的多重检测功能。在经典的霉菌毒素监测逻辑门应用中，Pan et al.（2025）制造了多个串联逻辑门，利用DNA酶级联水解反应。
更值得注意的是，CRISPR/Cas12a与催化发夹组装（CHA）等信号放大技术的结合被用于智能检测分析物，包括霉菌毒素（Asumadu et al., 2026）。这些生物传感器利用Cas12a酶独特的单链DNA（ssDNA）切割能力，通常标记有荧光团，从而发出可测量的荧光信号作为输出（J. Zhang et al., 2022）。Cas12a酶的激活通常需要CHA等放大方法的预处理。这种组装依赖于为检测系统专门合成的ssDNA分子的链杂交。这些策略的结合激活实现了双重放大，提高了传感器的灵敏度，使其在实际应用中表现良好（Liu et al., 2025）。CRISPR/Cas12a的多样性结合CHA，在各种领域得到了应用，将适配体（针对目标分子具有高特异性和可编程性的单链寡核苷酸）等新型分子整合到传感器设计中（Ye et al., 2023）。这些生物传感器在提高目标分析物的灵敏度和选择性方面显示出潜力，即使在低浓度下也是如此。
本研究探讨了将OR布尔逻辑门与催化发夹组装和CRISPR-Cas12a结合，构建用于小麦样本中OTA和ZEN同时检测的适配体传感器。利用OR逻辑门原理，该适配体在OTA和/或ZEN存在时释放触发链，触发CHA循环并通过Cas12a酶的跨切割活性产生下游荧光输出。通过系统优化和选择性分析，该传感器表现出高灵敏度，其检出限低于单一目标传感器，并与多目标生物传感平台相当。它在小麦样本中对目标分析物表现出强烈响应，因此非常适合实际应用。
节摘
化学品和材料
霉菌毒素标准品（包括黄曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉酮（ZEN）、黄曲霉毒素B（OTB）、T-2、DON、伏马菌素B1（FB1）和黄曲霉毒素B1（AFB1）从青岛Pribolab生物工程有限公司（中国青岛）购买。Cas12a（Cpf1）酶和10X NEBuffer? 2.1从New England Biolabs Ltd.购买。DEPC处理的水从Sangon生物技术有限公司购买。小麦样本来自当地超市（中国镇江）。HPLC纯化的DNA探针...
检测原理
传感系统的工作流程如图1所示。逐步操作确保所有组件的正常运行，包括在最佳条件下进行催化发夹组装（CHA）和Cas12a酶的跨切割活性，以保证可靠的响应。
其工作机制基于催化发夹组装驱动的探针杂交，Cas12a在标记为Probe D的ssDNA上发挥作用，产生下游荧光。
结论
总之，我们通过将CRISPR-Cas12a与CHA结合，成功构建了一个分子逻辑门适配体传感器，用于同时检测OTA和ZEN。该适配体设计为布尔OR逻辑门，对一种或两种霉菌毒素的存在均具有敏感响应。利用CRISPR-Cas12a和CHA的双重信号放大作用，该适配体实现了高灵敏度，OTA的检测限为0.6 ng/mL^-1，ZEN的检测限为0.3 ng/mL^-1。
作者贡献声明
Dezhao Kong：撰写——审稿与编辑、验证、正式分析。Hua Ye：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源协调、项目管理、资金筹集、正式分析。Nishat Tasnim Sarker：撰写——审稿与编辑。Shijie Li：撰写——审稿与编辑、验证、资源协调、资金筹集、正式分析。Dingyu Xue：实验研究。Ziyi Yan：数据可视化。Shujun Li：正式分析。Precious Asumadu：撰写——审稿与编辑、原始文献撰写。
未引用参考文献
Chen et al., 2024; Li et al., 2024; Zhou et al., 2025.
资金支持
本研究由中国国家自然科学基金 [32372417] 和 国家重点研发计划 [2023YFF1104703-04] 资助。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能的竞争性财务利益/个人关系：Ye Hua博士报告称获得了中国国家自然科学的财政支持；Shijie Li博士报告称获得了国家重点研发计划的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系。
