基于分离技术的超高效液相色谱-二极管阵列检测（UHPLC-DAD）方法验证以及对Rheum webbianum中多酚多样性的多区域化学计量学分析

《ACS Omega》：Isolation-Driven UHPLC-DAD Method Validation and Multi-Regional Chemometric Profiling of Polyphenol Diversity in Rheum webbianum

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在这项研究中，首次从 Rheum webbianum 植物中分离出了六种重要的多酚。通过核磁共振（NMR）和液相色谱-电喷雾离子化-质谱（LC-ESI-MS）分析了它们的结构。研究的目的是考察这些化合物在不同地点采集的植物根部的含量变化情况。由于它们的浓度会随着海拔和当地环境条件而变化，因此需要一种清晰可靠的分析方法。我们开发了一种简单的 RP-C18 超高效液相色谱方法，该方法结合了二极管阵列检测器（UPLC-DAD），使用含有 0.1% 甲酸的乙腈-水流动相，并在 254 nm 处进行检测。该方法已经根据 ICH 指南进行了验证。这项工作是首批使用定量分析和化学计量工具比较这六种化合物在不同地点差异的研究之一。结果显示，某些标志化合物在不同区域之间存在显著差异，而有些化合物则相对稳定。这是首次记录 Ladakh 地区 R. webbianum 的化学多样性。所开发的方法表现出良好的线性、精确度和回收率。总体而言，这项研究突显了 R. webbianum 在不同地点的化学多样性，并为其质量控制和未来研究提供了可靠的方法。

### 引言
印度以其丰富的环境多样性而闻名，这种生态多样性往往导致植物中的化学多样性也非常显著。(1) 许多研究表明，植物可以改变其化学组成以响应环境压力。诸如海拔、温度、土壤成分和紫外线暴露等环境条件会显著影响植物次生代谢产物的生物合成，特别是酚类化合物和黄酮类化合物。(2,14) 虽然不可能监测植物中存在的每一种化合物，但我们可以了解主要生物活性化合物如何随环境条件变化。(2) 这对于质量控制、药理学评估和药用植物的保护非常重要。为了研究这种化学变化，需要一种可靠、简单且经过验证的分析方法。

Rheum webbianum（RW），通常被称为印度大黄，是一种重要的抗炎草药，在拉达克、西藏和中医中用于治疗炎症、消化系统疾病、便秘和疼痛相关疾病。(3) 尽管它在民族医学中具有重要意义，但由于地形复杂和气候恶劣，尤其是在拉达克地区生长的印度品种仍然基本未被探索。有趣的是，这种植物分布于拉达克的多个地区，但关于其植物化学成分和药用价值的报道却很少。(4) 相比之下，在西藏和中国发现的相关 Rheum 物种，如 Rheum australe 和 Rheum moorcroftianum，已经对其植物化学成分和生物活性进行了研究，这突显了研究印度变种的必要性。(5) Rheum 物种面临越来越多的威胁，印度政府 Ayush 部门、IUCN、WWF 和 UNEP 等机构已将其列入濒危植物名单。

在这项研究中，我们对从拉达克 11 个不同地区采集的 R. webbianum 进行了详细的化学分析。首次使用制备型高效液相色谱（HPLC）从RW中分离出了六种主要多酚——physcion、kaempferol、noreugenin、emodin、quercitrin 和 chrysophanol。这些化合物主要属于黄酮类和蒽醌类，具有抗炎、抗氧化、保肝、通便和抗菌作用。(6?8) 醇类化合物和蒽醌类是药用植物中广泛分布的次生代谢产物，越来越受到药理潜力和治疗相关性的认可。(15) 为了准确量化这些化合物并研究它们在不同地点的变化情况，需要开发一种简单且可靠的 RP-C18 超高效液相色谱结合二极管阵列检测器（UHPLC-DAD）方法。尽管已经有许多经过验证的 HPLC-DAD/光二极管阵列（PDA）方法用于多酚化合物的分离和定量，但许多方法采用复杂的流动相系统、扩展的梯度程序或多种有机溶剂。例如，Sharma 等人开发了一种用于 Syzygium jambos 多酚分析的 HPLC-DAD 方法，使用包含乙腈、乙酸和甲醇的三元流动相，并通过多步梯度实现充分的分离。(9) 在另一项经过验证的多酚方法中，Bruguiera gymnorrhiza 的叶提取物使用混合乙腈-乙酸-甲醇流动相进行分析，梯度在 30 分钟内达到 100% 有机溶剂。(10) 同样，Schinus terebinthifolius 中六种多酚的同时测定需要长达 60 分钟的梯度，以达到 100% 有机溶剂才能分辨结构相关的多酚。(11) 对多酚 HPLC 方法的回顾表明，传统方法通常依赖于缓慢的溶剂梯度（45–80 分钟）和混合有机溶剂系统。(12,13) 最近的色谱研究也强调了在复杂植物基质中快速、高分辨率多酚分析方法的日益需求。(16,17) 相比之下，目前的 RP-C18 UPLC-DAD 方法使用简单的二元流动相，缩短了运行时间，并进行了系统的稳健性测试，同时保持了满意的分辨率并符合 ICH 验证要求。此外，使用水中的 0.1% 甲酸作为水相，使该方法可以直接与 LC-质谱（LC-MS）分析兼容，无需额外的改性剂。

利用这种经过验证的方法，并结合主成分分析（PCA）、层次聚类分析（HCA）和正交偏最小二乘-层次判别分析（OPLS-HDA）等化学计量工具，我们评估了这些化合物在不同地理位置的变化情况。令人惊讶的是，即使是在 70–80 公里范围内的样本中，某些标志化合物也显示出显著差异，而其他化合物则相对稳定。这一观察结果支持了先前的研究，即环境条件强烈影响植物中酚类代谢产物的分布。(2,14,15) 总体而言，这项工作填补了关于印度 R. webbianum 的科学数据空白，首次报道了从该植物中分离出六种重要多酚，建立了一种可靠的 UPLC-DAD 方法进行定量，并强调了环境和地理因素如何影响植物的化学特性。这些发现对于未来的研究、质量控制以及这种重要药用植物的民族药理学推广具有重要意义。

### 材料与方法
植物材料在印度查谟和克什米尔地区的斯利那加克什米尔大学生物多样性与分类中心 KASH 香草标本馆收集和鉴定。采样地点的地理位置（包括纬度、经度和海拔）见表 1。

#### 表 1. 拉达克跨喜马拉雅地区及邻近地区 R. webbianum 采集点的地理坐标（纬度和经度）和海拔
| 地点 | 纬度（°N） | 经度（°E） | 海拔（m a.s.l.） |
|------------|------------|-----------|----------------------|
| Sapi La Pass | 34.58 | 76.11 | 4397 |
| Matyen, Drass | 34.37 | 75.73 | 3173 |
| Drass | 34.43 | 75.75 | 3540 |
| Batalik | 34.46 | 76.15 | 3073 |
| Hundurman Brog | 34.32 | 76.12 | 3210 |
| Nubra Valley | 34.86 | 77.57 | 3100 |
| Panikhar, Kargil | 33.95 | 76.18 | 3420 |
| Parkachik | 34.06 | 76.13 | 2940 |
| Sanku, Kargil | 34.44 | 76.17 | 3080 |
| Shang Leh, Ladakh | 34.73 | 77.79 | 3500 |
| Overa, Pahalgam | 34.02 | 75.32 | 2240 |
| Zanskar (Padum region) | 33.48 | 76.83 | 3800 |

#### 仪器与分析方法
研究中使用的所有分析级溶剂包括来自 Fisher Chemicals 的乙腈（批次号 A996-4）和甲醇（批次号 A-456-4）、来自 Merck 的氯仿（批次号 IC51F65112）以及来自 Ranchem 的甲酸（批次号 R083G05）。超纯水使用 Indion Lab Q Ultra Water Purification System 制备。色谱分离采用反相 C18 柱子，包括 SunFire Prep C18 OBD 制备柱（10 μm，19 × 250 mm2；部件编号 186002669；序列编号 181130160113）和 Purospher STAR RP-18 端封分析柱（5 μm；吸附剂批次编号 HX72436669；LichroCART 250-4 HPLC 卡匣；柱子编号 725651）。化合物分离使用半制备型 HPLC 系统（Shimadzu AX-200；序列编号 D440420024），配备光电二极管阵列（PDA）检测器（序列编号 L20155111785 CD）。分析色谱分析使用 UHPLC 系统（UltiMate 3000；序列编号 7322179，Thermo Scientific），结合二极管阵列检测器（DAD；序列编号 81648557）。样品浓缩和干燥使用 BUCHI Rotavapor R-210 旋转蒸发器（序列编号 1000050443），溶液的超声处理使用 BOROSIL Labquest Ultrasonic Bath（UCB200）。核磁共振（NMR）光谱在 Bruker AVANCE DPX FT-NMR 光谱仪上记录，1H NMR 的频率为 400 和 500 MHz，13C NMR 的频率为 100 和 125 MHz。NMR 溶剂使用 CDCl3 和 CD3OD，化学位移（δ）以百万分之一（ppm）表示，相对于四甲基硅烷（TMS）作为内标，参考残余溶剂信号（CDCl3: δH 7.26 ppm，δC 77.16 ppm；CD3OD: δH 3.31 ppm，δC 49.0 ppm）。高分辨率质谱使用 Agilent 6540 Q-TOF 高分辨率质谱仪在电喷雾离子化（ESI-MS）模式下获取。

#### 流动相条件
流动相由乙腈（B）和 0.1% 甲酸在水中的混合物组成，以梯度程序运行，时间点分别为 0、22、25 和 30 分钟，相应的乙腈梯度为 20%、100%、100% 和 20%。流速保持为 1.0 mL/min，柱温设定为 50 °C。使用 DAD 检测器，主要检测波长设定为 254 nm，同时监测 272、210 和 360 nm 的波长。所有计算均基于 254 nm 的主要波长进行。图 1 展示了在这些条件下分离出的化合物的色谱图叠加。

#### 图 1
图 1. 色谱图叠加：(A) 六种量化多酚的叠加图。(B–G) 分离出的化合物。

#### 样品制备
来自不同地点的所有植物均在 8 月和 9 月期间采集，将根茎部分与地上部分分离。收集的根茎用自来水彻底清洗以去除附着的土壤和其他杂质，然后在室温下阴干至重量恒定。干燥后的根茎被碾碎成粗粉。粉末材料采用 1:5 的植物材料与溶剂比例进行简单浸渍。(19) 提取使用甲醇-氯仿溶剂混合物（1:1, v/v）。浸渍在室温（约 25 ± 2 °C）下进行 72 小时，期间间歇性搅拌以确保溶剂充分渗透和有效提取植物成分。浸渍后，提取液通过旋转蒸发器过滤并浓缩得到干燥提取物。干燥后的提取物在流动相中重新配制为 10 mg/mL 的浓度，用于初步筛选化合物的变化情况。

#### 分离标准化合物
所有分离出的标准化合物的储备溶液均使用相同的流动相制备，浓度为 1 mg/mL。从这些储备溶液中制备了六个校准水平，浓度分别为 20.75、41.50、83.00、166.00、332.00、498.00 和 662.00 μg/mL。每个校准水平分别转移到单独的小瓶中，用于构建校准曲线。

#### 结果与讨论
#### 植物化学成分的分离
我们首先绘制了指纹色谱图（图 2A），通过分离不同化合物来检测甲醇-氯仿（1:1）提取液中存在的成分，从而观察哪些成分存在。选择这种溶剂系统是基于以下假设：含有极性、中等极性和轻微非极性成分的混合物可以初步检测出广泛的化合物并促进其有效分离。分离使用流速为 3 mL/min 的方法，其中流动相 A 为含有 0.1% 甲酸的水，流动相 B 为乙腈。梯度为 10–100–100–10% B，在 0–20–25–30 分钟内进行，柱温为 40 °C。基于此指纹图谱，我们使用制备型 HPLC 进一步分离出更纯且分离良好的成分。为此，还参考了图 2B–G（具有相似保留时间的分离化合物），这些化合物在指纹区域明显分离，表明它们适合分离。

#### 分离出的化合物的特性
我们首次从这种植物中分离出了六种多酚。所有分离化合物的结构鉴定是基于LC-ESI-MS、NMR和UV–vis数据进行的，具体数据如下：

**化合物1：Physcion C16H12O5（1,8-二羟基-3-甲基-6-甲基-9,10-二氢蒽-9,10-二酮）**
- 13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ 190.83, 182.08, 166.57, 165.21, 162.52, 148.47, 135.27, 133.23, 124.54, 121.32, 113.69, 110.41, 108.25, 106.78, 56.11, 22.19
- 1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ 12.32 (s, 1H), 12.12 (s, 1H), 7.63 (d, J = 1.8 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 41.5 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H), 2.45 (s, 3H)
- m/z: 283.06 [M – H]?
- UV特征：在250–270 nm附近有强吸收（π → π*）；在285–295 nm附近有额外吸收带；在430–440 nm附近有长波长吸收带（S12–S15; S34; S39(A)）

**化合物2：Noreugenin C10H8O4（5,7-二羟基-2-甲基-4H-铬烯-4-酮）**
- 13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ 186.59, 171.39, 168.19, 165.51, 162.37, 111.94, 108.02, 103.05, 98.02
- 1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ 6.34 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.25 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.03 (s, 1H), 2.37 (s, 3H)
- [M – H = 191.03]
- UV特征：在230–240 nm附近有强吸收（π → π*跃迁）；在290–300 nm附近有额外吸收带（铬烯共轭系统）（S16–S17; S35; S39(E)）

**化合物3：Kaempferol C15H10O6（3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-4H-铬烯-4-酮）**
- 13C NMR（101 MHz, MeOD）δ 175.99, 164.18, 161.11, 159.15, 156.86, 146.68, 135.74, 129.29, 122.33, 114.92, 103.15, 97.87, 93.07
- 1H NMR（400 MHz, MeOD）δ 8.14–8.07 (m, 2H), 6.96–6.90 (m, 2H), 6.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.20 (d, J = 2.0 Hz, 1H)
- m/z: 285.04 [M – H]
- UV特征：在255–270 nm附近有强吸收（苯甲酰系统，π → π*跃迁）；在365–370 nm附近有明显长波长吸收带（肉桂酰系统）（S18–S21; S36; S39(D)）

**化合物4：Emodin C15H10O5（1,3,8-三羟基-6-甲基-9,10-二氢蒽-9,10-二酮）**
- 13C NMR（101 MHz, MeOD）δ 181.81, 164.50, 149.75, 138.53, 135.46, 123.84, 120.38, 108.66, 107.64, 48.24, 48.03, 47.60, 22.30
- 1H NMR（400 MHz, MeOD）δ 7.57 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 7.19 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.58 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 2.45 (s, 3H)
- m/z: 269.04 [M – H]
- UV特征：在250–265 nm附近有强吸收（π → π*跃迁）；在285–295 nm附近有额外吸收带（扩展的共轭系统）；在435–445 nm附近有长波长吸收带（由于额外的羟基而产生移位）（S22–S25; S37; S39(C)）

**化合物5：Chrysophanol C15H10O4（1,8-二羟基-3-甲基蒽-9,10-二酮）**
- 13C NMR（101 MHz, CDCl3）δ 192.56, 182.02, 162.73, 162.43, 149.37, 136.97, 133.65, 133.28, 124.58, 124.38, 121.38, 119.95, 115.89, 113.75, 22.29
- 1H NMR（400 MHz, CDCl3）δ 12.12 (s, 1H), 12.01 (s, 1H), 7.82 (dd, J = 7.5, 1.2 Hz, 1H), 7.70–7.62 (m, 2H), 7.29 (dd, J = 8.4, 1.2 Hz, 1H), 7.10 (dt, J = 1.7, 0.8 Hz, 1H), 2.47 (s, 3H)
- m/z: 253.05 [M – H]
- UV特征：在250–265 nm附近有强吸收（芳香系统的π → π*跃迁）；在285–295 nm附近有额外吸收带（蒽醌核的扩展共轭）；在425–435 nm附近有长波长吸收带（特征性的醌类色素）（S26–S29; S38; S39(B)）

**化合物6：Quercitrin C21H20O11（3′,4′,5,7-四羟基-3-(α-L-鼠李糖基)黄酮）**
- 13C NMR（101 MHz, MeOD）δ 178.26, 164.50, 161.80, 157.95, 157.14, 148.42, 145.03, 134.83, 121.55, 121.47, 115.54, 114.99, 104.49, 102.15, 98.43, 93.34, 71.84, 70.71, 70.65, 70.50, 13.04
- 1H NMR（400 MHz, MeOD）δ 7.34 (d, J = 14.8 Hz, 2H), 6.94 (s, 1H), 6.39 (s, 1H), 6.23 (s, 1H), 5.36 (s, 1H), 4.24 (s, 1H), 3.76 (s, 1H), 3.43 (s, 1H), 3.35 (s, 1H), 0.97 (s, 3H)
- m/z: 447.09 [M – H]
- UV特征：在255–260 nm附近有强吸收（Band II, π → π*跃迁）；在350–355 nm附近有长波长吸收带（Band I, 肉桂酰系统）（S30–S33; S39; S39(F)）

**方法开发与验证**
在方法开发过程中，优化了多个色谱参数，包括流动相组成、柱子类型、色谱模式、流速、柱温、检测波长和稀释剂组成，以获得高效的分离效果和可接受的系统适用性。最初测试了由乙腈和水（1:1, v/v）组成的等度流动相，但这种条件未能提供满意的分离效果，且观察到某些化合物的部分共洗。这可能是由于目标分析物之间的极性差异所致。为了改善分离效果，研究了使用乙腈和水的梯度洗脱方法。梯度系统提高了分析物的保留行为和分离效果，但某些峰仍存在部分重叠。进一步通过在水中添加甲酸来进行优化。甲酸的存在通过抑制分析物中酚羟基的离子化并减少与固定相的不必要相互作用，改善了峰形和分辨率，显著提高了所有六个化合物的分离效果。

在方法开发过程中还评估了不同的固定相，包括C8和C18柱。反相C18柱比C8柱表现出更好的色谱性能，具有更高的理论板数和更好的多酚化合物的峰分辨率，因此选择了C18柱作为最终方法。在优化条件下，使用反相C18柱和乙腈-甲酸梯度洗脱实现了分离。所开发的方法在色谱条件下提供了稳定的基线分离、可重复的保留时间和可接受的系统适用性参数，证明了该方法适用于这六个标记化合物的同时定量分析。

**方法验证**
根据国际协调会议ICH Q2 (R1)指南，对优化的UPLC-DAD方法进行了验证研究，以评估分析方法的质量。验证内容包括线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、准确性、精密度和稳健性。

**系统适用性测试（SST）**
系统适用性测试是色谱方法验证的重要组成部分，用于确保分析系统正常运行并能够产生可靠和可重复的结果。对于所开发的UPLC-DAD方法，评估了包括分辨率（Rs）、不对称因子（As）、容量因子（k′）、选择性（α）和理论板数（N）在内的系统适用性参数，以评估色谱性能。接受的判据是理论板数（N）> 2000，相邻峰的分辨率（Rs）≥ 2.0，不对称因子（As）≤ 2.0，以及容量因子（k′）通常>1（如适用）。这些判据与国际药品技术要求协调委员会、美国药典和欧洲药典提供的广泛接受的色谱建议和药典指南一致。

在本研究中，kaempferol的不对称因子（As = 1.75）表明峰有中等程度的拖尾，但仍在药典规定的As ≤ 2.0的范围内。此外，该峰具有优异的色谱效率，理论板数（N = 76,986）很高，与前一个峰的分辨率（Rs = 39.73）也非常好，表明分析物分离效率高且定量可靠。因此，观察到的峰拖尾并未对分析性能产生不利影响。quercitrin的容量因子（k′ = 0.74）略低于通常推荐的最优范围（k′ ≈ 1–10），这可能是因为quercitrin的极性比混合物中的其他分析物高。尽管如此，该化合物仍与溶剂前沿分离良好，并表现出良好的峰对称性（As = 1.04）以及 satisfactory 的柱效率（N = 20,969）。由于该方法设计用于同时分离极性范围广泛的分析物，因此最极性化合物的保留时间略有降低也是预期的。尽管如此，色谱分离效果仍足以进行准确的鉴定和定量（S40–S45）。系统适用性值（基于六次注射的平均值）见表2。

**表2. 使用UPLC-DAD方法的六个分析物的系统适用性参数**
| 分析物 | Rt (min) | Rs | As | k′ | α | N(EP) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| quercitrin | 6.40 | 1.04 | 0.74 | 20,969 | |
| noreugenin | 9.20 | 10.40 | 1.17 | 1.49 | 2.01 | 63,52 |
| kaempferol | 10.78 | 39.73 | 1.75 | 1.91 | 1.28 | 76,986 |
| emodin | 16.99 | 21.52 | 1.08 | 3.59 | 1.88 | 187,498 |
| chrysophanol | 20.44 | 6.93 | 1.04 | 4.52 | 1.26 | 250,275 |
| physcion | 21.55 | 1.06 | 4.82 | 1.07 | 291,920 | |

**选择性、线性、LOD和LOQ**
通过确认在六个分析物的保留时间处没有干扰峰来验证所开发的UPLC-DAD方法的选择性。所有化合物均显示出清晰且分离良好的峰，分辨率值始终高于可接受限值，确保了可靠的定性和定量评估（S47–S53）。

通过使用每个分析物的七个浓度水平构建的校准曲线建立了线性（图3）。斜率值介于0.9952至1.0022之间，表明在评估的浓度范围内具有优异的线性响应。通过信噪比评估确认了方法的灵敏度，最低校准水平的序列编号比值对所有化合物而言都是令人满意的，范围从24（physcion）到182.8（emodin）。计算出的LOD和LOQ值进一步支持了方法的灵敏度，LOD在1.3309至11.7171 μg/mL之间，LOQ在4.0331至35.5064 μg/mL之间。这些结果证实了所开发方法对于所有六个分析物的定量测定具有高度选择性、线性和灵敏性。

**检测限（LOD）和定量限（LOQ）**
使用校准曲线的y截距（σ）和斜率（m）的标准偏差计算了检测限（LOD）和定量限（LOQ）：
LOD = 3.3×(σ/m)
LOQ = 10×(σ/m)
表3列出了每个分析物的计算LOD和LOQ值。

**结论**
所开发的色谱方法用于同时测定选定的化合物，具有高选择性、线性和灵敏度。通过确认在六个分析物的保留时间处没有干扰峰，验证了方法的选择性（S47–S53）。使用校准曲线建立的线性表明，在评估的浓度范围内具有优异的线性响应。通过信号与噪声比评估确认了方法的灵敏度，最低校准水平的序列编号比值对所有化合物而言都是令人满意的。所开发的方法在研究的浓度范围内表现出高精度和准确性，% RSD值均在ICH验证指南推荐的范围内，从而证实了该分析方法的可靠性、可重复性和稳健性（S218–S307）。

**回收率（Recovery）**
通过在流动相中添加已知浓度的分析物来进行回收率研究。选择这些浓度是基于每个分离化合物的预期量。回收率研究是通过将80%、100%和120%的预期平均量添加到空白样品中来制备标准溶液进行的。回收率 (%) = (观察到的量 / 添加的量) × 100。

**稳健性（Robustness）**
通过对色谱条件进行小的、有意的改变来测试方法的稳健性。这些改变包括调整柱温（47、50和53°C）、流速（0.9、1.0和1.1 mL/min）以及修改梯度程序。所有测试均使用标准混合物的中间浓度。结果显示，这些变化没有导致峰面积、保留时间或分辨率的显著差异。所有### 方法的耐用性检验

为了检验所开发方法的耐用性，选择校准曲线中的一个中间点，由另一位分析师使用相同的方法连续三天进行重复测定，结果均符合ICH指南的要求。在遵循上述HPLC方法开发和验证参数后，该方法成功应用于不同地理来源样本中选定多酚的定量分析，浓度为10毫克/毫升。表4展示了每种提取物中的总多酚含量（所有检测到的标记化合物之和）以及槲皮素、山柰酚、山柰酚、橙皮素、菊佩酚和 physcion 的单独含量及其百分比贡献。

### 多酚含量与地理分布

表4列出了10毫克/毫升提取物中的总多酚含量及各化合物的百分比分布（n = 3）：
| 样本 | 总多酚含量 (μg/mL) | 槲皮素 (μg/mL; % 多酚/% 提取物) | 山柰酚 (μg/mL; % 多酚/% 提取物) | 山柰酚 (μg/mL; % 多酚/% 提取物) | 苋佩酚 (μg/mL; % 多酚/% 提取物) | physcion (μg/mL; % 多酚/% 提取物) |
|----|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|------------------|
| Sapi | 56.89 | 34.66 (71.36/34.66) | 68.57 (14.12/6.86) | 29.07 (0.60/0.29) | 344.97 (7.10/3.45) | 283.29 (5.83/2.83) | 47.79 (0.98/0.48) |
| Shang (SM) | 354 | 88.04 | 75.55 (2.13/0.76) | 488.65 (13.78/4.89) | 234.15 (6.60/2.34) | 2033.02 (57.30/20.33) | 635.74 (17.91/6.36) | 81.93 (2.31/0.82) |
| Hundurman Brog | 575 | 2.36 | 3953.22 (68.71/39.53) | 563.43 (9.80/5.63) | 110.78 (1.93/1.11) | 304.60 (5.30/3.05) | 589.06 (10.25/5.89) | 231.27 (4.01/2.31) |
| Overa | 184 | 0.99 | 467.49 (25.39/4.67) | 198.12 (10.76/1.98) | 653.15 (35.48/6.53) | 285.85 (15.53/2.86) | 236.39 (12.84/2.36) |
| Nubra | 362 | 71.6 | 519.77 (14.20/5.20) | 236.92 (6.53/2.37) | 691.33 (19.06/5.00) | 639.03 (17.62/6.39) | 500.11 (13.79/5.00) |
| Panikhar | 232 | 44.80 | 25.47 (1.10/0.25) | 256.56 (11.03/2.57) | 125.37 (5.39/1.25) | 1320.78 (56.82/13.21) | 572.19 (24.61/5.72) | 24.44 (1.05/0.24) |
| Zanskar | 566 | 192 | 4226.12 (74.67/42.26) | 705.44 (12.46/7.05) | 49.40 (0.87/0.49) | 271.85 (4.80/2.72) | 302.64 (5.35/3.03) | 106.47 (1.88/1.06) |
| Batalik | 133 | 80.00 | 457.83 (19.11/4.58) | 255.63 (18.43/2.56) | 246.53 (18.42/2.47) | 258.83 (19.34/2.59) | 119.03 (8.90/1.19) |
| Parkachik | 454 | 0.26 | 2107.07 (46.42/21.07) | 974.69 (21.47/9.75) | 70.67 (1.56/0.71) | 568.29 (12.52/5.68) | 673.66 (14.84/6.74) | 146.88 (3.23/1.47) |
| Matyen, Drass | 447 | 87.8 | 2821.08 (63.00/28.21) | 677.64 (15.13/6.78) | 172.72 (3.86/1.73) | 361.27 (8.07/3.61) | 244.79 (5.47/2.45) | 201.28 (4.49/2.01) |
| Sanku | 293 | 191 | 54.27 (1.85/0.54) | 323.63 (11.04/3.24) | 252.14 (8.60/2.52) | 1451.49 (49.51/14.51) | 620.06 (21.15/6.20) | 230.32 (7.86/2.30) |

该表清楚地展示了不同样本之间的化学成分差异，并有助于理解每种提取物中哪些化合物占主导地位。

### 分离化合物的化学计量学研究

如图4所示，通过基于弦图的化学计量学分析来可视化不同采集地点的主要植物化学物质的分布。图中左侧的弧线代表地点，右侧的弧线代表化合物，连接弧线的粗细表示10毫克/毫升浓度下的平均浓度（μg/μL）。分析结果显示，槲皮素在多个地区是主导化合物，在Zanskar（4.226 μg/μL）、Hundurman Brog（3.953 μg/μL）和Sapi（3.466 μg/μL）中的含量显著较高，表明地理条件对其积累有显著影响。橙皮素在特定地点也是主要成分，在Shang（2.033 μg/μL）、Sanku（1.451 μg/μL）和Parkachik（1.321 μg/μL）中含量较高，显示出明显的地点特异性富集。在蒽醌类化合物中，菊佩酚在大多数地区都有中等的存在程度，但在Nubra（0.691 μg/μL）和Sanku（0.620 μg/μL）中含量相对较高。山柰酚和physcion的浓度普遍较低，但在Shang（0.234 μg/μL）和Batalik（0.256 μg/μL）中略有升高，而physcion在Nubra（0.639 μg/μL）中积累明显。

### 主成分分析（PCA）

主成分分析（PCA）用于清楚地了解从11个不同地点采集的植物样本中六种分离化合物的水平变化。在进行PCA之前，所有化合物的值都进行了标准化（转换为Z分数），以便规模差异不会影响结果；在这种格式下，正值表示高于平均水平的浓度，负值表示低于平均水平的浓度，如表5所示。标准化数据显示，槲皮素在Zanskar、Hundurman Brog、Sapi和Matyen/Drass中的含量相对较高，使其成为导致地点间差异的主要化合物之一。橙皮素在Shang、Parkachik和Sanku中的含量明显较高，这些地点与其他地点区分开来。山柰酚在Panikhar中最为突出，表明该地点有利于其积累，而physcion在Nubra中的含量特别高，对该地区的独特化学组成有重要贡献。山柰酚在大多数地点的浓度较低，但在Batalik、Nubra和Sanku中有适度增加，表明它仍在分化过程中起一定作用。PCA得分分析显示，PC1解释了大部分变异，主要将总体化合物含量较高的地点（如Zanskar、Panikhar、Sanku和Hundurman Brog）与含量较低的地点（如Batalik和Overa）区分开来。PC2反映了与特定化合物（尤其是菊佩酚和physcion）主导性相关的差异，有助于区分Nubra、Shang和Parkachik等地。PC3捕捉了与山柰酚和山柰酚相关的额外变异，进一步区分了Batalik和Overa等地。PCA加载分析支持了这些观察结果，表明橙皮素和槲皮素对PC1的贡献最大，证实了它们在整体变异中的重要性；菊佩酚和physcion对PC2有显著影响，山柰酚主要影响PC3，physcion也影响PC4，而PC5对所有化合物的贡献很小。

### 多变量分析

多变量分析（表6）表明，根据总多酚含量和主要化合物的存在情况，研究地点可以分为三类：Zanskar、Hundurman Brog、Sapi、Panikhar和Matyen/Drass属于多酚丰富的地点，因为它们的总多酚含量最高（4.48–5.66 μg/μL），主要归因于高水平的槲皮素和橙皮素；Overa和Batalik属于多酚贫乏的地点，总多酚含量非常低（<2.0 μg/μL），且检测不到槲皮素，表明类黄酮积累较少。Shang、Nubra、Parkachik和Sanku的多酚含量适中，橙皮素、菊佩酚和physcion的贡献平衡。OPLS-HDA得分图（图6）清晰地展示了这些组别：轴1将多酚丰富的地点（如Zanskar +2.3, Hundurman Brog +2.0）与多酚贫乏的地点（如Batalik ?2.1, Overa ?1.8）区分开来；轴2突出了与菊佩酚和physcion相关的差异。主要负责这种区分的化合物是槲皮素和橙皮素。

### 结论

本研究清楚地展示了R. webbianum的植物化学成分在不同地理地点的差异。这是首次报道从该植物中分离并表征了六种生物活性化合物：槲皮素、橙皮素、菊佩酚、山柰酚、山柰酚和physcion，为其植物化学组成提供了重要的新信息。研究这些化合物在不同地区的分布有助于理解地理因素对次生代谢物积累的控制作用。弦图分析表明，R. webbianum的化学成分受地点影响显著。槲皮素在高海拔地区（如Zanskar、Hundurman Brog和Sapi）含量较高，表明环境压力可能促进类黄酮的形成。另一方面，橙皮素在Shang、Sanku和Parkachik等地区占主导地位，表明这些地点的蒽醌类化合物富集。其他化合物的分布或选择性积累反映了环境影响与稳定生物合成行为之间的平衡。多变量分析（如PCA和OPLS-HDA）进一步支持了这些发现，根据总多酚含量和主要化合物将地点分类为多酚丰富、中等和多酚贫乏组。此外，层次聚类分析形成了三个组别，分别对应多酚丰富、中等和多酚贫乏的地点。

### 总结

本研究提供了关于R. webbianum植物化学成分在不同地理地点变化的清晰化学计量学理解。这是首次报道从该植物中分离并表征六种生物活性化合物的报告，为其植物化学组成增添了重要信息。研究表明，地理因素强烈影响植物化学成分，某些化合物在不同地点的积累受到环境、气候或土壤条件的调节。开发并经过ICH指南验证的分析方法确保了这些化合物的定量检测结果具有可靠性、准确性和可重复性，从而增强了整体研究结果的可信度。这种综合方法为理解特定区域的化学变化提供了一个简单而可靠的分析框架，有助于合理选择富含植物化学物质的采集地点，并为未来关于R. webbianum的药理学研究、质量控制以及地理鉴定工作奠定了坚实的基础。