利用粪红假单胞菌PA2（Rhodopseudomonas faecalis PA2）在生物精炼技术中从椰子残渣中共生产类胡萝卜素和氢气

《Cleaner Engineering and Technology》：Biorefinery application of Rhodopseudomonas faecalis PA2 for co-production of carotenoids and hydrogen from coconut residue

　　阿努瓦特·柴亚拉特（Anuwat Chaiyarat）|库拉塔正（Osamu Kurata）|楚瓦帕特·赛琼（Chewapat Saejung）
泰国孔敬大学理学院微生物学系，孔敬40002

**摘要**
从复杂的农业工业废弃物中生产多种高价值产品仍是生物精炼过程中的一个重大挑战。在本研究中，我们利用产类胡萝卜素的菌株Rhodopseudomonas faecalis PA2，将椰壳残渣转化为富含类胡萝卜素的生物质和氢气（H2）能源作为副产品。通过采用最佳光照策略进行重复批次培养，实现了类胡萝卜素和氢气的有效生产。连续24小时的人工光照优化了类胡萝卜素的产生，而自然光照则增强了氢气的产量。在五个连续的批次循环中，24小时光照条件下的类胡萝卜素累计产量达到了1,573毫克/升。根据五个批次的总成本（7.94美元），类胡萝卜素的单位生产成本约为12.62美元/克。在自然光照条件下，五个循环的总氢气产量为71.82毫升/升椰壳残渣滤液，单位成本计算为14.62美元/升氢气（基于五个批次的总成本0.42美元）。本研究首次报告了该菌株在类胡萝卜素（crt）和氢气（nif）共生产过程中相关基因的表达情况，为未来的菌株工程以提高生产效率提供了遗传蓝图。这表明了一种将高价值产品与能源生成相结合的成本效益生物精炼平台。

**1. 引言**
椰壳残渣是椰奶提取过程中的木质纤维素副产品，由于其数量庞大，在椰子生产国家带来了严峻的废弃物管理问题。尽管它被用作饲料添加剂（Sundu等人，2020年）、土壤肥料（Li等人，2022年）、水泥材料（Bui等人，2021年）以及椰子油生产（Che-U-Bong等人，2025年）等，但将这种丰富废弃物转化为高价值产品的需求正在不断增加。微生物生物技术为此提供了有前景的解决方案。天然类胡萝卜素和氢气（H2）是需求量巨大的微生物产物，其市场价值达数十亿美元。全球类胡萝卜素市场受到消费者对天然食品色素、膳食补充剂以及化妆品和动物饲料中功能性成分需求的推动（Li等人，2019年）。氢气作为一种清洁且可持续的能源，在电力、交通运输和建筑行业中可以作为化石燃料的替代品（Ma等人，2024年）。因此，将椰壳残渣转化为类胡萝卜素和氢气是一种从现有废弃物问题中创造额外收入的有效方法。
紫色光养细菌（PPB）因其代谢多样性和非致病性特性而被认为适用于这些生物转化（Cerruti等人，2022年）。特别是产类胡萝卜素的菌株Rhodopseudomonas faecalis PA2能够将稻草、甘蔗渣、玉米芯和棕榈壳纤维等多种木质纤维素废弃物转化为包括类胡萝卜素在内的有价值化合物（Saejung和Sanusan，2021年）。尽管椰壳残渣本身不是类胡萝卜素的天然来源，但其低氮含量使其成为氢气生产的适宜原料。这种氮限制的基质有利于固氮过程中固氮酶的活性，从而产生氢气作为副产品（Toit等人，2021年）。因此，利用R. faecalis PA2转化椰壳残渣为类胡萝卜素和氢气提供了协同生产的机遇。

尽管具有这些潜力，但仍存在一些关键知识空白。首先，从复杂废弃物基质中同时生产类胡萝卜素和氢气在生物精炼过程中仍是一个重大挑战。其次，虽然R. faecalis PA2具有产类胡萝卜素的能力，但其产氢能力尚未得到充分探索和报道。最后，目前尚不清楚该菌株中参与类胡萝卜素（crt）合成和通过固氮（nif）产生氢气的基因的表达情况，这阻碍了工艺的优化。
因此，本研究旨在开发一个利用R. faecalis PA2从椰壳残渣滤液（CRF）中同时生产类胡萝卜素和氢气的综合平台。我们假设在优化光照条件下采用重复批次培养策略可以提高这种非优化产氢菌株的共生产效率。研究结果表明了一种从废物流中有效获取富含类胡萝卜素的生物质和氢气能量的方法，并首次证明了R. faecalis PA2能够产生氢气。此外，本研究还提供了野生型R. faecalis PA2在此过程中crt和nif基因表达的基础分析，为进一步的转录调控提供了见解，以提升生产效率。这表明了一种可行且更清洁的方法，可将大量养分有限的废弃物回收为两种增值产品，符合生物循环绿色（BCG）经济原则。

**2. 材料与方法**
2.1. 使用R. faecalis PA2生产氢气的评估
R. faecalis PA2（接种浓度20%，660纳米处的光密度OD660 = 0.5）在谷氨酸-苹果酸（GM）培养基（3.8克/升谷氨酸钠、2.7克/升苹果酸、2.0克/升酵母提取物、0.5克/升磷酸氢钾、0.5克/升磷酸二氢钾、0.8克/升磷酸氢铵、0.2克/升七水合硫酸镁、0.053克/升氯化钙二水合物、1.0毫克/升烟酸、1.0毫克/升盐酸硫胺素、1.2毫克/升五水合硫酸锰、2.5毫克/升柠檬酸铁，pH 6.8）中培养7天，培养条件为无氧光照（4000勒克斯）。通过插入橡胶塞子的无菌注射器从密封培养瓶中收集气体样本。使用气相色谱（GC，Shimadzu GC-2014，日本京都）分析氢气和其他气体成分。

2.2. 与类胡萝卜素和固氮酶相关基因的引物设计与验证
2.2.1. 引物设计
在PPB中，crt基因簇参与类胡萝卜素的生物合成，而nif基因对固氮过程至关重要，间接产生氢气（Mizoguchi等人，2008年；Toit等人，2021年）。使用R. faecalis菌株JCM 11668的核苷酸序列（登录号QJTI01000004）分析了R. faecalis PA2的crtB、crtC、crtE、crtF、crtI、nifA、nifD、nifH和16S rRNA基因。利用Primer-Blast（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）工具设计合适的引物。引物设计和组装优化了PCR产物大小为150–500 bp、引物熔解温度（Tm）为60–70 °C以及引物长度为20–30 bp。所有引物均通过GENETYX版本11（日本东京Nihon Server Corporation）与R. faecalis基因序列进行比对。所有引物均由FASMAC（日本神奈川）定制合成。R. faecalis PA2的16S rRNA、crtB、crtC、crtE、crtF、crtI、nifA、nifD和nifK基因的设计引物序列及扩增结果见补充材料（表S1）。
2.2.2. 引物特异性验证
使用C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）对R. faecalis PA2的基因组DNA进行PCR扩增。基因组DNA采用简单煮沸法提取（Tahir等人，2024年）。短暂培养后（2.1节所述条件），将细菌悬液（500 μL）用高速冷冻离心机（kitman-24，日本东京Tomy Industries）以8,000 × g离心10分钟，沉淀物用双蒸水（ddH2O）洗涤两次。将细胞沉淀物重新悬浮在500 μL ddH2O中，然后在100 °C水浴中煮沸。通过离心（8,000 × g，10分钟）去除细胞碎片，收集上清液作为基因组DNA。使用Nanodrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）测定DNA的量和纯度。每个50 μL PCR反应混合物包含25 μL 2× PrimeStar Max Premix（包括DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs，Takara Bio，日本滋贺）、1 μL每种0.2 μM的正向和反向引物、22 μL ddH2O以及1 μL DNA模板（41 ng/μL）。目标基因的扩增条件为：初始变性98 °C 5分钟；随后35个循环：变性（98 °C 10秒）、退火（65 °C 5秒）和延伸（72 °C 30秒）；最后在72 °C延伸5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物大小。将5 μL PCR产物与1 μL 10× 上样染料缓冲液（Takara Bio）混合后加载到2%琼脂糖凝胶中，其中含有0.1 mg/mL溴化乙锭。使用 submarine型电泳系统（Mupid-2X， Advance，日本东京）进行电泳，并用UV凝胶成像系统（FAS-III，日本大阪Toyobo）捕捉凝胶图像。确认特定条带后，对PCR产物进行纯化和测序，并通过BLASTx分析（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）验证其为R. faecalis的类胡萝卜素和固氮酶相关蛋白。R. faecalis PA2的crt和nif基因的核苷酸序列已存入GenBank数据库，登录号分别为：crtB（PX280234）、crtC（PX280235）、crtE（PX280236）、crtF（PX280237）、crtI（PX280238）、nifA（PX280239）、nifD（PX280240）、nifH（PX280241）和nifK（PX280242）。

2.3. 准备CRF作为细菌原料
为制备CRF，将椰奶提取后的脱水椰壳在60 °C下烘干48小时（UFE600，德国Schwabach，Memmert GmbH & Co KG）。将25克脱水椰壳与1升蒸馏水混合，在磁力搅拌器中搅拌1小时。混合物通过纱布过滤两次，并调整pH至6.8。滤液（CRF）在121 °C下灭菌15分钟后用作后续实验的原料。CRF的蛋白质、总脂肪、灰分和水分含量根据Latimer（2023年）的方法测定。总碳水化合物含量按照泰国国家农产品和食品标准局（2003年）的方法进行评估。

2.4. 使用R. faecalis PA2在CRF中生产类胡萝卜素和氢气的可行性研究
首先在GM培养基中培养R. faecalis PA2 3天，调整OD660至0.5，然后将其接种到含有CRF的瓶子中。培养物在无氧光照（4000勒克斯）和室温（30 °C）条件下培养7天。为确保均匀性，每天轻轻摇晃培养物一次。每天测量细菌生物量和类胡萝卜素浓度。使用插入橡胶塞子的无菌注射器收集瓶内的气体，并用GC分析氢气和总体气体成分。此外，在第1、3、5和7天进行了初步的定性PCR，以确认与类胡萝卜素生物合成（crtE、crtI、crtC、crtB和crtF）及固氮（nifA、nifH、nifK、nifD）相关的基因表达。需要注意的是，这些基于琼脂糖凝胶的观察结果仅用于初步定性评估，不提供基因表达的定量信息。所有定量表达数据使用RT-PCR获得并进行分析（见第3.5节）。

2.5. 使用改良的Gompertz拟合模型（公式1）确定氢气积累的动力学行为：
\[Math Processing Error\]
其中H(t)表示累积氢气产量（mL H2/L CRF），Hmax表示最大氢气产量（mL H2/L CRF），R表示最大氢气生产速率（mL/L/d），λ表示延迟阶段（天）（Gadhamshetty等人，2010）。使用OriginPro 2026（OriginLab Corporation，美国北安普顿）进行非线性曲线拟合。所有参数均未经初始值约束自由估计。通过决定系数（R2）和残差模式分析评估拟合模型。

2.6. 优化R. faecalis PA2的接种龄
将R. faecalis PA2（接种浓度20% v/v，OD660 = 0.5）接种到GM培养基中并培养5、10或15天，用作细菌接种剂。每个培养后的不同龄期的细菌接种剂分别接种到含有CRF的500毫升培养瓶中，每个重复三次。每个瓶子加入400毫升CRF和20%细菌接种剂（100毫升，OD660 = 0.5），然后加盖橡胶塞子。每个塞子上连接一个无菌注射器以监测气体产生情况。培养物在室温（30 °C）下培养10天，每天轻轻摇晃一次以保持均匀性。研究细菌生长和增值产品（包括生物量、类胡萝卜素和氢气）以及COD去除情况。

2.7. 优化细菌自聚集持续时间
确定细菌自聚集的最佳时间以指导后续的重复批次实验。按照2.5节的详细描述，在CRF中培养R. faecalis PA2。培养结束后，通过将15 mL的培养液转移到无菌试管中，并在室温（30°C）下静置，来量化细菌的自聚集现象。使用紫外线-可见光分光光度计（SP-UV 300，PerkinElmer，Waltham，MA，美国）测量试管顶部悬浮液在0、2、4、6、8、10、12、18和24小时时的OD660值，此过程中不进行搅拌。作为对照，另一个装有相同培养液的试管则剧烈振荡以重新悬浮所有细胞，然后测量其OD660值。实验重复进行了三次。自聚集的百分比按照公式（2）计算（Trunk等人，2018年）。(2)[数学处理错误]其中ODstatic和ODcontrol分别代表静态培养和振荡培养的OD值。

2.7. R. faecalis PA2在不同光照条件下的批量培养中产生的类胡萝卜素和H2
由于CRF中的营养物质不平衡，初步实验表明经过多次批量培养后培养物的颜色会变淡。为了缓解这一问题，在CRF中添加了0.05%（w/v）的酵母提取物作为氮源。使用第2.5节中的最佳接种龄（10天大的菌株）进行接种。培养物被分为三组，每组暴露于不同的光照条件下：24小时光照、12小时光照/12小时黑暗循环以及自然光。每组重复三次实验。24小时光照和12小时光照/12小时黑暗循环的条件是在4000 lx的光照强度下进行的，而自然光条件则在户外培养。使用温度计和数字光强度计（AS803，Smart Sensor Holding，东莞，中国）分别记录自然光处理的温度和光照强度。每个批次结束后（10天），让培养物在室温（30°C）下静置，以进行自聚集，持续时间如第2.6节所述（24小时）。随后，从反应器中移除80%的培养基，并替换为新鲜的CRF。剩余的细菌细胞用于后续的批次循环。该过程连续进行了五个周期。在每个批次结束时收集样品，以测定生物量、类胡萝卜素含量和COD去除率。每日检测累积H2产量，并在每个批次的第5天分析基因表达（crt、nif和16S rRNA基因）。根据16S rRNA基因拷贝数与用6-羧基荧光素二乙酸酯染色的活细胞数量之间的相关性，量化R. faecalis PA2的存活率（Dojindo Laboratories，Kumamoto，日本），并使用BX60荧光显微镜（Olympus Corporation，东京，日本）进行可视化观察。

2.8. 基因表达分析
将细菌培养液（500 μL）在4°C下使用高速冷冻微量离心机（kitman-24，Tomy Industries，东京，日本）以11,000 × g离心5分钟。将细胞沉淀重悬在1 mL的ISOGEN试剂（Nippon Gene，东京，日本）中，然后加入0.2 mL的氯仿，再次离心15分钟。从水相中分离RNA，用0.5 mL的异丙醇沉淀，然后离心10分钟。得到的RNA沉淀用1 mL的70%乙醇洗涤，离心后风干，并重新悬浮在10 μL的ddH2O中。使用Thermo Fisher Nanodrop Lite分光光度计测定提取的RNA量。cDNA合成使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和gDNA Remover（Toyobo，大阪，日本）进行。首先，将RNA溶液（31–490 ng/μL）在干燥块浴加热器（CTU-Neo，TAITEC Corporation，Saitama，日本）中于65°C加热5分钟使变性。然后将此变性RNA（2 μL）与4 μL的4× DN Master Mix和10 μL的ddH2O混合。在37°C初始孵育5分钟后，加入4 μL的5× RT Master Mix II（含有RNase抑制剂、dNTPs和逆转录酶的逆转录溶液）。混合物依次在37°C孵育15分钟、50°C孵育5分钟和98°C孵育5分钟，使用热循环仪进行孵育。通过PCR和凝胶电泳分析合成的cDNA产物及基因表达。

基因表达的定量使用定量PCR（qPCR）（Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System，Thermo Fisher Scientific，MA，美国）进行。使用含有目标基因的质粒DNA生成标准曲线。质粒构建包括PCR扩增产物的纯化、连接、转化和质粒纯化，按照制造商的协议进行。使用PCR clean-up和gel extraction kit（NucleoSpin，Macherey-Nagel，Düren，德国）纯化目标基因的PCR扩增产物。具有A-overhang的纯化PCR产物使用pGEM?-T Easy Vector System I（Promega，Madison，WI，美国）连接至pGEM?-T Easy Vector中，同样按照制造商的协议进行。连接反应混合物（总体积10 μL）包括1.5 μL的无核酸酶水、5 μL的2× Rapid Ligation Buffer、0.5 μL的pGEM?-T Easy Vector（50 ng/μL）、1 μL的T4 DNA ligase和2 μL的纯化PCR产物（21-111 ng/μL）。轻轻涡旋混合物并在室温（25-28°C）下孵育1小时。使用热休克方法将重组质粒转化到大肠杆菌ECOS JM109感受态细胞（Promega，Madison，WI，美国）中。细胞在冰上孵育5分钟，然后在42°C下进行45秒的热休克处理，立即放回冰上，随后涂布在含有氨苄西林（50 μg/mL）的LB琼脂平板上筛选阳性克隆。阳性克隆在添加了氨苄西林的LB培养基中培养，使用NucleoSpin Plasmid EasyPure Kit（Macherey-Nagel，Düren，德国）提取和纯化重组质粒。使用Nanodrop Lite分光光度计测定质粒DNA的浓度和纯度。构建标准曲线时使用了从10到10^8拷贝/实验的10倍稀释系列的质粒DNA。qPCR检测使用KOD SYBR qPCR Mix kit（Toyobo，大阪，日本）进行。每20 μL的反应混合物包含10 μL的KOD SYBR qPCR Mix、0.4 μL的10 μM正向和反向引物、8.2 μL的ddH2O和1 μL的cDNA模板。qPCR的热循环条件如下：预变性在98°C下2分钟；接着是40个循环的变性（98°C下10秒）、退火（60°C下10秒）和延伸（68°C下30秒）。通过熔解曲线分析确认成功扩增。基因表达的定量使用生成的标准曲线进行。为了考虑样本间的差异，将目标基因拷贝数归一化到作为内部控制的16S rRNA基因的拷贝数。

2.9. 分析方法
使用台式低速离心机（Cence L600，UGAIYA Bio-Sciences，大阪，日本）以5120 × g离心培养液10分钟，以分离细胞沉淀和上清液。细胞沉淀用0.85%（w/v）的NaCl洗涤两次，通过建立细菌细胞干重与OD660之间的标准曲线来确定生物量浓度。为了测定类胡萝卜素浓度，使用甲醇-丙酮（2:3 v/v）溶液提取洗涤后的细胞沉淀中的色素。重复提取过程，直到获得无色的细胞沉淀。类胡萝卜素色素使用紫外线-可见光分光光度计在480和770 nm处读取吸光度。COD浓度通过封闭回流法测定。简要来说，上清液在DRB200加热块（Hach公司，Loveland，CO，美国）中加热150分钟，然后在600 nm处测量吸光度，并按照Bhuvanendran等人（2024年）的方法进行计算。H2和气体成分使用配备热 conductivity detector（TCD）和内径为1.0 mm的2.0 m不锈钢填充柱Unibeads C的GC进行分析。注射体积为0.5 mL。使用氩气作为载气，流速为25 mL/min。GC烤箱、进样器和TCD的温度分别保持在130、180和180°C。累积H2体积（Vi）使用公式（3）计算（Kadier等人，2015年）：
(Vi = (Vt + Vh) × Xi)
其中Vt表示测量的气体体积（mL），Vh是瓶子的顶空体积（mL），Xi是由GC系统确定的H2百分含量（%）。

2.10. 统计分析
统计分析使用IBM SPSS Statistics软件版本28.0.0.0（Armonk，NY，美国）进行。使用单因素方差分析（ANOVA）评估均值之间的差异，随后进行Duncan的多范围检验进行事后比较。统计显著性设定为p < 0.05。

3. 结果与讨论
3.1. R. faecalis PA2产生的H2以及与类胡萝卜素和氮酶相关基因的引物特异性
GC分析显示，在合成培养基中培养的R. faecalis PA2产生的气体主要由H2和N2组成（补充材料图S1）。气体组成中低水平或缺失的CO2表明温室气体排放减少，这直接符合可持续发展目标（SDG）13（气候行动），并强调了这一生物过程的环保性。此外，极低的CO2污染有助于提高净化效率（Ma等人，2024年）。累积H2在24小时内达到4.34 mL H2/L CRF的峰值后趋于稳定，表明R. faecalis PA2中的H2产生是一个早期代谢活动（补充材料图S1），之后代谢转变为停止H2产生。由于R. faecalis PA2是一种产类胡萝卜素的菌株，其代谢途径转向类胡萝卜素的合成。
图1a显示了凝胶电泳图像，其中明显的条带表明引物的特异性很高。BLASTx分析验证从R. faecalis PA2扩增的序列对应于crt和nif基因。预期存在crt基因，因为R. faecalis PA2产生番茄红素（Saejung等人，2023年）。图1b显示了与类胡萝卜素和番茄红素生物合成相关的crtB、crtC、crtE和crtI基因的功能概述。PPB通过甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径产生异戊烯基焦磷酸（IPP）（Wu等人，2021年）。几个IPP分子经过连续的缩合反应产生法尼基焦磷酸，然后通过geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP）合成酶（CrtE）的作用与一个IPP分子结合生成GGPP（Kato等人，2016年）。随后，两个GGPP分子被phytoene合成酶（CrtB）催化生成phytoene，进一步用作其他类胡萝卜素合成的前体（Li等人，2019年）。在R. faecalis中，phytoene通过phytoene脱饱和酶（CrtI）进行多次脱饱和反应，生成番茄红素（Takaichi，2009年）。R. faecalis PA2中存在crtI与Saejung等人（2023年）的发现一致，他们报告该菌株含有番茄红素，这是CrtC合成rhodopin和CrtF合成spirilloxanthin的关键中间体（Giraud等人，2018年）。

图1a显示了凝胶电泳图像，其中不同的条带表明引物的高特异性。BLASTx分析验证从R. faecalis PA2扩增的序列对应于crt和nif基因。存在crt基因是合理的，因为R. faecalis PA2产生番茄红素（Saejung等人，2023年）。图1b概述了与类胡萝卜素和番茄红素生物合成相关的crtB、crtC、crtE和crtI基因的功能。PPB利用甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径产生异戊烯基焦磷酸（IPP）（Wu等人，2021年）。几个IPP分子经过连续的缩合反应产生法尼基焦磷酸，然后通过geranylgeranyl pyrophosphate（GGPP）合成酶（CrtE）与一个IPP分子结合生成GGPP（Kato等人，2016年）。随后，两个GGPP分子被phytoene合成酶（CrtB）催化生成phytoene，进一步用作其他类胡萝卜素合成的前体（Li等人，2019年）。在R. faecalis中，phytoene经过phytoene脱饱和酶（CrtI）的多次脱饱和反应生成番茄红素（Takaichi，2009年）。R. faecalis PA2中存在crtI与Saejung等人（2023年）的发现一致，他们报告该菌株含有番茄红素，这是CrtC合成rhodopin和CrtF合成spirilloxanthin的关键中间体（Giraud等人，2018年）。

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图1. 显示Rhodopseudomonas faecalis PA2的crt、nif和16S rRNA基因的PCR扩增条带的琼脂糖凝胶电泳图像，以及与类胡萝卜素生物合成和H2生产相关的特定基因的示意图。(a) 琼脂糖凝胶电泳图像。泳道1–5：crtB、crtC、crtE、crtF和crtI。泳道6-9：nifA、nifD、nifH和nifK。泳道10：16S rRNA。(a) 与类胡萝卜素相关的基因和(b) H2。PPB产生的H2是由氮酶在固氮过程中催化的必需产物（Toit等人，2021年），这得益于大气中N2的丰富。图1c显示了nifA、nifD、nifH和nifK与H2产生之间的关系。ATP和质子与ferredoxin共同通过氮酶产生H2（McKinlay和Harwood，2010年）。该酶系统由Nif特异性调节蛋白（NifA）调控，包括dinitrogenase还原酶（NifH）、dinitrogenase α亚单位（NifD）和dinitrogenase β亚单位（NifK）。NifH催化电子转移到NifD和NifK，将其还原为氨，生成H2，如方程（4）所示（McKinlay和Harwood，2010年；Toit等人，2021年）：
(4) N2 + 8H+ + 8e- + 16 ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP

3.2. 在CRF中R. faecalis PA2生产类胡萝卜素和H2的可行性研究
CRF的近似成分见表1。CRF中较低的蛋白质含量表明氮基底物有限，这有利于氢气（H2）的产生。如图2a所示，生长模式与分相生长行为一致，这可能是由于CRF的复杂组成所致，其中包含了碳水化合物、脂质和蛋白质的混合物（表1）。该菌株可能会利用最优选的碳源（可能是一种简单的碳水化合物）。当主要碳源耗尽时，生长会暂时停止。这个短暂的迟滞阶段发生在菌株通过合成利用次要碳源所需的特定酶时。随后，当这些酶充分产生后，生长会增加，从而完成双相生长曲线。这些碳源还促进了类胡萝卜素和H2的生成（图2b和c）。改良的Gompertz模型与实验中的H2积累模式高度吻合（R2 = 0.92），得出的动力学参数为Hmax = 2.46 mL H2/L CRF，R = 6.15 mL/L/天，λ = 0.133天（图2c）。模型预测的Hmax值与实际观察到的累积产量（2.44 mL H2/L CRF）非常接近，证实了该模型的可靠性。与平均日产量（0.35 mL/L/天）相比，瞬时产量的显著增高反映了类似分相生长的代谢转变（图2a）。H2在总气体中的比例低于使用合成培养基时的比例（补充材料图S2）。这种降低与CRF中缺乏或减少了氮酶辅因子有关。氮酶含有一个金属辅因子活性位点，主要是铁（Fe）；金属的可用性可以调节氮酶的表达（Rashid等人，2024年）。合成培养基中包含了铁，但CRF中的铁浓度可能较低。

表1. 椰子残渣滤液的大致成分
| 成分 | 含量（%） |
|------------|------------|
| 灰分 | 0.92 ± 0.01 |
| 水分 | 53.72 ± 0.23 |
| 蛋白质 | 2.75 ± 0.00 |
| 总碳水化合物 | 29.06 ± 0.28 |
| 总脂肪 | 13.55 ± 0.00 |
数据以平均值±标准差表示（n = 3）。

图2. 在椰子残渣滤液中Rodopseudomonas faecalis PA2生产类胡萝卜素和H2的可行性研究（n = 3）。(a) 生物量浓度，(b) 类胡萝卜素浓度，以及(c) 用改良Gompertz模型拟合的累积H2生产量。培养条件：无氧光照（4000 lx）和30°C，持续7天。

图3a–i展示了通过琼脂糖凝胶电泳初步评估的crt和nif基因的定量表达情况，以确定这些基因的开启/关闭状态。在参与类胡萝卜素生产的基因中，crtE在所有研究时间段内都能被持续检测到（图3a），表明形成了类胡萝卜素合成的关键前体GGPP。crtI的转录仅在孵育的第5天和第7天被检测到。crtC的转录较弱，而crtB和crtF的转录在这些条件下未被观察到（图3b–e），这表明该代谢途径可能受到转录后调控的影响或受到CRF中环境因素的干扰，导致转录活性受限（Stanley和Yuan，2019年）。因此，需要进一步的遗传修饰或添加额外的营养物质来优化在这种营养有限的基质中的转录水平。

图3. 通过琼脂糖凝胶电泳确认的crt和nif基因的定量表达，以确定Rodopseudomonas faecalis PA2在椰子残渣滤液中的开启/关闭状态。(a) crtE，(b) crtI，(c) crtC，(d) crtB，(e) crtF，(f) nifA，(g) nifK，(h) nifH，(i) nifD。M条为100 bp DNA分子标记。培养条件：无氧光照（4000 lx）和30°C，持续7天。

在CRF培养条件下，R. faecalis PA2表现出nifA调节基因以及结构基因nifH和nifK的转录（图3f–h），表明氮酶调节系统被激活。相反，nifD的转录未被检测到（图3i），这可能是由于转录水平或转录后水平的复杂调控机制，特别是由非编码RNA介导的转录后调控（Han等人，2022年）。例如，非编码RNA NfiR的缺陷可能会影响nifD mRNA的稳定性，导致其快速降解（Zhan等人，2019年）。这种降解使得nifD的转录水平低于凝胶电泳的检测限。编码钼铁（MoFe）蛋白α亚基的nifD表达的缺失影响了酶复合物的组装，从而减少了H2的产生。

3.3. 优化接种龄
10天龄的接种液导致了最高的细菌生长（p < 0.05）（图4a）。这一时期正好是从指数生长期晚期过渡到稳定生长期的初期。随着细胞进入稳定期，它们会停止快速增殖，并将资源重新分配用于应对营养限制和有毒代谢物质，从而积累保护性酶和细胞内资源（Molina等人，2019年）。这些酶参与初级代谢以及次级代谢途径和应激缓解。因此，这种接种龄的菌群对环境压力具有高度抵抗力，代谢适应性强，比其他处理的菌群更具竞争力。此外，它还激活了稳定期的启动子，这些启动子在稳定期活跃但在指数期不活跃（Jaishankar和Srivastava，2017年）。相比之下，5天龄的接种液由处于指数中期阶段的细胞组成，这些细胞仍在积极进行分裂，导致新细胞在生理上更为脆弱。

图4. 优化Rodopseudomonas faecalis PA2在椰子残渣滤液中的接种龄和自聚集持续时间。接种龄对(a)生物量浓度，(b)类胡萝卜素浓度，(c)累积H2产量，以及(d)化学需氧量（COD）去除的影响。(e)随时间变化的细菌自聚集百分比，以及(f)静置24小时后静态(S)和涡旋(V)培养的视觉比较。箱形区域表示自聚集的细胞。培养条件：无氧光照（4000 lx）和30°C，持续10天。条形上方不同的大写字母（A和B）表示基于Duncan多重范围检验（n = 3）各处理组之间存在显著差异（p < 0.05）。

在所有测试的接种龄中，类胡萝卜素含量没有显著差异（p ≥ 0.05）（图4b），而累积H2产量有显著差异（p < 0.05），其中10天龄接种液处理的产量最高（图4c）。与未经优化的条件（第3.2节）相比，累积H2产量增加了四倍，这证实了接种龄是一个关键因素。然而，H2仅在生产初期产生，可能是由于N2还原过程受到抑制。氮酶介导的N2还原涉及其辅因子上电子和质子的积累，通过还原消除反应生成H2（Harris等人，2018年）。环境中的H2水平升高会通过与辅因子结合而非N2来竞争性地抑制酶的活性，从而终止H2的产生。

10天龄接种液处理下COD去除量增加（图4d），因为CRF中的氮限制激活了饥饿诱导的启动子，从而诱导了相关酶的生成（Tunner等人，1992年）。低氮水平增强了参与碳同化的酶活性，以补偿基质中氮的缺乏，从而提高了生物降解速率（Sanz-Lázaro等人，2021年）。

3.4. 优化自聚集持续时间
自聚集是一种细菌自我结合的现象，这使得在连续批次培养前更容易将细菌细胞从基质中分离出来（Trunk等人，2018年）。如图4e所示，R. faecalis PA2的自聚集随时间增加，并在18至24小时时稳定在约71%的自聚集程度。在这个沉降期间，可以观察到明显的细胞凝块（图4f）。在自聚集过程中，细菌产生胞外多糖（EPS），这些EPS覆盖在细胞表面。带正电的EPS可以中和细胞表面的负电荷，从而改变其理化性质并增加疏水性。增强的疏水性降低了细胞间的能量障碍，促进了细胞间的相互作用，导致细胞聚集（Xie等人，2016年）。选择24小时的沉降时间用于后续实验。

3.5. 在不同光照条件下Rodopseudomonas faecalis PA2在重复批次培养中的类胡萝卜素和H2产量
在自然光条件下户外孵育期间，温度和光照强度的波动见补充材料（图S3）。考虑到光照条件，在24小时光照下产生的细菌生物量高于12小时光照/12小时黑暗周期下的生物量，尽管光照强度相同（图5a），因为在24小时光照处理期间细菌持续进行无氧光合作用。光被用于ATP和还原力（如NADH）的合成，这些直接用于将碳固定为新生物量（Berg等人，2019年）。第二和第三批次的生物量显著增加归因于第一批接种液在代谢上适应了CRF的成分，通过合成特定酶来增强其种群。相比之下，第二和第三批次由完全适应的细胞组成；这些细菌表现出活性。此外，将第一批接种液转移到第二和第三批次中也减少了迟滞阶段，促进了快速的指数生长（Cesar等人，2022年）。第四和第五批次的生物量下降被认为是由于在指数生长和稳定期之间反复转换过程中积累了氧化应激或代谢失衡（Godoy等人，2024年）。12小时光照/12小时黑暗周期导致细胞停止活动或转向效率较低的代谢途径，从而降低了整体生物量（Kato等人，2019年）。自然光条件下的光照强度波动导致光转化效率降低，光抑制效应增加了，使得生物量低于24小时光照条件下的生物量（Sun等人，2025年）。

图5. 在不同光照条件下Rodopseudomonas faecalis PA2在椰子残渣滤液中的重复批次培养。(a)生物量浓度，(b)类胡萝卜素浓度，(c)累积H2产量，以及(d)化学需氧量（COD）去除量。孵育时间为每批次10天。条形上方不同的大写字母（A-E）表示基于Duncan多重范围检验（n = 3）各处理组之间存在显著差异（p < 0.05）。至少共享一个共同字母的平均值之间没有显著差异。

类胡萝卜素的浓度趋势与生物量相似（图5b）。PPB表现出适应性机制，通过减小天线大小和光吸收数量以及减少光捕获复合体（LHCs）来减轻过强的光照强度，从而在自然光条件下减少了类胡萝卜素的产生（Cerruti等人，2022年）。本研究获得的类胡萝卜素产量为397 mg/L，与R. palustris在30天条件下的产量（232 mg/L）（Reaksputi等人，2019年）以及Rhodobacter sphaeroides在合成培养基中1.5天条件下的产量（11.54 mg/L）（Nie等人，2016年）相当。批次2-4之间的累积H2产量相似（p ≥ 0.05）（图5c）。尽管生物量浓度较低，自然光条件下的处理产生了最高的累积H2产量，这归因于在高光照强度和氮限制下的代谢转变。在这些条件下，细菌将代谢资源从生长转向氮固定，产生H2作为副产品。氮固定需要大量的能量，导致生物量产出减少（Lewis等人，2023年）。与未经优化的实验（第3.2节）相比，在自然光条件下的重复批次培养中H2产量增加了七倍，连续三批次的产量达到了17.62 mL H2/L CRF。这一发现与先前的研究结果一致，即补充新鲜培养基可以提高氢气产量（Melnicki等人，2008年）。我们的读数高于R. palustris MP3（10.7 mL H2/L培养基）和Rhodopseudomonas harwoodiae SP6（10 mL H2/L培养基）在人工光条件下培养的产量（Kanwal等人，2023年）。然而，我们基于废弃物的工艺产生的H2产量低于在理想合成条件下生长的产氢菌株R. faecalis RLD-53的产量，这突显了优化培养基或基因调节的必要性（Liu等人，2011年）。值得注意的是，尽管生物量、类胡萝卜素和H2产量有显著变化（图5d），但COD去除效率在光照条件之间和五个重复批次之间没有显著差异（p ≥ 0.05）。这表明有机物的降解和特定的代谢途径是功能上独立的进程。批次系统可能是受底物限制的，而不是受光照能量限制的。当R. faecalis PA2消耗完底物中的可生物降解化合物时，无论光照是否充足（Capson-Tojo等人，2020年），COD的去除率都会停止。此外，在有黑暗阶段的条件下（12小时光照/12小时黑暗周期和夜间自然光），COD的去除率也不会停止。在没有光照的情况下，测试菌株从光异养型转变为化能异养型（H?dicke等人，2011年），通过黑暗发酵或厌氧呼吸代谢底物中的有机化合物，从而即使在间歇性光照下也能持续去除COD。图6显示了crtB、crtC、crtE、crtF、crtI、nifA和nifK的相对基因表达。在自然光下培养的细菌在第3-5批次中表现出最高的crt基因表达。这是因为自然日光下的光照强度大约是其他条件的10倍（补充材料图S3）。类胡萝卜素作为一种光保护机制，在暴露于过量光照时通过清除活性氧来增加crt基因的表达（Xu等人，2018年）。然而，类胡萝卜素在强光下不稳定，会导致异构化和氧化，从而减少细菌细胞中的类胡萝卜素积累（图5b；Xu等人，2018年）。总体而言，24小时光照下的crt基因表达高于12小时光照/12小时黑暗周期下的表达。这归因于较长的光周期促进了某些类胡萝卜素生成基因的上调（Ma等人，2019年）。

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图6. 在不同光照条件（24小时光照、12小时光照/12小时黑暗和自然光）下，Rhodopseudomonas faecalis PA2在椰子残渣滤液中的crt和nif基因的相对表达。每个批次的培养时间为10天。在第5天分析基因表达（n = 3）。对于相对的nif表达，基于定性表达研究了nifA和nifK（图3f和g）。在自然光条件下观察到最高的nif基因表达水平（图6）。在自然光下，白天的强光强度提供了足够的光子来驱动固氮作用。尽管过量光照通常会导致细胞损伤并抑制色素的产生，但自然光周期包括一个黑暗阶段，使细胞能够从光异养型转变为化能异养型（Capson-Tojo等人，2020年）。这种转变降低了光抑制的风险。

通过16S rRNA基因拷贝数与荧光显微镜下活细胞计数之间的相关性来评估R. faecalis PA2在CRF中的存活能力；活细胞呈现绿色（图7a）。12小时光照/12小时黑暗周期产生的细胞存活率最高，这归因于多种生理和代谢因素（图7b）。与24小时光照条件相比，12小时光照/12小时黑暗周期有效地调节了测试细菌的昼夜节律，因为它模拟了自然光周期，优化了生长（光照阶段）和修复（黑暗阶段）之间的能量分配，增强了细胞的韧性。在黑暗阶段，细胞抑制DNA复制，部分细菌群体裂解，释放营养物质。随后的光照阶段使存活的细胞恢复并重新生长（Tinguely等人，2023年）。此外，黑暗阶段有助于底物的储存，提高了缺光条件下的存活率（Tanaka等人，2023年）。同样，暴露于12小时光照/12小时黑暗周期的活细胞浓度高于暴露于自然光条件下的活细胞浓度，因为不可预测的光照强度和持续时间会导致间歇性压力，从而降低细菌存活率。此外，在自然光条件下，细菌细胞将能量和资源分配到固氮作用上，而减少了用于细胞生长和分裂的能量（Lewis等人，2023年）。这种能量权衡增加了H2的产生，但降低了细胞存活率。

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图7. 在不同光照条件（24小时光照、12小时光照/12小时黑暗和自然光）下，Rhodopseudomonas faecalis PA2在椰子残渣滤液中的活细胞和浓度。（a）在荧光显微镜下观察到的活细胞；（b）活细胞浓度。每个批次的培养时间为10天。条形图上方不同的字母（A-D）表示处理之间的显著差异（p < 0.05），基于Duncan的多范围检验（n = 3）。至少共享一个共同字母的均值没有显著差异。

3.6. 未来展望与实施
CRF可以用作原料，使用R. faecalis PA2生产高价值的类胡萝卜素和H2能源。重复批次培养表明，大约三到四个周期后需要从新鲜菌种重新启动培养，以保持一致性并最小化接种物老化的效应。在重复批次培养中，24小时人工光优化了生物量和类胡萝卜素的产生，而自然光则支持H2的产生增加。表2展示了使用不同光照策略的批次培养和重复批次培养的成本。自然光条件最为经济，与24小时光照条件相比，批次培养的成本降低了七倍，重复批次培养的成本降低了十九倍。在24小时光照下连续五次重复批次周期累计产生的类胡萝卜素量为1,573毫克/升。这一产量相当于类胡萝卜素的单位生产成本约为12.62美元/克（基于五批次成本7.94美元）。在自然光下五个周期的总H2产量为71.82毫升H2/升CRF，单位成本计算为14.62美元/升H2，五批次成本为0.42美元（表3）。此外，使用改进的Gompertz模型计算出的模型值与观察结果非常吻合，证实了其潜在的放大可行性。这些发现可以通过在封闭生物反应器中使用连续人工光来最大化类胡萝卜素产量，并使用暴露于自然光的户外生物反应器来生产可持续的H2。使用阳光生产H2相对于电解可以减少能源需求和碳足迹，这是大规模经济可行的前提（Capson-Tojo等人，2020年）。此外，这些发现也可以应用于双相生物反应器，在第一阶段使用自然光诱导H2产生，然后切换到24小时人工光以最大化富含类胡萝卜素的生物量。

表2. 在不同光照条件下，Rhodopseudomonas faecalis PA2在添加酵母提取物的椰子残渣滤液中的批次培养和重复批次培养的估计成本
- 项目 成本/批次（美元）? 成本/五批次（美元）??
- 24小时光照 0.03 0.03 0.03 0.15 0.15 0.15
- 12小时光照/12小时黑暗周期 0.03 0.03 0.15 0.15 0.15
- 自然光 0.01 0.01 0.07 0.07 0.07
- 接种物培养 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
- 电力 1.5 0.75 0.75 23.76
- 总成本 1.74 0.99 0.24 7.94 4.18 0.42

?成本计算基于单批次，包括接种物培养成本。
??接种物培养成本仅适用于第一批次，在第二至第五批次中不包括。

表3. 在不同光照条件下，Rhodopseudomonas faecalis PA2在连续五批次培养中生产的类胡萝卜素和H2的成本和产量
- 光照条件 五批次成本（美元） 类胡萝卜素（5批次） H2（5批次）
- 类胡萝卜素浓度（毫克/升） 类胡萝卜素（毫克/5批次） 单位生产成本（美元/克） 累计H2（毫升H2/升CRF） H2（毫升/5批次） 单位生产成本（美元/升）
- 24小时光照 7.94 1,573 62 9.2 12.62 62.9
- 12小时光照/12小时黑暗周期 4.18 1,173 46 9.2 8.9 15.1 12.8
- 自然光 0.42 1,07 34 29.2 0.9 71.8 28.7

除了作为常规饲料添加剂外，使用R. faecalis PA2将椰子残渣转化为高价值产品为增加椰子残渣的价值提供了另一种策略。2024年，全球饲料级椰子残渣市场的价值为3.7亿美元（QYResearch，2025年）。相比之下，预计类胡萝卜素和H2的价值将从2024年的16.9亿美元和18.437亿美元分别增长到2031年的21.14亿美元和20.684亿美元（QYResearch，2025年）。这些信息突显了传统饲料增值与本研究中提出的增值产品之间的巨大经济差距，为产椰国家创造了更高的利润机会，并减少了对低利润率饲料市场的依赖。这种方法符合BCG经济原则以及SDG 7（负担得起和清洁能源）。然而，这项研究存在局限性；它没有研究在人工光下增强类胡萝卜素合成基因的光响应途径，也没有研究在自然光下优化H2生成酶活性的方法。需要确定合适的基因干预措施来提高这两种产品的产量并增强所有相关基因的表达水平。

4. 结论
本研究解决了在现代生物精炼厂中从复杂的农业工业废弃物中同时生产类胡萝卜素和H2的重大挑战。我们首次证明了R. faecalis PA2能够生产这两种高价值产品。重复批次培养结合最佳光照策略有效地共同生产了富含类胡萝卜素的生物量和氢气。具体来说，24小时人工光最大化了生物量和类胡萝卜素的产量，而自然光显著促进了H2的产生。三到四个周期的培养时间产生的产量与文献中报道的单产系统相当，强调了其经济可行性。此外，我们对这一过程中crt和nif基因表达的基础分析为菌株工程提供了遗传蓝图，以进一步提高生产力。因此，这项研究为丰富且营养有限的废弃物的增值提供了一个综合平台，有助于推进可持续和循环型生物经济的发展。

Chewapat Saejung的作者贡献声明：
- 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资源，方法学，资金获取，形式分析，概念化
Anuwat Chaiyarat：
- 撰写 – 原稿，方法学，调查，形式分析
Osamu Kurata：
- 撰写 – 审稿与编辑，资源，方法学，形式分析