无标签的多模式分析方法用于研究髓核骨化过程中胶原-基质的矿化过程，以指导用于脊柱融合细胞治疗的生物活性支架的设计

《International Journal of Biological Macromolecules》：Label-free multimodal profiling of collagen-matrix mineralization during nucleus pulposus osteogenesis to guide bioactive scaffold design for spinal fusion cell therapy

　　

阿兹里尔|黄国远|艾努恩·尼扎尔·马斯布钦|刘平艳|刘文龙|梅迪·鲁哈尼|乔纳森·霍布利|郑耀仁

国立成功大学生物医学工程系，台湾台南市70101

摘要

髓核细胞（NPCs）的成骨分化为基于细胞的脊柱融合提供了一种有前景的生物学方法，可作为骨髓源性间充质细胞（MSCs）的天然替代方案。然而，临床转化需要可靠、非破坏性的分析方法来监测基质成熟度并确定生物力学设计目标。在此，我们建立了一个无标记、多模态的框架，整合了拉曼光谱、二维相关光谱（2D-COS）、X射线衍射（XRD）和纳米压痕技术，以纵向追踪来自退化椎间盘（Pfirrmann III–V级）的人类NPCs的体外成骨过程。拉曼分析确定了关键的光谱标志物，磷酸盐与苯丙氨酸的比例从第14天到第28天逐渐增加，以此来跟踪矿物质的整合情况。重要的是，酰胺I的去卷积显示中心螺旋相关带（1655至1665 cm?1）发生了上移，以及构象复杂性指数（CCI）的增加，这表明胶原丰富基质的结构发生了成熟和异质性变化。此外，2D-COS显示了一个时间序列，其中胶原重塑严格先于磷酸盐积累，随后是整体脂质代谢的下降。全范围主成分分析（PCA，600–3100 cm?1）无偏地区分了不同的表型阶段，确定了第14天的主要发育转变和第28天的稳定化。纳米压痕证实了演化后的基质的有效降低模量（E_r）约为3.25 GPa，这与拉曼衍生的矿物指标（r = 0.737）高度相关。与金属植入物的极端刚性不同，这一约3.25 GPa的基准为未来的支架设计提供了一个生物学相关的刚度目标。

引言

椎间盘退变（IVDD）造成了重大的社会经济负担，并且仍然是慢性腰痛的主要原因[1]。当保守治疗失败时，通常需要进行脊柱融合等外科干预以恢复机械稳定性[2]。然而，当前的标准护理方法严重依赖于惰性金属硬件或同种移植材料，这些材料缺乏自我修复或适应生理机械负荷的生物活力[3]。这种生物力学不匹配经常导致应力屏蔽和相邻节段疾病[4]。因此，再生医学领域越来越多地转向生物替代方案——通常称为“活性融合”策略——这些策略旨在与宿主脊柱无缝结合[5]。

活性融合移植的成功在很大程度上取决于所选择的细胞来源，这些细胞用于合成和组织复杂的矿化细胞外基质（ECM）[6]。这种基质主要由胶原蛋白组成，胶原蛋白是一种高分子量结构蛋白，为羟基磷灰石（HA）的结晶提供了必要的有机框架[6]。虽然骨髓源性MSCs仍然是体外成骨的标准方法，但当暴露在退化椎间盘的恶劣、无血管且酸性的微环境中时，它们往往存活率低且分化不稳定[7]。相比之下，天然的NPCs在进化上适应了这种恶劣环境。最近的证据表明，NPCs具有内在的前体样可塑性，在特定的诱导条件下可以分化为成骨细胞[8]。重要的是，即使在严重退化的脊柱病理微环境中，这种强大的多谱系间充质潜力仍然得以保持，其中驻留的原发性细胞对成骨信号和炎症细胞因子仍然高度响应[9]。这种独特的适应性使NPCs成为生成能够承受脊柱独特生理限制的自体、强健矿化组织的高度有希望的候选者。

尽管具有这种治疗潜力，但临床转化的一个主要障碍是缺乏非破坏性的分析框架来评估工程化ECM的结构和化学成熟度。传统的表征方法主要依赖于破坏性的终点生物学检测——例如使用茜素红S（ARS）染色来观察宏观矿化，以及Western blotting来量化关键成骨大分子的表达，包括骨形态发生蛋白2（BMP2）和RUNX2[10]。尽管这些方法基础扎实，但它们无法对单个移植材料进行纵向跟踪，也无法提供关于全局蛋白质折叠、矿物结晶度或发育中组织功能微力学刚度的定量、实时数据。

为了弥补这一差距，需要先进的无标记计量技术来映射NPC介导的成骨过程中的材料演化。拉曼光谱提供了一个高度敏感的光学“指纹”，能够在不使用外源性标记的情况下，非侵入性地监测整体脂质轨迹、无机矿物沉积和全局胶原蛋白质基质的次级结构重组[11][12][13]。然而，仅凭化学数据不足以建立全面的生物材料设计标准。为了构建一个完整的特征谱，这些光谱特征必须直接与结构和纳米力学基准相关联。X射线衍射（XRD）确认了有机框架内的HA逐步结晶成熟[14]，而纳米压痕则能在亚微米级别精确量化矿化基质的机械刚度（例如，降低模量E_r）[15][16]。

在这项研究中，我们开发了一个多模态计量框架，用于监测人类NPCs在28天内的体外成骨分化。通过结合拉曼光谱、二维相关光谱（2D-COS）、XRD和纳米压痕技术，我们旨在：（1）识别指示大分子成熟和矿化的非侵入性光谱指标；（2）量化NPC衍生胶原基质的纳米力学顺应性的变化；（3）阐明早期骨形成过程中脂质代谢变化和蛋白质结构变化的时间。该框架最终将宏观机械硬化与矿化的拉曼光谱特征联系起来，为定制脊柱生物支架的开发提供了非侵入性的光学和机械标记。

章节片段

NPCs的细胞分离和初级培养

人类髓核组织来自22名患者（N = 22，12名男性和10名女性；平均年龄64.3±9.0岁，范围44–81岁），这些患者均在国立成功大学医院接受了椎间盘切除术。所有程序均在知情同意下进行，并获得了机构审查委员会的批准（IRB编号B-ER-111-524）。

为了确保队列的标准化，纳入标准被严格定义为被诊断为退行性椎间盘疾病的成年患者，并且表现出Pfirrmann分级

宏观矿化、碱性磷酸酶活性和成骨蛋白表达

通过ARS染色确认了NPCs的成骨分化，从第7天到第28天，矿化结节的形成逐渐增加。定量分析表明，钙沉积——矿化细胞外基质（ECM）的标志——在第21天变得统计学上显著（p < 0.001）（图1A-B）。

ALP活性显示出明显的两相模式：细胞内活性在第21天达到峰值后下降，这与晚期

结论

本研究建立了一个多模态计量框架，整合了拉曼光谱、2D-COS、XRD和纳米压痕技术，以定义基于NPC的再生疗法的基础物理化学指标。通过超越传统的孤立峰分配方法，我们证明了早期成骨过程主要是由核心胶原支架的组装驱动的（如酰胺I带从1655 cm?1逐渐上移至1665 cm?1所证明的）。此外，引入了

CRediT作者贡献声明

阿兹里尔：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。黄国远：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、正式分析、概念化。艾努恩·尼扎尔·马斯布钦：撰写——审阅与编辑、研究、正式分析。刘平艳：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理。刘文龙：撰写——审阅与编辑、方法学、数据管理、概念化。梅迪

利益冲突声明

作者声明与本研究、作者身份和/或文章发表没有潜在的利益冲突。

致谢

本工作得到了台湾国家科学技术委员会（MOST110-2124-M-006-005-、111-2321-B-006-013-、NSTC 112-2218-E-006-023-、112-2221-E-006-177-、113-2640-B-006-003-、113-2221-E-006-088-MY3、114-2622-E-006-016-、114-2218-E-006-012-和114-2640-B-006-）、国立成功大学医院（资助编号：NCKUH-11002021、NCKUH-11102057和NCKUH-11410023）以及空军科学研究办公室（AFOSR）（合同编号FA4869-06-1-0056 AOARD）的财政支持