使用可调谐金纳米棒的体内四通道光声复用技术

《ACS Nano》：Quad-Channel In Vivo Photoacoustic Multiplexing Using Tunable Gold Nanorods

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光声（PA）成像结合了光学吸收的分子特异性与超声波的分辨率和深度，实现了体内无创分子成像。然而，现有对比剂的宽光谱和较差的光稳定性以及内源性吸收体的干扰阻碍了强大的多路复用技术的发展。在这里，我们展示了使用PEG化的二氧化硅包覆金纳米棒进行四通道PA多路复用的方法，这些纳米棒具有狭窄且光谱特征明确的等离子体共振，覆盖了近红外窗口。通过可重复的三步种子介导合成过程，制备出了单分散且光谱可调的金纳米棒。二氧化硅与PEG的共混包覆增强了光稳定性，并使整个批次的颗粒尺寸和表面化学性质标准化。仅使用商用OPO激光器和简单的非负最小二乘算法，我们就能在完整的体外和体内模型中实现准确的信号分离，平均绝对误差保持在4.3%以下。此外，我们还证明在这些纳米棒中，即使存在内源性氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的情况下，它们仍然可以清晰区分，并且可以通过VisualSonics的原生光谱反卷积技术进行解混。这一平台将现有的PA多路复用能力提升到了四个外源性通道，无需多模态成像、复杂的激光设置或繁琐的计算流程。这项工作为未来在无创生物标志物映射、多细胞治疗和空间分辨诊断中的应用奠定了基础。

**引言**
分子成像在理解复杂生物系统方面具有特别重要的意义，因为它能够实现活体内生化过程、分子相互作用和功能变化的非侵入性纵向可视化。(1,2) 多种分子成像技术，如正电子发射断层扫描（PET）、磁共振成像（MRI）和光学成像，都推动了该领域的发展，但每种技术都有其固有的局限性。PET具有出色的灵敏度，但受到低空间分辨率和使用电离辐射的限制。(3?6) MRI提供高软组织对比度，但缺乏分子特异性，无法进行实时或纵向监测。(7) 光学成像实现了高的分子灵敏度，但受限于较差的分辨率和浅层穿透能力。(8?10) 超声波和光声成像（US/PA）解决了许多这些问题，结合了非电离辐射、分子特异性、实时成像、高空间分辨率和显著的深度穿透能力。(11) 通过将US成像的声学分辨率与光学成像的分子灵敏度相结合，US/PA成为一种非常适合用于复杂生物系统（如肿瘤微环境）中分子成像的混合模式。(12) 分子成像的关键下一步是实现多路复用，即同时检测多个光谱特征不同的目标，从而提供不同生物分子或事件的综合视图。(13?16) 与需要体外采样和复杂处理的多组学方法不同，多路复用PA成像可以在体内实时且无创地实现这些测量。这对于需要同时读数的新兴生物医学挑战至关重要，例如映射空间癌症异质性以及跟踪多细胞治疗中的细胞群体动态相互作用，同时保持自然的生理背景。(14,17,18)

PA成像利用了光声效应的原理，即脉冲激光光被组织内的色素吸收，导致局部加热、热弹性膨胀并产生宽带超声波。(19,20) 这些压力波在组织中传播，并由超声换能器检测到，从而重建出揭示组织光学和分子特性的高分辨率图像。(21,22) 通过利用近红外（NIR，约650至1700纳米）光窗口，该窗口下生物组织的吸收和散射最小，PA成像实现了分子灵敏度和成像深度的平衡。(23,24) 通常PA成像依赖于使用内源性分子，如血红蛋白和黑色素，它们自然吸收光，用于映射氧饱和度水平、识别缺氧肿瘤区域和监测血管动态。(25) 例如，血红蛋白根据氧合程度的不同而变化，可以用于映射缺氧肿瘤区域，而黑色素强烈的PA吸收使其适用于黑色素瘤成像。然而，对于多路复用而言，内源性对比剂存在固有的局限性。(20,23,26?28) 它们的光谱较宽，存在显著的光谱串扰。由于缺乏目标特异性，它们只能针对特定分子，并且无法区分密切相关的分子种类。(28?30) 它们还受到周围组织的背景噪声影响，在异质和动态环境中效果较差。(31,32) 这些挑战突显了需要具有与内源性组织不同光谱特征的外源性对比剂的需求，这些对比剂能够针对特定的分子生物标志物进行定制，从而提高PA成像的灵敏度、特异性和多路复用能力。

有效的PA多路复用对比剂必须满足特定的严格标准，以确保高灵敏度、分辨率和特异性。(25)
(1) 每种对比剂都必须具有光谱特征明显的吸收峰，且重叠最小，以便在单个图像中清晰区分多个目标。(33) 最小化信号之间的串扰对于确保对单个目标的准确量化至关重要，特别是在复杂的生物环境中。(2) 此外，它们应在NIR光窗口内工作，以减少组织吸收和散射，从而实现足够的组织穿透深度。(34)
(3) 此外，对比剂必须表现出与内源性色素不同的光学特性，以确保检测到的信号主要来自预期的外源性分子。(4) 除了光谱特性外，理想的PA对比剂还应具有高的光稳定性，在长时间成像或纵向成像应用中保持稳定的信号强度。(5) 对比剂必须具有生物相容性，以确保在体内的安全性。(35,36)
(6) 另一个重要属性是易于功能化，这使得这些对比剂能够精确定制以靶向特定的生物标志物。尽管取得了显著进展，许多现有的PA对比剂在多路复用应用中仍面临挑战，如光谱重叠广、光稳定性不足或在生理环境中的生物相容性有限。(37) 这些因素使得光谱解混变得复杂，并限制了对其局部浓度的准确性。最后，有效的多路复用还依赖于能够解析重叠光谱特征并减少背景噪声的计算算法。(38) 开发符合这些标准的对比剂为PA成像的多路复用技术的发展铺平了道路。

在外源性PA对比剂中，金纳米棒（AuNRs）因其强烈的、狭窄的吸收峰、高的光热转换效率以及在NIR区域的强光学吸收而成为最有前景的多路复用对比剂之一，在该区域内组织吸收和散射最小。(39?42) 它们的等离子体共振可以在NIR窗口内调节，从而作为光谱特征明确的通道，用于同时成像多个目标。(43) 为了进一步提高性能，对AuNRs进行了二氧化硅包覆，增强了光稳定性、胶体稳定性和PA信号。(35,44?46) 此外，二氧化硅表面便于结合靶向配体，扩展了AuNR在靶向分子成像和治疗成像中的应用。(46,47) 以前的研究，包括我们自己的研究，已经使用二氧化硅包覆的AuNRs（S-AuNRs）进行了PA多路复用应用，证明了它们在模拟组织幻影中识别多种细胞类型的潜力。(48?50) 此外，实验室还探索了基于光谱离散染料的多路复用探针。(28,51?53) 然而，由于目前探针的宽吸收谱和引入另一种探针时的显著光谱重叠，体内PA多路复用主要局限于两种对比剂的组合。(54?56) 尽管一些研究尝试使用额外的光谱特征明显不同的染料来扩展谱系，但这些对比剂通常具有较弱的PA吸收和较差的光稳定性，从而降低了它们的实际效果。(52,53,57) 而且许多已发布的演示结果依赖于定性图像；它们使用的是临时的或未经验证的光谱解混程序，很少报告与已知真实组成的定量准确性。(58?64) 因此，本研究的进步不仅仅在于使用AuNRs进行PA成像，而在于开发了一个基于可调AuNR库的实际四通道外源对比剂多路复用框架，这些AuNR具有匹配的物理化学性质。

基于这一基础，我们开发了四种针对NIR光窗口优化设计的S-AuNR对比剂，解决了早期PA探针的光谱重叠和稳定性限制。我们采用了四步种子介导的合成方法：第一步生成单分散的球形金种子，第二步将这些种子转化为微型AuNRs，第三步调节它们的长宽比，获得具有狭窄等离子体峰的光谱独特AuNRs，第四步进行二氧化硅包覆。(65,66) 这样得到的S-AuNR亚群在NIR窗口内具有狭窄且分离良好的等离子体峰，同时具有匹配的形态和表面化学性质。随后的PEG化处理抑制了非特异性聚集和蛋白质晕的形成，得到了在生物环境中行为一致的PS-AuNR库。(67) 对光谱PA图像应用非负最小二乘解混算法，评估了在透明和富含血红蛋白的背景下的单通道、双通道、三通道、四通道及混合条件下的多路复用效果。进一步的体内多路复用性能在皮下小鼠模型中进行了评估，包括与VisualSonics原生光谱反卷积工作流的比较，以及对内源性氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白背景的鲁棒性测试。这些经过调优的探针及其配套的多路复用流程提供了高保真的四通道PA多路复用能力，扩展了在异质和动态生物系统中可靠识别多个分子目标的工具箱。

**可调AuNRs的合理设计与计算优化**
AuNRs通常通过无种子或种子介导的方法合成（图S1）。其中，种子介导的方法因其优越的可重复性、纳米颗粒均匀性和对尺寸分布的精确控制而受到青睐。种子介导的合成首先涉及将金离子还原成极小的球形金种子颗粒，随后在表面活性剂模板和精确控制的反应条件下不对称生长为纳米棒。无种子方法将成核和生长结合为一步，简化了程序，但往往导致颗粒不均匀、可重复性降低和失败率增加。利用种子介导策略的可靠性和精确性，我们开发了一种改进的三步纳米棒合成策略，以提高尺寸均匀性和批量可重复性，实现对多路复用PA成像所需的长宽比和光学调谐的精细控制（图1A）。我们的三步方法首先生成超小的球形金种子，然后在其上非对称生长为微型中间纳米棒。这些小棒作为最终生长步骤的均匀、精确尺寸的模板，通过调节银离子浓度、种子浓度和pH条件来精细调节棒的长度和长宽比（图S1）。这种结构化的合成方法能够一致地生产出具有严格控制几何形状、精确调谐的光学共振和批量一致性的AuNR群体，特别适用于近红外-I（NIR-I，约650至1000纳米）范围内的多路复用PA成像。

**图1**
图1. 用于PA多路复用的光谱独特PS-AuNR系列的合成和表征。(A) 三步可调AuNR合成协议的示意图。第一步产生各向同性的金种子；第二步从这些种子产生均匀的微型AuNRs；第三步实现精确的长宽比调节。(B) AuNR1–4的消光、吸收和散射截面的FDTD模拟。(C) AuNR1–4的TEM图像，显示高度单分散的颗粒（比例尺，100纳米）。(D) 四种纳米棒水溶胶的颜色照相，显示不同的溶液颜色。(E) AuNR1–4的UV–Vis–NIR吸收光谱，显示四个分离良好的纵向等离子体共振峰。(F) 纳米棒长度的TEM测量（每组n = 100），显示从AuNR1–4逐渐延长的现象。(G) 相应的宽度测量，显示系列中直径的减小。(H) 计算出的长宽比值从AuNR1–4逐渐增加，解释了图E中观察到的红移现象。(I) PEG化二氧化硅包覆金纳米棒（PS-AuNR1–4）的TEM图像，显示均匀的二氧化硅涂层和一致的棒状形态（比例尺，100纳米）。(J) 水溶液中PS-AuNR1–4的颜色照相，每种都显示独特的颜色。(K) PS-AuNR1–4的UV–Vis–NIR吸收光谱，显示相对于未涂层AuNRs的红移纵向等离子体峰，与二氧化硅涂层一致。(L) 从TEM分析得到的PS-AuNR1–4的长度（每组n = 50），显示四种配方中的棒长相当。(M) 相应的宽度测量（每组n = 50），也显示二氧化硅包覆后的尺寸一致。(N) PS-AuNR1–4的二氧化硅壳层厚度测量，显示涂层厚度在整个系列中有控制的减小，使得纳米颗粒尺寸一致且AuNR核心具有光谱可区分性。

为了确定最佳的AuNR几何形状以用于PA多路复用，我们进行了有限差分时域（FDTD）计算模拟。选择了四种可分离的纳米棒几何形状（AuNR1–AuNR4），并计算了它们的光学截面、消光、吸收和散射特性，以确定其适用性。模拟结果显示，在近红外-I（NIR-I）窗口内存在强烈且离散的消光峰（图1B）。重要的是，模拟预测这些纳米棒峰之间的光谱重叠最小（>64纳米间隔），从而确保了有限的串扰并支持了强大的多路复用能力。此外，所有几何形状的吸收与散射比率都非常高，约90%的消光归因于吸收，这凸显了它们产生强光致吸收（PA）对比度的潜力。电场模拟还显示在纳米棒尖端有明显的电场局域化（图S2），这突显了在强光照射下由于局部剧烈加热可能导致结构变形或熔化的潜在脆弱性。这些发现为后续优化AuNR的结构、光稳定性及性能提供了依据，使计算预测与实验设计和验证相一致。

### AuNRs的实验合成与形态学表征

在计算洞察的指导下，我们合成了一系列四种不同的AuNRs（AuNR1–AuNR4），每种纳米棒都具有精确可调的纵向表面等离子体共振（LSPR）峰，波段大约在650到950纳米之间。透射电子显微镜（TEM）表征证实了每批样品的纵横比和形态学均匀性逐渐提高（图1C，S3）。在合成过程中观察到了明显的颜色转变，从较短纳米棒（AuNR1）的灰蓝色逐渐变为较长纳米棒（AuNR3和AuNR4）的淡红色（图1D）。这些肉眼可见的颜色变化直接对应于纵横比的增加以及相关的等离子体共振峰的变化。紫外-可见光-近红外（UV–Vis–NIR）吸收光谱显示，LSPR峰分别位于大约665纳米（AuNR1）、730纳米（AuNR2）、820纳米（AuNR3）和910纳米（AuNR4），与计算预测高度吻合，且每个纳米棒峰之间的间隔至少为65纳米（图1E）。通过TEM图像（每个样品超过100根纳米棒）的定量分析显示，从AuNR1到AuNR4，纳米棒的长度系统且精确地增加（约54纳米到82纳米）（图1F）。同时，纳米棒的宽度则成反比减少（约22纳米到17纳米），以保持四种AuNR亚型之间的粒子体积几乎恒定（图1G）。TEM测量结果显示，纵横比从大约2.4（AuNR1）逐渐增加到约4.8（AuNR4）（图1H）。这种精确的形态学调节是通过仔细控制反应参数实现的，主要包括溶液pH值、银离子浓度和种子浓度，从而生成具有逐渐红移共振的细长纳米棒，同时避免了过于细弱或易碎的几何结构。要将纵向等离子体共振进一步扩展到近红外-II（NIR-II，约1000到1700纳米）区域，需要更高的纵横比，而这在保持窄光谱特征和结构稳健性方面越来越困难。因此，所得到的纳米颗粒被有意优化为在NIR-I光学窗口内具有稳健且可重复的成像性能。

### 二氧化硅涂层和聚乙二醇化以提高光稳定性和生物相容性

考虑到关于光稳定性的计算预测以及现有文献中对裸露AuNRs稳定性的担忧，我们应用了一种保护性的介孔二氧化硅涂层来增强合成AuNRs的热稳定性和结构稳定性。（35,44?46,68）为了控制二氧化硅壳层的厚度，我们设计并开发了一种混合前驱体策略，使用四甲基正硅酸盐（TMOS）来引发反应，使用四乙基正硅酸盐（TEOS）来维持生长（图S4）。这种TMOS-TEOS共前驱体方法允许精确调节水解和缩合速率，从而实现对壳层厚度的精细控制。因此，尽管基础AuNR核心尺寸存在差异，最终纳米颗粒具有均匀的整体尺寸。随后对这些涂有二氧化硅的AuNRs进行聚乙二醇化处理，以减少生物污染，并进一步提高粒子稳定性、生物相容性和在生物环境中的循环时间。TEM表征证实了每个AuNR亚型周围都有均匀的二氧化硅包覆（图1I）。所得到的聚乙二醇化二氧化硅包覆AuNRs（PS-AuNRs）在水溶液中表现出一致的分散性，通过透明且无聚集的胶体悬浮液直观验证，颜色从深紫色（PS-AuNR1）逐渐变为较淡的红色调（PS-AuNR2–4）（图1J）。紫外-可见光-近红外光谱分析显示，二氧化硅涂层后LSPR峰发生了适度的红移（约20–40纳米），所有峰都略微向近红外区域移动，这与用于PA成像的激发系统（光参量振荡器，OPO，Vevo LAZR）的激发范围相匹配（图1K）。重要的是，最终的PS-AuNR探针保持了超过64纳米的光谱分离度，显著减少了多路复用过程中的通道间干扰（图1K）。二氧化硅壳层的厚度经过系统调节，使所有PS-AuNRs的整体尺寸趋于一致，最终颗粒的尺寸分布均匀（平均长度约为109.7 ± 6.2纳米，平均宽度约为74.7 ± 5.8纳米）（图1L,M）。随着纳米棒长度的增加，壳层厚度逐渐减小，从PS-AuNR1（最短的纳米棒）的约29纳米减少到PS-AuNR4（最长的纳米棒）的约21纳米（图1N）。这种系统的尺寸调节是通过精细控制反应参数实现的，主要包括溶液pH值、银离子浓度和种子浓度，从而生成具有逐渐红移共振的细长纳米棒，同时避免了过于细弱或易碎的几何结构。

### 光稳定性和生物相容性的提升

考虑到关于光稳定性的计算预测以及现有文献中关于裸露AuNRs稳定性的担忧，我们应用了一种保护性的介孔二氧化硅涂层来增强合成AuNRs的热稳定性和结构稳健性。（35,44?46,68）为了控制二氧化硅壳层的厚度，我们设计并开发了一种混合前驱体策略，使用四甲基正硅酸盐（TMOS）来引发反应，使用四乙基正硅酸盐（TEOS）来维持生长（图S4）。这种TMOS-TEOS共前驱体方法允许精确调节水解和缩合速率，从而实现对壳层厚度的精细控制。因此，尽管基础AuNR核心尺寸存在差异，最终纳米颗粒具有均匀的整体尺寸。随后对这些涂有二氧化硅的AuNRs进行聚乙二醇化处理，以减少生物污染，并进一步提高粒子稳定性、生物相容性和在生物环境中的循环时间。TEM表征证实了每个AuNR亚型周围都有均匀的二氧化硅包覆（图1I）。所得到的聚乙二醇化二氧化硅包覆AuNRs（PS-AuNRs）在水溶液中表现出一致的分散性，通过透明且无聚集的胶体悬浮液直观验证，颜色从深紫色（PS-AuNR1）逐渐变为较淡的红色调（PS-AuNR2–4）（图1J）。紫外-可见光-近红外光谱分析显示，二氧化硅涂层后LSPR峰发生了适度的红移（约20–40纳米），所有峰都略微向近红外区域移动，这与用于PA成像的激发系统（光参量振荡器，OPO，Vevo LAZR）的激发范围相匹配（图1K）。重要的是，最终的PS-AuNR探针保持了超过64纳米的光谱分离度，显著减少了多路复用过程中的通道间干扰（图1K）。二氧化硅壳层的厚度经过系统调节，使所有PS-AuNRs的整体尺寸趋于一致，最终颗粒的尺寸分布均匀（平均长度约为109.7 ± 6.2纳米，平均宽度约为74.7 ± 5.8纳米）（图1L,M）。随着纳米棒长度的增加，壳层厚度逐渐减小，从PS-AuNR1（最短的纳米棒）的约29纳米减少到PS-AuNR4（最长的纳米棒）的约21纳米（图1N）。这种系统的尺寸调节确保了总体尺寸的均匀性，并通过二氧化硅涂层和聚乙二醇化实现了表面化学性质的紧密匹配，尽管基础AuNR尺寸存在差异。与这些匹配的尺寸一致，动态光散射（DLS）测量显示有效的流体动力学直径相当，而ζ电位测量结果也非常接近且略微负值（图S5）。为了评估批次间的重复性，PS-AuNR1–4分别在三个独立批次中合成，并通过紫外-可见光-近红外光谱和TEM进行了表征。在不同批次中，每种配方的纵向LSPR峰位置保持密切匹配，TEM确认了纳米棒的形态一致性（图S6）。这种精心设计的设计使得光学性质成为PS-AuNRs之间的唯一区别因素，使其非常适合用于多路复用的PA成像。通过控制这些物理化学因素，PS-AuNRs之间唯一的区别在于它们的光谱，从而实现了准确的光谱分离和在复杂生物环境中的可靠多路复用PA成像。

### PS-AuNRs的PA成像表征

为了系统评估合成PS-AuNRs（PS-AuNR1至PS-AuNR4）的PA成像性能，我们使用了一个定制设计的3D打印聚乙烯管幻影。每种PS-AuNR溶液都调整到了其相应峰值吸收波长的相同光密度（OD）：大约690纳米（PS-AuNR1）、770纳米（PS-AuNR2）、870纳米（PS-AuNR3）和940纳米（PS-AuNR4），然后加入到不同的管中用于成像。随后在这些相应的峰值波长下进行了初步的定性PA成像。在这些不同波长下捕获的图像清楚地显示了四种PS-AuNR亚群之间的区别（图2A，面板1–4）。在690纳米处，PA图像显示PS-AuNR1的信号最强，PS-AuNR2的信号中等强度，PS-AuNR3的信号最小，而PS-AuNR4的信号无法检测到（图2A，面板1）。相反，在940纳米处，PS-AuNR4的PA强度最强，PS-AuNR3的强度中等，PS-AuNR2的强度最小，PS-AuNR1的信号几乎不可检测到（图2A，面板4）。中等波长（770和870纳米）同样产生了与每个纳米棒的光学吸收峰值精确对应的不同PA强度模式。接下来，我们通过量化波长特定的串扰（图2B）和光谱重叠（图2C）来评估PS-AuNR探针的光谱特异性和多路复用可行性。由于串扰指标是相对于特定测量通道评估的，而光谱重叠指标是相对于参考光谱计算的，因此这两个热图都是方向性的。在关键成像波长（690、770、870和940纳米）下，尽管AuNR1和AuNR2的光谱重叠很高（0.81），串扰矩阵显示它们之间的干扰最小，表明实际上实现了有效的分离。然而，AuNR3和AuNR4之间的串扰显著，约为83%，这也与它们显著的光谱重叠（0.736）相符。这种显著的光谱重叠和相关的强串扰可能限制多路复用的准确性，因此在后续成像实验中需要仔细考虑。然而，光谱PA成像显示了与每个PS-AuNR亚群准确对应的清晰可分辨的峰，与其各自的紫外-可见光-近红外吸收光谱轮廓紧密对齐（图2D）。为了验证这些纳米颗粒的定量可靠性，我们对每种PS-AuNR亚型在四种不同浓度（OD = 0.125、0.25、0.50和1.0）下进行了线性测试（图S7）。所得到的PA信号与探针浓度表现出强烈的线性相关性（R2分别为0.995、0.978、0.992和0.988），证实了所有四种探针的浓度依赖性PA响应（图2E）。这种稳健的线性对于准确量化至关重要，并增强了这些纳米颗粒在体内进行可靠分子成像应用的信心。

### 结论

图2展示了光谱不同的AuNRs的PA成像特性。（A）在四个波长（690、770、870和940纳米）下获得的含有PS-AuNR1–4的管幻影的PA图像，这些波长大致对应于每种纳米棒配方的峰值吸收波长。每个纳米棒在其相应波长下显示出不同的PA信号，支持了光谱多路复用的潜力。（B）PS-AuNR1–4之间的方向性串扰热图，说明了在相应峰值波长下PA信号的重叠程度。每行都归一化到目标试剂在该波长下的值，使得目标通道的值为100%，其余值表示非目标试剂对该测量通道的泄漏。（C）量化PS-AuNR1–4的标准化PA光谱之间成对相似性的方向性光谱重叠热图。接近1的值表示相对于参考PS-AuNR光谱的高度相似性。（D）PS-AuNR1–4的标准化PA光谱（λ = 680–970纳米），显示出光谱上可分离的轮廓。（E）在OD = 0.125、0.25、0.5和1.0下测量的每个纳米棒的PA信号与光密度的线性关系，确认了浓度与PA幅度之间的强线性相关性（R2分别为0.995、0.978、0.992和0.988）。（F）在约15 mJ/cm2的激光脉冲下评估PS-AuNR1–4在其各自峰值波长下的光稳定性，所有配方都显示出稳定的PA信号输出，表明适合重复和持续的成像应用。

### PS-AuNRs在脉冲激光激发下的光稳定性

接下来，我们评估了PS-AuNRs在长时间脉冲激光激发下的光稳定性，这是可靠多路复用和纵向成像的重要特性。每种PS-AuNR配方都在其各自的峰值吸收波长（690、770、870和940纳米）下接受了超过5000次激光脉冲（约15 mJ/cm2）的照射，整个照射期间监测了PA强度。所有四种PS-AuNR亚群都表现出优异的光稳定性，即使在长时间激光照射后也保持了稳定的PA幅度，信号损失或光谱漂移都很小（图2F）。PA光谱在光稳定性实验前后进行了测量，所有四种PS-AuNR配方的结果都非常相似，支持了最小的粒子重塑和强大的纵向成像潜力（图S8）。这种高的光稳定性行为与先前的报告一致，表明介孔二氧化硅涂层和微型化的纳米棒尺寸减少了激光和热诱导的结构变形。此外，需要注意的是，激光能量在所有测试波长上的分布并不均匀。在光谱极限（700和940纳米）处的激光能量输出略低（约13 mJ/cm2），而中心波长（770和870纳米）处的激光能量输出约为18 mJ/cm2。总体而言，这些发现确认了PS-AuNRs对光热不稳定性的抵抗力，并在长时间的成像会话或多次成像周期中保持了稳定的PA响应。

### PA多路复用成像准确性的定量评估

在这些表征的基础上，我们进一步评估了PS-AuNR平台的光谱分离和多路复用能力，通过成像一组综合纳米颗粒混合物（图3A）来进行评估。总共准备了31种独立的混合物，包括单一剂控制、二元、三元组合以及各种边界条件（图3B；表S1），并将其加载到聚乙烯管幻影中。在完整的光谱范围（680–970纳米，2纳米增量）内获取PA光谱，并使用基于非负最小二乘法（NNLS）的自定义开发的光谱解混算法对光谱数据进行了分析（图3C；S9,S10）。该算法将获取的多路复用光谱定量分解为已知单一剂PS-AuNR参考光谱的线性组合，从而确定了每种混合物中纳米颗粒的相对贡献（表S2）。选择了六种代表性混合物进行详细的光谱重建：三种具有不同光谱分离的二元混合物（Mix 5、6和7）、两种区分前三种和后三种纳米颗粒的三元混合物（Mix 11和14）以及一种四元混合物（Mix 15）。使用算法生成的纳米颗粒贡献重建的混合物光谱与实验获得的混合物光谱非常吻合（图3D；S11,S12）。算法生成的纳米颗粒贡献估计值与实验定义的实际组成非常吻合，强调了我们光谱解混方法的可靠性（图3E；S13,S14）。热图可视化显示了所有混合物之间的真实组成与估计组成之间的差异（列：PS-AuNR1–4；行：Mixture 1–31）（图3F）。低差异区域表示精确的一致性，而高差异区域指出了光谱重叠的挑战。对平均绝对误差（MAE %）的定量分析进一步明确了这些性能趋势（图3G）。正如预期的那样，含有光谱相距较远的纳米颗粒的二元混合物（例如Mix 7：PS-AuNR1和4）表现出非常低的平均绝对误差（MAE）率（<0.5%），这证实了该方法在简单多路复用场景中的稳定性和精确性。通常，我们发现光谱重叠程度决定了多路复用的准确性。如预期的那样，含有光谱重叠较少的纳米颗粒的混合物（如混合物5（PS-AuNR1和2）的误差较低（<3.5%），而含有较大光谱重叠的混合物（如混合物10（PS-AuNR3和4）的误差较高（约11.5%），这表明信号串扰增加（图3G）。在所有混合物和纳米颗粒中，平均MAE为4.30%，这对于多路复用分子成像来说是一个非常可接受的误差范围。接下来，我们评估了每种单独的对比剂在所有混合物中的性能（图3H）。AuNR3表现出最高的误差，主要是由于其与AuNR4有显著的光谱重叠（5.42%），而AuNR2由于其与AuNR1和AuNR3之间的清晰光谱分离而表现出最低的误差（3.07%）。当分析MAE作为混合物复杂性的函数时（二元、三元或四元），有趣的是，我们观察到随着同时未混合的对比剂数量从两个增加到四个，误差并没有显著增加（图3I）。这表明多路复用性能并不严格受到对比剂数量的限制，而是受到所选对比剂特定光谱特性的限制。支持这一点的还有，我们在二元混合物中观察到了误差的广泛变化，突显了对比剂选择的关键作用（图3I）。为了进一步探索这种关系，我们研究了对比剂之间的最小光谱间距对解混准确性的影响（图3J）。观察到一个明显的负相关趋势：对比剂之间的光谱分离度越大，MAE越低。这一发现强化了设计光谱上不同的探针以最大化多路复用准确性的重要性。最后，我们评估了混合物中对比剂浓度是否影响多路复用准确性（图3K）。浓度与绝对误差之间没有明确的关系，这表明即使在边界条件和高偏斜条件下，多路复用准确性仍然稳定。总的来说，这些数据表明，PS-AuNRs结合我们的光谱解混方法，提供了适用于复杂分子成像的稳定且定量的多路复用PA成像。

图3. PS-AuNR混合物的体外PA多路复用。(A) PA成像设置示意图，展示了管状 phantom 和成像平面的方向。(B) 实验设计表格，显示了31种总纳米棒混合物，涵盖了全部因子设计空间，用于评估多路复用性能。这些混合物被分为六组：单一对比剂、二元、三元、四元以及两种边界条件（90:10的偏斜二元和70:10:10:10的偏斜四元)。(C) 六种选定混合物的代表性PA图像：Mix 5 (AuNR1 + 2)、Mix 6 (AuNR1 + 3)、Mix 7 (AuNR1 + 4)、Mix 11 (AuNR1 + 2 + 3)、Mix 14 (AuNR2 + 3 + 4) 和 Mix 15 (AuNR1 + 2 + 3 + 4)，在四个波长（690、770、870 和 940 nm）下捕获。随着混合物复杂性的增加，不同的光谱分离度和空间分布变得可见。(D) 选定混合物的原始光谱与重建光谱的比较。(E) 六种选定混合物中AuNR1–4的真实值与估计贡献百分比的定量比较。(F) 所有31种混合物中每种对比剂的误差值热图，反映了估计贡献与真实值之间的偏差。(G) 每种混合物的平均绝对误差（MAE，以%表示）热图，反映了整个实验设计空间中的整体解混性能。(H) 所有31种混合物中每种对比剂的MAE百分比汇总，揭示了特定对比剂的性能趋势。AuNR3由于与AuNR4有较大的光谱重叠而显示出较高的误差，而光谱隔离度较高的对比剂显示出较低的误差。(I) 每种混合物中对比剂数量的MAE百分比，显示出随着光谱复杂性的增加误差没有一致的趋势，表明多路复用准确性不依赖于混合物中对比剂的数量。(J) 每种混合物中对比剂之间的最小光谱间距的MAE百分比，表明光谱分离度的增加与误差的减少和解混准确性的提高相关。(K) 每种对比剂的绝对误差（%）与其在每种混合物中的真实值贡献有关。没有观察到浓度与误差之间的一致相关性，表明检测准确性并不完全依赖于浓度。

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为了评估PS-AuNRs在生物学相关环境中的能力，我们评估了它们在强内源性光学背景存在下的光谱区分能力和在相关暴露条件下的细胞相容性。通过对间充质干细胞的细胞毒性评估，发现在浓度高达16 OD时，PS-AuNR1–3并未显著降低细胞活力，而PS-AuNR4仅在16 OD时略有下降；值得注意的是，PS-AuNR1–4在浓度高达8 OD时没有表现出毒性，超过了本研究中使用的浓度（图S15）。接下来，将每种PS-AuNR与全人血液混合并加载到管状 phantom 设置中。UV–Vis–NIR光谱学（400–1100 nm）显示，血液吸收在400–600 nm范围内占主导地位，有效地模糊了该区域中外源性对比剂的信号（图S16A,B）。然而，在大约600 nm之后，血液吸收急剧减少，提供了一个清晰的光谱窗口。在这个NIR-I光学窗口内，PS-AuNR的吸收峰在血液背景下仍然可以清晰区分，证实了我们光谱设计的实用性（图S16C,D）。在532 nm（图S17A,B）以及相同的OPO波长范围（680–970 nm）（图S17C–H）内，对含有血液的PS-AuNR进行了光谱PA成像。在532 nm下，由于血红蛋白的高吸收，血液产生了强烈的PA信号，显著降低了信号与背景的比率，使得对比剂的检测变得复杂（图S17A,B）。相比之下，在用于多路复用成像的OPO调谐范围内（690、770、870和940 nm），血液的固有PA信号相对于PS-AuNRs来说非常微弱（图S17C–H）。然而，这项分析没有考虑到其他内源性吸收剂，如脂质或黑色素，这些物质可能在更复杂的生物组织中贡献背景信号。

体内皮下多路复用PA成像
受到体外结果的有希望的鼓舞，我们接下来评估了PS-AuNRs在体内的多路复用能力。我们使用了一个皮下小鼠模型，在该模型中，四种不同的PS-AuNR亚群分别悬浮在Matrigel中，并注射到小鼠背部的不同位置（图4A,B）。我们准备了12种独立的混合物，包括4种单一对比剂、3种二元混合物、2种三元混合物和2种边界条件混合物——一种二元混合物和一种四元混合物具有偏斜的组成（图4C，表S3）。每种混合物均匀分布在Matrigel中并皮下注射。每种混合物组进行了五次独立的生物学重复实验，从而获得了评估多路复用性能的全面体内数据集（总共60组）。进行了光谱PA成像（680–970 nm，2 nm步长）和3D PA成像。US/PA图像显示了所有注射的PS-AuNR制剂的可区分PA信号轮廓，使得混合物之间能够清晰地进行空间区分。从12种混合物组中选取了代表性图像，分为三组：单一对比剂混合物（混合物1–4，图4D）、二元和四元混合物（混合物5–8，图4F）以及三元和边界条件混合物（混合物9–12，图4H）。每个面板包含了在接近峰值波长（680、750、860和960 nm）处获得的四个子图像。由于组织中的轻微光谱失真，我们优先选择了较宽的通道间距以减少串扰，即使这并不是PS-AuNR的绝对峰值。如预期，PA信号强度在不同波长上有所不同，对应于其峰值处的纳米颗粒有强烈的响应（图4D、F、H）。与有利的NIR-I成像窗口一致，从深度匹配的组织背景ROI中提取的原始PA光谱在整个采集范围内相对于PS-AuNR团块通常低一个数量级（图S18）。值得注意的是，在四元混合物中，所有四种纳米颗粒在其各自波长下都产生了可检测的信号，而二元混合物在相关的两个波长下显示了增强的对比度（图4F）。为了验证空间解混性能，我们应用基于NNLS的光谱分解生成了特定对比剂的地图。显示了每种对比剂的占主导地位的地图，指示每个像素中贡献最大的纳米颗粒（图4E、G、I）。为了便于可视化，每种PS-AuNR被分配了不同的颜色：PS-AuNR1（红色）、PS-AuNR2（蓝色）、PS-AuNR3（紫色）和PS-AuNR4（绿色）。这些地图与每种混合物的预期组成有很强的定性一致性。单一对比剂注射产生了高度具体的空间定位，而二元、三元和四元混合物显示了与注射组合一致的空间信号（图4E、G、I）。除了单一对比剂地图外，我们还生成了两种合并的表示方法来可视化所有注射点的空间组成：一种主导对比剂复合图和一种加性颜色积分图。主导对比剂地图将每个像素分配给其最丰富的纳米颗粒，而加性地图则用加权颜色强度叠加了光谱贡献（图5）。这些表示方法共同清晰地区分了每种注射团块中PS-AuNR的空间分布，揭示了所有12个混合物组的预期组成。作为对照，仅包含生理盐水和仅包含Matrigel的注射也被包括在内，以评估背景干扰。这两种情况在原始PA图像、未混合的光谱图或合并的重建中都没有产生可检测的信号，确认了内源性PA信号或基质成分不会影响解混结果（图S19A–D）。

图4. 皮下注射小鼠模型中PS-AuNR混合物的体内PA多路复用。(A) 皮下注射模型示意图，显示了每只小鼠背部的四个注射部位。(B) 使用NNLS生成空间分辨对比剂地图的US/PA成像设置和光谱解混策略的示意图。(C) 实验设计，描述了12种不同的注射组：四种单一对比剂对照、一种四元混合物、三种二元混合物、两种三元混合物和两种边界条件（一种偏斜的二元和一种偏斜的四元）。每种混合物的真实值纳米棒贡献以条形图显示。每个组包括n = 5只小鼠（生物学重复实验）。(D) 在680、750、860和960 nm处选择的单一对比剂注射的代表性US/PA图像，以近似每种纳米棒制剂的峰值吸收。(E) 图D中显示的相同单一对比剂注射的多个纳米棒贡献的复合空间地图。每张图像对应于AuNR1–4中的一种（从上到下按颜色图排列），并清晰地展示了每种纳米棒在其指定注射位置的位置，同时在这些区域其他纳米棒的信号最小。(F) 四种额外实验组的代表性US/PA图像：一种四元混合物和三种二元组合。(G) 图F中显示的组中AuNR1–4的相应复合地图。在四元注射部位检测到了所有四种纳米颗粒，而在三种二元注射部位仅可见各自的两种纳米颗粒。(H) 三元混合物组和两种边界条件组的US/PA图像。(I) 图H中显示的组中AuNR1–4的复合贡献地图，展示了预期纳米颗粒在各自注射位置的空间定位。（比例尺，2 mm。适用于所有图像面板。)(J) 显示所有60个重复实验组（每个组n = 5）中AuNR1–4的估计贡献百分比的堆叠条形图。每个条形代表一个重复实验的多路复用输出，与图C中的真实设计有很强的吻合。(K) 所有12种混合物中AuNR1–4的平均误差值热图（平均值基于n = 5只小鼠）。大多数混合物的误差较低，<5%，其中Mix 10（三元）的误差最高，因为它包含了光谱重叠最大的AuNR3和AuNR4。(L) 每种混合物的平均绝对误差百分比。误差范围从0.60%到最大10.5%，大多数混合物显示出准确的解混。(M) 所有混合物中每种对比剂的平均绝对误差百分比（每个组n = 5）。由于与AuNR4的光谱接近，AuNR3显示出最高的误差，而其他对比剂的误差率较低。(N) 按每种混合物中的对比剂数量分组的平均绝对误差百分比。虽然三元混合物显示出最高的总体误差，但并没有观察到随着混合物复杂性增加的一致趋势。尽管四元素混合物含有四种成分，但它们表现出的误差相对较低，这突显了光谱间距对成分数量的影响。（O）通过基于主要成分分布图的预测，结合每种成分的灵敏度和特异性来量化多重成像的空间准确性，相对于已知的注射部位进行评估。所有PS-AuNR在每种条件下都表现出高灵敏度（>94%）和特异性（>98%），表明其定位能力强大，且脱靶信号最小。（P）基于强度的准确性指标显示了每种成分的灵敏度和信号泄漏比率。PS-AuNR1和PS-AuNR2显示出较高的泄漏率，可能是由于在较低波长区域存在内源性背景，而PS-AuNR3和PS-AuNR4的泄漏率较低。所有成分的强度灵敏度保持在较高水平（>94%）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片 图5 图5. 在存在内源性吸收体的情况下使用原生的VevoLAB解混算法进行PS-AuNR多重成像。代表性的体内皮下光谱PA数据集：第1列是单元素混合物；第2列是四元素和二元混合物；第3列是三元素和边界条件混合物。（A）PA MIP图像以及每次注射的成分组成。（B）使用自定义的基于NNLS的解混工作流程生成的四通道主要成分图。（C）四通道加性颜色NNLS图，其中像素颜色反映了多种成分的综合相对贡献。（D）使用内置的VevoLAB多路器工作流程以固定的层序PS-AuNR1–2–3–4生成的四通道未混合图像。（E）在添加脱氧血红蛋白作为内源性吸收体通道的情况下生成的五通道VevoLAB未混合图像，显示的层序为脱氧血红蛋白 followed by PS-AuNR1–2–3–4。（F）在添加氧血红蛋白作为内源性吸收体通道的情况下生成的五通道VevoLAB未混合图像，显示的层序为氧血红蛋白 followed by PS-AuNR1–2–3–4。在所有面板中，PS-AuNR1、PS-AuNR2、PS-AuNR3和PS-AuNR4分别用红色、蓝色、紫色和绿色表示，而脱氧血红蛋白和氧血红蛋白用黄色和青绿色表示。这一比较表明，即使包含内源性吸收体通道，PS-AuNR平台在标准商业解混工作流程中仍然具有视觉可解释性，并且保持了清晰的多重对比度。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片使用我们基于NNLS的算法在每次注射的指定感兴趣区域（ROI）内进行定量光谱解混，得到了每个重复实验中每种成分的估计贡献。对所有皮下混合物中四种PS-AuNR成分的估计贡献与已知的实际成分进行了直接比较。图4J展示了所有60次皮下注射（12种混合物×5次重复实验）的估计成分的堆叠条形图，直观地再现了图4C中显示的真实情况（图4J，C）。这种高度一致性突显了我们的解混算法在准确计算组织中复杂混合物成分方面的稳健性（图S20）。使用算法得出的纳米粒子贡献重建的光谱特征与所有实验条件下的实验获得的光谱非常吻合（图S21）。一个热图展示了每次注射的误差（平均值；n = 5次重复实验），进一步强调了多重成像策略的稳健性（图4K）。MAE%汇总热图显示了每种混合物的误差幅度，大多数误差低于5%，除了含有AuNR2、AuNR3和AuNR4的混合物10，其误差约为10.5%，这可能是由于AuNR3和AuNR4之间的光谱重叠（图4L）。对所有皮下注射的分析表明，MAE%约为3.3%，表明在体内情况下的光谱解混准确性非常好（表S4）。接下来，我们检查了所有注射中每种成分的误差趋势。与体外研究类似，由于AuNR4的光谱干扰，AuNR3的误差略有升高，而AuNR2保持了最低的MAE（图4M）。为了评估混合物复杂性的影响，我们分析了MAE与成分数量（单元素、二元、三元和四元素）之间的关系。与体外数据相反，含有三种或四种成分的混合物显示出比二元混合物更高的误差（图4N）。有趣的是，四元素混合物的MAE略低于三元混合物，这表明与体外情况类似，影响解混准确性的主要因素是光谱间距和成分选择，而不仅仅是成分的数量（图4N）。与此一致的是，最小光谱间距与MAE之间的相关性分析证实了它们之间的反向关系（图S22A）。相反，没有观察到MAE与每种成分的相对贡献之间的明确关联，表明即使在边界或偏移的成分组成下，解混准确性仍然稳健（图S22B）。为了评估我们的多重成像方法的准确性，我们独立评估了每种PS-AuNR的空间和基于强度的准确性。为了评估鉴定出的对比剂的定位情况，我们基于已知注射ROI（ROIs）的预测，逐像素计算了每种成分的灵敏度和特异性（图4O）。对于每种成分，灵敏度捕捉到正确分类的真实要素像素的比例，而特异性测量了正确识别为阴性的背景像素的比例。所有四种PS-AuNR都表现出高灵敏度（>94%）和特异性（>98%），表明其空间定位能力强，假阳性分配极少（图4O）。此外，我们还量化了基于强度的准确性，该方法将实际未混合的PA信号值（而不是二进制像素存在）纳入性能评估中。基于强度的灵敏度计算为在真实区域内正确恢复的总PA信号的比例。为了考虑脱靶信号泄漏，我们报告了信号泄漏比率（SLR），定义为错误分配信号在标注的真实ROI之外的比例（图4P）。虽然基于强度的灵敏度保持在较高水平（>94%），但值得注意的是，AuNR1和AuNR2的信号泄漏比率较高（分别约为16.8%和14.1%），这表明在较低波长区域由于内源性组织PA信号的干扰，信号误分类的程度更大。这些空间和强度分析共同提供了一个补充框架，用于评估解混性能在定位和定量恢复PA信号方面的表现。这些结果总体上验证了我们的光谱可调PS-AuNR平台在四通道体内多重PA成像中的实用性，突显了它们在生物相关环境中同时准确检测和监测多种生物标志物的潜力。与商业VevoLAB解混和体内血红蛋白通道分析的比较为了进一步评估实际可用性和对内源性背景的稳健性，我们将我们自定义的基于NNLS的工作流程与内置的VevoLAB光谱反卷积工作流程进行了比较，使用了代表性的体内皮下数据集（图5A）。在单元素、四元素/二元和三元素/边界条件示例中，主要成分和加性颜色NNLS图恢复了预期的PS-AuNR成分，相应的注射团块定位清晰（图5B,C）。商业VevoLAB工作流程同样恢复了主要的多重信号模式（图5D），尽管其分层渲染格式使得视觉突出部分依赖于显示顺序。这在含有PS-AuNR1的混合注射团块中最为明显，因为固定的显示顺序导致PS-AuNR1层在其他通道也存在的情况下在视觉上占据主导地位。同时，分层渲染保留了低级别的边界信号，并产生了直观有用的多重数据可视化（图S23A,B）。然后我们在VevoLAB工作流程中添加了脱氧血红蛋白和氧血红蛋白作为额外的通道，以直接评估实际体内条件下的内源性干扰（图5E,F）。在匹配的可视化设置下，两种内源性血红蛋白通道相对于PS-AuNR注射团块的强度较弱，没有显著掩盖纳米颗粒的定位。当血红蛋白通道以显著增加的亮度显示时，低级别的内源性信号变得更加明显，但其分布依然广泛，且在空间上与局部化的纳米颗粒对比明显区分开（图S24A–C）。这些结果共同表明，PS-AuNR库不仅可以使用简单的自定义NNLS工作流程解决，也可以在标准商业软件环境中解决，同时在对NIR-I多重成像范围内对内源性氧血红蛋白和脱氧血红蛋白背景保持稳健。讨论这项工作将PA多重成像从之前的两个通道扩展到了四个通道，利用了一个合理设计的PS-AuNR库，以及仅需要单个商用OPO激光器和简单的NNLS解混算法的最低设置要求。AuNRs的最终LSPR峰值位于680–970 nm范围内，这与单个OPO激光器的全部调谐范围相匹配。此外，对AuNRs进行受控的二氧化硅涂层和PEG化处理，得到了大小相似、表面化学性质类似的探针，确保了类似的动力学和生物分布。基本的NNLS算法足以解混这四个通道，因为每个探针的光谱既窄又分离良好。与现有的使用多台激光器设置的多重PA成像方法相比，我们的方法在硬件或计算复杂性方面没有增加。尽管工作流程简化了，该平台在体外下的平均MAE约为4.3%，在体内下约为3.3%，同时多重化了四种对比剂。更广泛地说，这项工作的关键贡献是在平台层面而非材料层面。AuNRs本身已经是众所周知的良好PA对比剂，之前的研究已经证明了二氧化硅涂层AuNRs在PA成像和概念验证多重成像中的实用性。然而，大多数先前的报告都集中在单元素成像、两元素区分或没有针对已知混合物组成的明确基准测试的较窄范围的研究上。相比之下，我们的研究整合了四种光谱工程化的AuNR探针，具有匹配的二氧化硅-PEG表面化学性质、标准的商用OPO基础成像系统和简单的线性解混工作流程，并在仿体和体内实验中对性能进行了定量验证。这种扩展的通道数量、探针之间的物理化学匹配、硬件可访问性和明确的定量基准测试的结合，在我们之前了解的PA多重成像研究中尚不存在，这对于推动在应用驱动的生物成像中的更广泛采用非常重要。添加的氧血红蛋白和脱氧血红蛋白分析进一步表明，即使引入了额外的内源性通道，光谱框架仍然具有可解释性，为更大的多通道PA成像迈出了实际一步。尽管有这些优势，这种方法仍有一些重要的局限性和未解决的问题。PS-AuNR3和PS-AuNR4之间的光谱拥挤导致了非常高的多重成像误差，表明对于需要更严格误差容忍度的应用，可能需要通过提高AuNR的均匀性或增加探针之间的光谱间距来进一步缩小峰值。我们的光谱解混框架还假设了线性混合和均匀的光学能量；它没有考虑深度依赖的衰减、波长依赖的能量变化、聚集诱导的等离子体耦合或其他非线性光热效应，所有这些都可能在高度散射或深度嵌入的组织中引入额外的误差。尽管二氧化硅涂层和PEG化提高了胶体稳定性，但在生物环境中聚集诱导的等离子体耦合可能会扩大光谱，因此应该在纵向成像应用中进行监测。此外，体内验证仅限于皮下植入物，没有评估探针的长期生物分布或清除情况。尽管金纳米材料在短期研究中显示出良好的生物相容性，但它们的长期命运仍然是一个关键的转化障碍，因此在临床应用之前，需要进行数月的全面药代动力学和毒理学研究。未来的工作将致力于改进多重平台并向临床相关问题应用发展。首先，通过利用具有更宽调谐范围的激光器（例如600至1100 nm及以上），可以将更多的AuNR探针纳入多重框架中，从而实现六到七个同时通道的更大多重面板。使用现有的四通道多重成像，我们可以将PS-AuNRs的峰值分离距离从约65 nm扩展到>100 nm，进一步减少串扰和估计误差。扩展到NIR-II区域在这方面可能特别有价值，因为其组织光学特性良好。然而，对于基于AuNR的探针来说，将等离子体共振进一步转移到NIR-II通常需要更高长宽比的纳米棒，这在保持窄吸收带、结构稳健性和光稳定性方面可能更难以重现性地合成。其次，虽然我们有意使用NNLS作为简单透明的基线解混方法，但在能量变化较大、背景更复杂或多通道面板的情况下，更先进的框架（如非负矩阵分解或基于机器学习的方法）可能会进一步提高性能。现在，在使用我们的多重平台方面，均匀的二氧化硅表面为附着抗体、肽或小分子配体提供了便利的支架。这使得能够在三维空间中对肿瘤异质性进行多生物标志物映射，实时监测细胞疗法中的细胞动态以及其他复杂的生物事件。四通道光声（PA）复用的一个有前景的未来应用是通过同时成像ER、PR、HER2和EGFR来对异质性乳腺癌进行空间分类。（69）该平台涵盖了乳腺癌亚型的主要临床决定因素，同时结合了一个与基底样疾病相关的补充标志物，从而有可能分辨出单一肿瘤内的混合表型和空间上不同的受体定义的区室。（69,70）在肿瘤内异质性或原发瘤与转移瘤的受体不一致限制了传统基于活检的分类方法的表现力时，这种方法尤其有价值。（70?73）更广泛地说，这种类型的复用PA成像可以揭示不同细胞亚型在肿瘤内的空间组织方式，包括它们在肿瘤核心或边缘的优先定位。在细胞治疗领域，同时可视化多种细胞类型可以提供关于治疗群体间协同作用、竞争或主导地位的机制见解。总的来说，这个平台使得PA复用变得更加可扩展、易于获取，并且具有更高的生物学信息量。通过平衡光谱精度与实用性，该平台为那些需要高保真度、多目标分子成像的应用奠定了基础。

**结论**
在这项研究中，我们开发并验证了一个使用化学和几何结构相同但光谱特征不同的PS-AuNR库的四通道PA复用平台，并结合了简约的硬件和计算基础设施。通过可重复的三步种子介导合成方法，我们精确控制了纳米棒的尺寸，生成了在NIR-I光学窗口内具有窄而离散等离子体共振的颗粒。混合二氧化硅涂层和PEG化处理产生了具有增强光稳定性的造影剂，减少了聚集，并保持了均匀的形态，同时没有妥协光谱分离能力。所得到的PS-AuNR表现出强大的复用能力，在广泛的体外（<4.3%）和体内（3.3%）条件下实现了准确的光谱解混。重要的是，该平台在简单的自定义NNLS工作流程和内置的VevoLAB解混软件中都能实现实际解读，同时显示出来自添加的氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白通道的微小干扰。尽管该平台显著降低了现有PA复用策略的硬件和算法复杂性，但仍存在一些挑战。这些挑战包括提高紧密相邻探针之间的光谱分离能力、解决深度依赖的光学衰减和非线性热效应问题，以及评估长期生物分布和生物相容性。未来的工作将集中在整合先进的解混框架、使用更宽的激光调谐范围来扩展光谱调色板，以及使探针具有分子靶向功能。通过实现多种分子物种的高保真度和最小系统复杂度的同时检测，这项工作为可扩展的实时PA复用奠定了基础。该平台在推进体内分子诊断方面具有巨大潜力，包括高分辨率地绘制肿瘤异质性和监测治疗应用中的多细胞动态。

**方法和实验材料**
十六烷基三甲基铵氯化物（CTAC，25% w/w水溶液）、1-癸醇（n-癸醇，98%）、四氯金酸氢盐三水合物（HAuCl4·3H2O，≥99.9%）、硝酸银（AgNO3，≥99.0%）、对苯二酚（≥99.0%）、L-抗坏血酸（≥99%）、盐酸（HCl）、硝酸（HNO3）、正硅酸四乙酯（TEOS）、正硅酸四甲酯（TMOS）、氢氧化钠（NaOH）、甲醇和硼氢化钠（NaBH4，99%）均从Sigma-Aldrich购买，使用前无需进一步修改。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，VWR）和m-PEG-硅烷（MW：5000，Creative PEGWorks）也用于实验。所有实验中使用的Milli-Q级水的电阻率为18.2 MΩ·cm（25°C）。

**超声和光声成像**
所有实验均在配备有闪光灯泵浦的Q开关Nd/YAG激光器和光参量振荡器（OPO）的商用Vevo LAZR系统上进行，工作波长范围为680–970 nm，步长为2 nm，重复频率为20 Hz，脉冲持续时间为7 ns，峰值脉冲能量为45 ± 5 mJ，照明光斑面积为24 mm2（1 mm × 24 mm）。此外，还提供了制造商报告的系统级PA规格，包括约70 dB的动态范围、约20 ± 10 dB的PA信噪比，以及2D扫描的采集时间为约0.2 s，10 mm 3D扫描的采集时间为74 s。

**伦理批准**
提交的论文中关于动物或人体受试者的实验已获得伦理批准。人类废弃血液由Wilbur Lam实验室在乔治亚理工学院机构审查委员会（IRB编号H23498）批准的临床研究中获取。所有参与者均签署了知情同意书。所有动物实验均获得了乔治亚理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）根据联邦指南A100284的批准。

**AuNRs的有限差分时域模拟**
四种不同AuNRs的光学性质通过FDTD模拟（Lumerical Inc.）进行计算。金的介电常数和反射指数取自Johnson和Christy的数据，周围介质设定为水，周围温度设定为300 K。使用具有600 nm至1000 nm光谱脉冲的总场/散射场源来模拟光与AuNR之间的相互作用。为了获得每种AuNR的光学截面，计算了在不同光偏振角度（包括p偏振和s偏振）下的平均数值。从每种AuNR沿其纵向轴获得的电场分布，突出了电场在尖端区域的定位情况，这些结果指导了其PA成像应用的优化设计。

**微型可调AuNRs的合成**
采用三步合成程序，根据之前发表的方法进行了微型可调AuNRs的合成，并做了一些修改。（65）首先制备两种生长溶液：将CTAB（50 mM，9.111 g）和n-癸醇（13.5 mM，1.068 g）溶解在500 mL Milli-Q级水中（用于AuNR种子）或11 mM，870.5 mg（用于可调AuNRs）。溶液在约60°C下超声处理1小时，以确保n-癸醇完全掺入CTAB胶束中。溶液在16°C以上保持稳定。对于1–2 nm的Au-Seeds，向含有CTAB（50 mM，20 mL）和n-癸醇（13.5 mM）的生长溶液中加入HAuCl4（0.05 M，200 μL）和抗坏血酸（0.1 M，100 μL），并在25–27°C下温和搅拌。1–2分钟后，加入新制备的NaBH4（0.02 M，800 μL），剧烈搅拌。溶液从无色变为棕黄色，表明种子形成。混合物在25–27°C下老化60分钟，以确保过量硼氢化物的完全消耗。随后，为了合成小的各向异性Au-Seeds（21 × 7.5 nm），依次向含有CTAB（50 mM，300 mL）和n-癸醇（13.5 mM）的溶液中加入HCl（1 M，21 mL）、HAuCl4（0.05 M，3000 μL）和抗坏血酸（0.1 M，3900 μL），在25°C下温和搅拌。然后加入1–2 nm的金种子（18 mL），继续搅拌。反应混合物在25°C下静置4小时，得到深灰色溶液，其纵向等离子体共振峰位于约725–735 nm。得到的种子通过离心（12,000 rpm，60分钟）纯化，并重新悬浮在CTAB（10 mM）中。最终调整金浓度至4.65 mM。最后，在28°C下依次向含有CTAB（50 mM，10 mL）和n-癸醇（11 mM）的溶液中加入AgNO3（0.01 M，200 μL）、HAuCl4（0.05 M，100 μL）和抗坏血酸（0.1 M，80 μL）来合成具有可调LSPR带的AuNRs。通过控制HCl和种子悬浮液的体积来调节LSPR峰的位置，LSPR峰范围为600至1000 nm（见表1）。

**AuNRs的混合二氧化硅涂层和PEG化**
基于Gorelikov和Matsuura的现有协议开发了一种共前体介孔二氧化硅涂层方法。（66）使用TMOS和TEOS的组合来平衡水解和缩合速率，以实现快速壳层形成和可控的二氧化硅生长。这种双硅烷方法减少了非目标位置的缩合，并促进了纳米粒子表面的均匀涂层。简要来说，向AuNR溶液（10 mL）中加入NaOH（1 M，10 μL）并不断搅拌，然后一次性注入TMOS（12 μL）。10分钟后，每隔30分钟依次注入TEOS（12 μL），根据AuNR的不同类型进行3次注射。反应在室温下进行约20小时，以促进AuNR周围的均匀二氧化硅壳层形成。所得到的二氧化硅涂层AuNRs（S-AuNRs）通过离心（9000 rpm，10分钟，6次）洗涤，并重新分散在甲醇中。最终的S-AuNRs再分散在95%乙醇中。PEG化是通过将S-AuNRs与过量的PEG 5 K（1 mL，10 mM）孵育过夜来进行的。孵育后，通过离心（9000 rpm，10分钟，4次）洗涤PEG化的颗粒以去除未结合的PEG。然后将PEG化的二氧化硅涂层AuNRs（PS-AuNRs）重新分散在DI水中以供后续使用。

**PS-AuNRs的特性分析**
使用UV–Vis–NIR光谱仪（Evo 220，Thermo Fisher Scientific）分析了PS-AuNRs的光学性质，记录了400至1100 nm范围内的吸收光谱。利用TEM（HT 7700，Hitachi）评估了纳米粒子的大小、形态和分散状态。TEM样品是通过将10 μL纳米粒子溶液滴涂在铜网网格上，然后过夜空气干燥制备的。通过Gatan Digital Micrograph软件分析TEM图像。通过对100个单独纳米粒子进行定量测量，包括长度、宽度和长宽比，以确保统计可靠性。为了评估AuNRs的胶体稳定性，对溶液和比色图像进行了多天的分析。

**AuNRs和PS-AuNRs的PA成像**
使用管状样品（内径3/16英寸，外径5/16英寸；BD INTRAMEDIC聚乙烯管PE#160）在定制的3D打印外壳内进行PA成像和表征。管子中填充了40 μL的每种纳米棒溶液进行分析。PA/US图像使用LZ250线性阵列换能器（256个元件，中心频率21 MHz）和Vevo LAZR系统（FujiFilm VisualSonics）采集。光谱PA成像在680至970 nm波长范围内进行，步长为2 nm。使用DI水负对照的PA强度在相应波长下进行背景减除，以确保信号量化的准确性。PA强度使用VevoLAB 5.7.0软件（FujiFilm VisualSonics）进行分析。对于3D成像，样品在指定波长（690、770、870和940 nm）下以3D模式扫描，步长为0.152 mm，扫描范围为10.21 mm。最终管状样品图像使用最大强度投影（MIP）在冠状平面重建。在校准浓度（12.5%、25%、50%和100%）下对AuNR 1、2、3和4进行了线性测试，以生成各自的剂量-响应曲线。在四个代表性波长（690、770、870和940 nm）处评估了串扰，这些波长对应于每种物质的峰值吸收。使用归一化重叠积分计算了非目标物质相对于目标物质的信号百分比贡献。多路复用算法与分析
开发了一种定制的光谱解混算法，以准确量化多路复用PA成像中每种光谱不同的PS-AuNR对比剂的相对贡献。该算法利用NNLS回归方法，应用于从已知PS-AuNR混合物收集的光谱PA数据，从而能够精确地反卷积重叠的吸收光谱。每种对比剂的已知吸收光谱是通过UV–Vis–NIR分光光度计或Vevo LAZR获得的，并存储在参考数据集中。在相同的测量条件下获得了不同比例的PS-AuNR混合光谱。所有光谱均使用Savitzky–Golay滤波器（三阶多项式，帧大小=15）进行平滑处理，以减少噪声同时保留光谱形状。解混算法在MATLAB中实现，用于解决一个受限优化问题，其中测量的混合光谱(Sm)表示为已知对比剂光谱(Sk)的线性组合：????=??????+??，Sm=SkC+ε，其中C代表每种对比剂的未知贡献，ε表示残差误差。NNLS求解器用于将C限制为非负值，以确保结果的物理意义。为了评估光谱解混的准确性，从计算出的贡献值重建光谱，并与原始混合光谱进行比较。计算了算法估计值与实际混合物组成得到的真实值之间的平均绝对误差(MAE)：??????=1??∑??=1??|????????????????????????????????????。

PS-AuNR混合物的US/PA多路复用评估
准备了31种独特的混合物，使用不同比例的四种不同PS-AuNR（PS-AuNR1至PS-AuNR4）。每种混合物中各成分的真实贡献数据详细列于表S1中。所有混合物的UV–Vis–NIR光谱均使用分光光度计（Evo 220，Thermo Fisher Scientific）记录，然后使用上述多路复用算法分析每种对比剂的贡献。算法经过微调以最小化误差并提高光谱数据反卷积的准确性。对所有31种混合物（680–970 nm，2 nm间隔）进行了光谱US/PA成像。更新后的多路复用算法应用于PA成像数据，以解混不同混合物中四种对比剂的贡献。为每种混合物生成了重建光谱，比较了真实值和估计值，并计算了每种混合物估计贡献的MAE。分析了不同混合物和对比剂的MAE百分比。为了探讨设计参数的影响，将MAE百分比作为以下参数的函数绘制：(1) 每种混合物中的对比剂数量，以评估光谱复杂性的影响；(2) 混合物中对比剂之间的最小光谱间隔（以nm为单位），计算为峰值波长的最小差异；(3) 每种对比剂的真实贡献，以测试浓度是否影响预测误差。此外，还汇总了所有混合物中各对比剂的MAE，以揭示特定对比剂的解混性能。所有分析均使用MATLAB R2020a进行，可视化使用GraphPad Prism实现，适当情况下误差条反映了标准偏差。

细胞培养
对于体外毒性实验，使用人脂肪来源的间充质基质/干细胞（hADMSCs，Lonza Biosciences，瑞士巴塞尔）在α- Minimum Essential Medium (α-MEM)中培养， supplemented with 10% fetal bovine serum和1% penicillin–streptomycin。细胞在37 °C和5% CO2的湿润培养箱（Heracell VIOS 160I，Fisher Scientific）中标准条件下孵育。每3天更换一次培养基，并在约80–90%的汇合度时传代。传代时使用0.05% Trypsin–EDTA分离hADMSCs，用α-MEM中和，离心后用血细胞计计数，最后以大约5000细胞/cm2的密度接种到新鲜的T75或T175培养瓶中。仅使用P4至P8代之间的hADMSCs。

PS-AuNR的体外细胞毒性评估
将hADMSCs以每孔5000个细胞的密度接种到96孔板中，在37 °C和5% CO2条件下培养24小时。随后将细胞与PS-AuNR1、PS-AuNR2、PS-AuNR3或PS-AuNR4在0、0.5、1、2、4、8和16 OD的浓度范围内孵育（每种条件3个独立重复）。过夜孵育后，用PBS彻底洗涤细胞以去除未结合的纳米粒子。然后向每孔加入MTT溶液（0.5 mg/mL）并孵育4小时。形成的甲硝唑晶体溶解在DMSO中，使用plate reader（Synergy HT，BioTek）在590 nm处测量吸光度。细胞活力相对于无纳米粒子的对照组进行量化。

全血背景下的US/PA多路复用评估
为了测试对强内源性吸收物的鲁棒性，将PS-AuNR1–4在人血中重新制备（来自乔治亚理工学院机构审查委员会[IRB] H23498批准的废弃血液），保持相同的总PS-AuNR浓度。对血液和含PS-AuNR的血液混合物（400–1100 nm）进行UV–Vis–NIR光谱分析。样品装载到管状 Phantom中，并在匹配的光谱条件下（Vevo LAZR，532 nm，680–970 nm，2 nm间隔）进行成像。在不同波长下评估PA光谱和PA信号，以评估PS-AuNR在血液存在下的PA性能。

动物研究
所有动物实验均获得乔治亚理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，遵循联邦关于实验室动物护理和使用的指南（协议A100284）。所有实验均使用10–14周大的雌性nu/J小鼠。根据IACUC指南，动物不会连续几天进行成像，每次成像时间限制在4小时内以减少压力。

皮下注射的体内PA多路复用
对于皮下注射，通过离心去除DI水，然后重新悬浮在无菌PBS中制备PS-AuNR溶液。为确保无菌性，溶液在UV照射下处理30分钟。使用异氟烷气体（5%诱导剂量，2%维持剂量）与医用级氧气（0.6–0.8 L/min）麻醉小鼠。含有已知PS-AuNR1至PS-AuNR4混合物（表S3）的注射液（1:1，最终OD = 5）在小鼠背部皮下注射（每种实验条件5个生物学重复）。为了减少动物使用次数，分别在对侧背部进行两组实验（每组4次皮下注射），从而将小鼠数量减少一半。注射前后的注射部位用酒精棉签消毒以降低感染风险。注射仅含生理盐水和含生理盐水的Matrigel作为阴性对照（每种各1次）。皮下注射后立即进行US/PA成像。成像过程中，麻醉小鼠被放置在一个加热的、带驱动装置的平移平台上，配备麻醉锥以保持稳定呼吸和体温。使用LZ250换能器（21 MHz，Vevo LAZR）获取体内皮下US/PA图像（680–970 nm，2 nm间隔）和3D PA成像。

体内多路复用US/PA成像与数据分析
US/PA光谱数据集使用自定义MATLAB流程批量处理。为了提高信号保真度，分多个阶段进行预处理。首先，计算每组数据集中最大PA信号强度的5%作为全局阈值。接下来，对阈值化后的PA堆栈中的每个像素应用Savitzky–Golay滤波器（多项式阶数=3，帧大小=15）以平滑高频噪声，同时保留光谱特征。光谱点不足（<15）的像素保持未平滑状态。从参考电子表格（680–970 nm，2 nm间隔）导入每种对比剂（PS-AuNR1–4）的已知光谱。光谱减去基线以减少组织背景和系统级波长依赖性，并按其最大值进行归一化。在类似深度但位于注射区外的附近组织中放置一个大小相同的背景ROI，然后将得到的深度匹配背景光谱从实验ROI中减去，作为光谱解释和解混的基线校正步骤。对平滑后的3D PA数据集中的每个像素进行NNLS光谱解混，以解出特定对比剂的贡献权重。解混后的特定对比剂贡献图被排列成子图，并附有颜色条形图。为了将原始PA信号与多路复用输出进行比较，从平滑后的PA堆栈生成MIP图像，并使用两种可视化策略与多路复用图像一起显示：(1) 主要对比剂映射，其中每个像素根据具有最高解混贡献的对比剂进行颜色编码；(2) 加性合并，通过将特定对比剂的颜色通道按其归一化贡献值求和来计算RGB叠加图。仅出于显示目的，对所有对比剂和数据集应用单一固定强度阈值和通用可视化缩放，以抑制低水平背景并保持面板间的直接可比性。

动态或图像特定的阈值处理未使用，因为这会导致面板间的调整不一致性。使用自定义色图对每个对比剂的像素强度进行重新缩放（最小值=0，最大值=3800），以标准化不同数据集的视觉输出。创建了比较每种对比剂估计贡献与真实数据的定量图表（n=5）。这些可视化提供了对多路复用成像技术准确性和空间分辨率的全面评估。

多路复用解混的定量准确性评估
实施了一个两部分分析流程，评估每种对比剂的空间定位和信号量化准确性。对于四种PS-AuNR对比剂，手动在二值MIP中绘制感兴趣区域（ROI）掩模以定义真实注射区域。然后通过对每个解混贡献图进行5%的阈值处理，创建空间检测掩模。对于每种对比剂，使用像素级比较检测掩模和真实掩模计算三个性能指标：灵敏度、特异性和精确度。定义如下：TP、FP、FN和TN分别表示真实阳性、假阳性和假阴性像素的数量。这些指标以二进制方式评估空间定位，即像素是否正确分配为存在或不存在。

为了补充二元分类指标，我们还基于信号强度而不是像素存在情况进行了并行分析，使用上述相同的ROI。为了进一步表征脱靶检测，我们报告了归一化的信号泄漏比例，定义为错误分配到FP或FN区域的信号相对于总信号的比例。与灵敏度和特异性不同，这一保守指标能够捕捉到空间分析可能遗漏的微妙光谱泄漏。

VevoLAB内置多路复用器分析
在存在内源性吸收物的情况下
为了评估PS-AuNR多路复用平台在标准商业工作流程中的兼容性和实际应用可行性，还使用内置的VevoLAB多路复用器模块（版本5.7.0，FUJIFILM VisualSonics）分析了选定的光谱PA数据集。使用相应的PS-AuNR基础光谱在VevoLAB中重新分析了相同的代表性皮下数据集。这些参考光谱作为自定义对比通道上传到软件中，并使用平台的原生解混和显示工具进行光谱反卷积。由于VevoLAB多路复用器最多支持五个通道，可以单独分析四个PS-AuNR通道，或者每次添加一个内源性血红蛋白通道（脱氧血红蛋白或氧合血红蛋白）。VevoLAB将多路复用通道作为顺序层叠图显示，给定通道的显眼程度部分取决于其显示顺序。为了保持一致性，采用固定的通道显示顺序生成了多层渲染图像，其中PS-AuNR1、PS-AuNR2、PS-AuNR3和PS-AuNR4依次被叠加。当脱氧血红蛋白或氧合血红蛋白作为额外的通道被包含其中时，它们被放置在渲染堆栈的顶部，以便于观察潜在的内源性背景干扰。还生成了其他层顺序的渲染图像，以研究顺序叠加顺序对视觉解释的影响。在单独的定性测试中，增加了血红蛋白通道的显示强度，以评估在夸张的可视化条件下内源性信号是否可能会掩盖或混淆PS-AuNR信号的解释。

**统计方法：**

对于体外实验，每组实验条件至少进行三次技术重复实验。对于体内实验，每组至少使用五个独立的生物样本（动物）。不同的PS-AuNR合成批次以随机模式使用，并由不同的操作员合成。对于涉及两个组的实验，由于每个样本重复都与其它样本重复独立，且重复数据来自随机过程，因此使用非配对的学生t检验来比较对照组和实验组样本。在对学生t检验之前，对所有数据进行了Jarque-Bera拟合优度检验，以确认偏度和峰度符合正态分布。对于涉及三个或更多组的实验，使用单因素或双因素方差分析（ANOVA）进行比较，并通过后续的Tukey检验（95%置信区间）计算效应大小和置信区间限制（* <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001）。除非另有说明，所有统计分析均使用Microsoft Excel、R或GraphPad Prism 8.0.1（GraphPad Software，美国加利福尼亚州拉霍亚）进行。