高倍折叠均匀扩展显微镜技术揭示了中心的超微结构特征

《ACS Nano》：High-fold Homogeneous Expansion Microscopy Reveals Ultrastructural Centrioles

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超分辨率显微镜通过实现生物分子的纳米级可视化，彻底改变了细胞成像技术。膨胀显微镜（ExM）通过物理方式放大生物样本，提供了一种独立于光学系统的超分辨率方法。然而，现有的单轮高倍数膨胀显微镜方法在保持超微结构一致性方面的有效性很少得到验证。在这里，我们介绍了高倍数均匀膨胀显微镜（hiHomoExM），这是一种单轮膨胀显微镜技术，能够在包括中心体、核孔复合体和其他细胞器在内的多种目标上实现大约8-9倍的均匀膨胀，同时保留其超微结构。hiHomoExM简化了样品制备过程，并支持膨胀后的标记，从而实现了高标记密度和结构保留。此外，我们通过将其整合到迭代膨胀框架中，进一步提高了其空间分辨率。值得注意的是，将 hiHomoEx 与单分子定位显微镜（hiHomoEx-dSTORM）结合使用，可以解析以前难以观察到的中心体超微结构，如 CEP44 的排列、CCDC77 的微管相关模式以及 SAS6 的典型9倍对称性。hiHomoExM 和 hiHomoEx-dSTORM 共同提供了一个稳健且易于使用的平台，支持约2纳米分辨率的表征，为连接物理超分辨率和光学超分辨率方法、推进细胞结构分析提供了基础。

**引言**
超分辨率显微镜（SRM）通过以纳米级精度识别和定位生物分子，彻底改变了细胞生物学。通过超越衍射极限，诸如刺激发射耗尽显微镜（STED）(1) 和单分子定位显微镜（SMLM；例如 (f)PALM, (d)STORM, (DNA-)PAINT, 和 MINFLUX) (2?7) 等技术将空间分辨率提升到了纳米级别，推动了荧光纳米显微镜领域的发展。除了基于光学的方法外，膨胀显微镜（ExM）(8?10) 作为一种强大的超分辨率策略也应运而生，它依赖于样品制备而非光学操作。通过物理上放大生物样本，ExM 使传统显微镜能够实现生物分子的超分辨率可视化。特别是，膨胀后的标记方法具有多个优势，包括更高的标记密度、更低的连接错误率以及防止荧光团在预标记过程中降解。由于 ExM 与基于光学的 SRM 技术无关，因此将这两种方法结合（Ex-SRM）可以实现分子级别的分辨率。在各种 Ex-SRM 方法中，如 Ex-STED, (11) Ex-SOFI, (12,13) Ex-SIM, (14) 和 Ex-SRRF (15,16)，Ex-SMLM (17?20) 显示出最高的分辨率潜力，显著推动了纳米级生物学研究。
在过去十年中，已经开发了许多适用于不同生物学应用的膨胀策略。这些方法通常涉及将样本嵌入可膨胀的水凝胶中，然后在样本均匀化后理想地均匀膨胀凝胶。因此，有效空间分辨率与膨胀因子成比例提高。通过修改水凝胶化学组成，例如降低丙烯酰胺（AA）基凝胶配方中的交联剂浓度或添加 N,N-二甲基丙烯酰胺（DMAA），膨胀因子可以从最初的4倍（4x）(8,10,21,22) 提高到大约10倍 (13,23?25)。迭代膨胀技术进一步将膨胀上限提升到20倍以上 (26?28)，显著提高了有效空间分辨率，尽管实验复杂性也随之增加。最近，在缺氧条件下对基于DMAA的凝胶化学进行修改，实现了单轮20倍膨胀，其性能可与迭代方法相媲美，如20ExM所示 (29)。然而，为了实现更高的膨胀因子而付出的努力很少关注亚细胞超微结构的表征。尽管 U-ExM (约4倍) (22) 已经证明了其在中心体中的超微结构保留能力——中心体是一种体积极小的细胞器，用传统方法难以解析——但高倍数膨胀显微镜的有效性仍有待充分验证和系统研究。
为此，我们致力于开发一种能够保留亚细胞超微结构的高倍数膨胀显微镜方法。在这里，我们介绍了高倍数均匀膨胀显微镜（hiHomoExM），它能够在凝胶、细胞和细胞器中实现均匀的8-9倍膨胀，同时保留超微结构细节。这使得可以利用传统显微镜特异性地可视化中心体的手性。凭借其样品处理和凝胶操作的简便性以及保持分子完整性的能力，标记后的 hiHomoExM 成为与基于光学的 SRM 结合进行超微结构研究的有前景的平台。通过将 hiHomoEx 与 dSTORM 结合使用，我们实现了约2纳米的有效分辨率，揭示了中心体 proximal 区域中 CEP44 的周期性堆叠结构。我们的成像还揭示了 CCDC77 的超微结构定位，其显示出明显的微管连接模式。此外，我们成功解析了 SAS6 的典型9倍对称性，即中心体的车轮结构。总体而言，hiHomoExM 和 hiHomoEx-dSTORM 为通过光学方法探索超微结构提供了强大的工具。

**结果与讨论**
**高倍数均匀膨胀显微镜 (hiHomoExM)**
为了通过样品膨胀促进蛋白质复合体的超微结构研究，我们开发了一种策略，旨在实现高膨胀因子（EF）的同时均匀保留超微结构细节（图1a）。为了使大多数实验室易于操作，我们设计了简单的实验流程，采用单轮膨胀、简化实验步骤，并使用市售材料制成的易于处理的水凝胶。为了评估其性能，我们选择了人类中心体作为参考对象，因为它具有明确的尺寸（长度约500纳米，宽度约200纳米），并且已经通过光学 SRM 和电子显微镜（EM）进行了广泛研究 (19,30?38)。此外，我们还使用了 U-ExM (22) 作为基准，这是一种已建立的膨胀协议，其膨胀因子约为4倍，以其在纳米尺度上保持超微结构信息的特性。

**图1**
图1. hiHomoExM 工作流程和中心体超微结构的比较成像。(a) hiHomoExM 工作流程的示意图，突出显示了优化步骤。(b) 使用 U-ExM、Magnify 和 hiHomoExM 获得的代表性图像进行比较。中心体蛋白用乙酰化微管（Ac-tub，绿色；AF488）和远端附属蛋白 FBF1（品红色；CF568）进行免疫标记。比例尺，1 μm。

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鉴于需要更大的膨胀效果和易于处理的凝胶，Magnify (13) 成为了理想的候选者。通过在基于 AA 的凝胶配方中添加少量的 DMAA（一种作为凝胶骨架和交联剂的双功能单体），Magnify 提高了凝胶的硬度和膨胀因子。尽管 Magnify 的平均凝胶膨胀因子约为9.6倍（图 S1a,b），但所得到的中心体标记图像显示的细胞膨胀效果较低，相当于 U-ExM（Ac-Tub，图1b）观察到的4倍膨胀效果。这种差异表明凝胶膨胀因子与实际细胞结构的膨胀之间存在不匹配。当使用远端附属蛋白 FBF1 作为参考时也观察到了类似的不一致性（图1b）。
为了解决这个问题，我们开发了一种标记后的膨胀协议，其膨胀因子是 U-ExM 的两倍，同时保持超微结构完整性。这种方法称为高倍数均匀膨胀显微镜（hiHomoExM），在整个凝胶中表现出一致的膨胀因子。该协议结合了现有各种 ExM 方法的关键优势，在锚定、凝胶化和变性步骤中进行了有针对性的优化（优化 ①–⑥）。值得注意的是，hiHomoExM 的分辨率和标记精度提高了8倍，使得可以使用常规落射荧光显微镜直接观察到中心体三联体的典型9倍对称排列（图1b）。以下部分将详细介绍该协议的开发和优化细节。

**优化 DMAA 浓度以实现均匀膨胀**
在通过向基于 AA 的凝胶配方中添加 DMAA 来提高凝胶硬度的基础上，我们首先评估了不同 DMAA 浓度对两个关键指标的影响：膨胀前后凝胶的宏观尺寸和中心体的纳米尺度尺寸，并与标准化的 U-ExM 测量结果进行了对比。我们测试了从2%到12%的 DMAA 浓度范围。在2%浓度时，凝胶的硬度不足；而超过12%的浓度可能导致丙烯酸钠溶解不完全，从而影响成像质量（图 S2）。随着 DMAA 浓度的增加，我们观察到宏观（凝胶）和纳米（中心体）膨胀因子之间的对齐性得到改善（图2a,b）。这些结果表明，更高的 DMAA 浓度可以使得从凝胶层面到亚细胞结构的膨胀更加均匀，实现了6-7倍的膨胀（图2b）。将膨胀后的中心体尺寸归一化到平均凝胶膨胀因子后，进一步证实了 U-ExM 和优化后的 hiHomoExM（Opt. ①）凝胶配方（含12% DMAA）之间的结构一致性（图2c）。此外，12% DMAA 配方的硬度优于 Magnify 方案中使用的4%配方（图2b 和 S3a,b），提高了机械处理性和与其他基于光学的 SRM 技术的兼容性。综合这些发现，我们确定了最佳的 DMAA 浓度（例如12%），以确保从宏观到纳米尺度的均匀膨胀。

**图2**
图2. 优化 DMAA 浓度以获得精细的凝胶和超微结构膨胀。(a) 染色 Ac-tub（灰色；AF488）的中心体的代表性宽场图像。样品分别使用 U-ExM、Magnify（4% DMAA）和 hiHomoEx（Opt. ①；8% 和 12% DMAA）进行膨胀。比例尺，1 μm。(b) 不同 DMAA 浓度下的中心体膨胀因子（EFs）和凝胶膨胀因子（EFs）的比较。圆圈和三角形分别代表中心体 EFs 和凝胶 EFs。凝胶 EFs 的平均值 ± 标准差：U-ExM 为 4.3 ± 0.03（n = 4），Magnify（4% DMAA）为 9.6 ± 0.16（n = 4），hiHomoEx（Opt. ①；8% DMAA）为 6.8 ± 0.07（n = 4），hiHomoEx（Opt. ①；12% DMAA）为 6.6 ± 0.03（n = 4）。中心体 EFs 的平均值 ± 标准差：U-ExM 为 4.3 ± 0.27（n = 20个中心体/条件），Magnify（4% DMAA）为 5.7 ± 0.73（n = 20个中心体/条件），hiHomoEx（Opt. ①；8% DMAA）为 6.1 ± 0.48（n = 20个中心体/条件），hiHomoEx（Opt. ①；12% DMAA）为 6.6 ± 0.42（n = 20个中心体/条件）。统计分析采用双向 ANOVA 进行。(c) 通过将测量直径除以相应的平均凝胶膨胀因子来计算标准化的中心体直径，以估计膨胀前的尺寸。中心体直径的平均值 ± 标准差：U-ExM 为 192.1 ± 12.3 nm，Magnify（4% DMAA）为 114.2 ± 14.6 nm，hiHomoEx（Opt. ①；8% DMAA）为 174.8 ± 13.7 nm，hiHomoEx（Opt. ①；12% DMAA）为 194 ± 12.4 nm。统计分析采用单因素 ANOVA 进行；p 值仅显示显著差异。

**hiHomoExM 实现信号保留和高膨胀保真度**
在 DMAA 浓度固定的情况下为12%的情况下，我们研究了降低交联剂 Bis 浓度是否能够提高膨胀因子，正如早期研究（23,25）中所报告的。有趣的是，我们发现当低浓度的 Bis 与较低水平的自由基引发剂/加速剂（APS/TEMED）结合使用时，膨胀效果有所增强。最佳条件为 0.0001% Bis 和 0.15% APS/TEMED，在空白凝胶中实现了大约8倍的膨胀（图3a）。关键的是，从宏观到纳米尺度的膨胀因子保持一致，这一点通过 dSTORM 成像得到了验证（图3b,c）。为了评估超微结构膨胀的保真度，我们还确定了从两种不同中心体结构测得的直径比（图3b,d）。与 dSTORM 和 U-ExM 的交叉验证确认，这些优化条件保持了超微结构的准确性。值得注意的是，图像显示远端附属蛋白标记物（FBF1）和中心体标记物（Ac-Tub）的放大倍数相比 U-ExM（图3b）明显增加了2倍。

**图3**
图3. 为获得均匀超微结构膨胀，系统优化了 hiHomoEx 中的凝胶组成、锚定和变性条件。(a) 在不同 Bis 和 APS/TEMED 浓度下测量的凝胶膨胀因子。0.01% 和 0.0001% Bis 分别与 0.5%、0.25% 和 0.15% APS/TEMED 结合使用，基于 hiHomoEx（Opt.①；12% DMAA）凝胶配方。凝胶膨胀因子的平均值 ± 标准差：0.01% Bis：6.3 ± 0.04（0.5% APS/TEMED），6.6 ± 0.08（0.25% APS/TEMED），7.1 ± 0.07（0.15% APS/TEMED）；0.0001% Bis：6.4 ± 0.04（0.5% APS/TEMED），7.1 ± 0.08（0.25% APS/TEMED），7.9 ± 0.04（0.15% APS/TEMED）。(b) 使用 U-ExM 和 hiHomoEx（Opt.②）标记的 Ac-tub（绿色；AF488）和 FBF1（品红色；CF568）的中心体蛋白的代表性宽场图像。(c,d) hiHomoEx（Opt.②）中膨胀均匀性的评估。(c) FBF1 和凝胶的 EFs 的比较分析。圆圈和三角形分别代表 FBF1 和凝胶 EFs。BFB1 EF 的平均值 ± 标准差：未膨胀的 dSTORM 为 1.0（n = 19），hiHomoEx Opt.② 为 8.0 ± 0.66（n = 30）；凝胶 EF 的平均值 ± 标准差：hiHomoEx Opt.② 为 8.1 ± 0.16（n = 4）。(d) 从顶视图像测量的 FBF1 环直径与中心体直径的比率。比率的平均值 ± 标准差：U-ExM 为 2.04 ± 0.08（n = 10），hiHomoEx Opt.② 为 1.97 ± 0.05（n = 10）。统计分析采用非配对的双尾 t 检验进行。(e) 在两种锚定条件下标记的 Ac-tub（灰色；AF488）的中心体的代表性宽场图像：(i) 在凝胶化步骤中包含甲基丙烯酸甲酯且没有单独的锚定步骤（hiHomoEx Opt.②），以及 (ii) 在凝胶化步骤之前单独添加甲基丙烯酸甲酯（hiHomoEx Opt.③）。Anchr.，锚定；Gela.，凝胶化；MAL，甲基丙烯酸甲酯。(f) 在不同甲基丙烯酸甲酯锚定时间内标记的 Ac-tub（灰色；AF488）的中心体的代表性宽场图像。所有样品均使用变性缓冲液1在80°C下变性6小时。（g）从（f）中量化中心粒直径。直径的平均值±标准差：1246.6 ± 102.3 nm（3分钟，n = 15），1420.9 ± 101.9 nm（7分钟，n = 25），1414.2 ± 67.5 nm（10分钟，n = 20），1208.9 ± 104.8 nm（20分钟，n = 15），940.9 ± 101.9 nm（3小时，n = 15）。（h）在不同变性缓冲液、温度和持续时间下用Ac-tub标记的中心粒的代表性图像。所有固定步骤均在37°C下进行7-10分钟。（i）从（h）中量化归一化后的中心粒直径，使用U-ExM作为参考。归一化直径的平均值±标准差：193.5 ± 12.4 nm（U-ExM，95°C 1.5小时，缓冲液2 pH 8.8，n = 20），171.2 ± 12.3 nm（80°C 6小时，缓冲液1，n = 25），175.2 ± 12.1 nm（85°C 6小时，缓冲液1，n = 26），191.5 ± 19.2 nm（hiHo., 85°C 1.5小时，缓冲液2 pH 6.8，n = 29），217.4 ± 21.5 nm（85°C 6小时，缓冲液2 pH 6.8，n = 18），172.9 ± 14.0 nm（85°C 1.5小时，缓冲液2 pH 8.8，n = 20），以及216.3 ± 26.1 nm（85°C 6小时，缓冲液2 pH 8.8，n = 20）。hiHo., hiHomoExM；*表示样品裂纹伪影。使用单因素ANOVA对（g）和（i）进行统计分析：仅显示具有显著性的比较的p值，非显著性结果省略。比例尺，1 μm（b, e, f, h）。

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在成功实现均匀性的情况下，FBF1的荧光信号得到了很好的保留；然而，不连续的Ac-Tub信号表明需要进一步优化。尽管将甲基丙烯酸甲酯（一种将生物分子连接到凝胶的小分子）加入凝胶化步骤中可以消除单独固定的需要，但我们的结果显示，当固定和凝胶化作为独立步骤进行时，结构完整性得到了改善（图3e）。进一步研究甲基丙烯酸甲酯的固定时间发现，在最佳孵育期间，中心粒的扩张与凝胶的扩张非常吻合。相比之下，过长的固定时间会导致扩张不完全，这可能是由于甲基丙烯酸甲酯引起的过度固定效应（图3f,g）。

最后，我们评估了不同变性条件对样品扩张的影响。基于先前报道的方案（缓冲液1:10% (w/v) SDS，8 M尿素，25 mM EDTA，2x PBS，pH 7.5，在80°C下保温6小时），（13）我们首先提高了变性温度。在85°C下观察到EF的适度改善，而在90°C下处理则导致信号显著丢失（图3h,i）。我们还测试了另一种变性缓冲液（缓冲液2:200 mM SDS，200 mM NaCl，和50 mM Tris）（22,23,26,41），在85°C下两种pH条件下和不同的孵育时间进行了测试。值得注意的是，在pH 6.8下较短的处理时间获得了最佳结果，平衡了扩张因子和荧光信号保留（图3h,i）。

总的来说，hiHomoExM展示了优化的水凝胶组成、固定策略和变性条件（见方法部分），为高倍数扩张显微镜提供了可靠且易于使用的方法。

hiHomoExM在扩张过程中保留中心粒结构

为了验证经过一系列优化后的最终hiHomoEx的扩张均匀性，我们从多个角度进行了全面评估。首先，我们通过比较宏观凝胶水平和蛋白质水平上的扩张因子来评估均匀性，使用的是远端附属蛋白FBF1。与dSTORM成像的完整细胞结构进行对比后发现，hiHomoExM在这两个水平上都保持了统一的扩张因子，而Magnify则显示出两者之间的差异（图4a,b）。值得注意的是，使用hiHomoExM获得的生物尺寸与dSTORM测量的典型FBF1直径非常吻合（图4c）。其次，为了进一步确认不同中心粒区室间的纳米级扩张均匀性，我们计算了FBF1（远端附属物）直径与中心粒核心（Ac-Tub）的比率。这一比率从hiHomoExM样品中测得，准确反映了中心粒的结构，并且与U-ExM的测量结果相当，而Magnify的结果明显较低（图4d,e）。

图4

图4. U-ExM、Magnify、hiHomoEx和dSTORM之间的超微结构均匀性比较。（a）使用U-ExM、Magnify、hiHomoEx和dSTORM成像获得的FBF1（洋红色；CF568）的代表性图像。（b）使用dSTORM作为未扩张参考的凝胶和FBF1的扩张因子。FBF1扩张因子的平均值±标准差：4.3 ± 0.31（U-ExM，n = 30），4.5 ± 0.67（Magnify，n = 30），8.3 ± 0.89（hiHomoEx，n = 30），以及1（dSTORM，n = 19）。凝胶扩张因子的平均值±标准差：4.3 ± 0.03（U-ExM，n = 4），9.6 ± 0.16（Magnify，n = 4），以及8.3 ± 0.16（hiHomoEx，n = 4）。使用双因素ANOVA进行统计分析。（c）通过相应的平均凝胶EF归一化的FBF1直径以估计扩张前的尺寸（dSTORM除外）。平均值±标准差：404.5 ± 29.1 nm（U-ExM，n = 30），188.1 ± 28.2 nm（Magnify，n = 30），401.6 ± 43.2 nm（hiHomoEx，n = 30），以及403.2 ± 31.5 nm（dSTORM，n = 19）。（d）通过U-ExM、Magnify和hiHomoEx扩张后染色的中心粒蛋白（绿色；Alexa Fluor 488）和FBF1（洋红色；CF568）的代表性图像。（e）使用U-ExM作为参考，从顶部视图测量的FBF1与中心粒直径的比率。平均值±标准差：2.04 ± 0.08（U-ExM，n = 10），1.59 ± 0.11（Magnify，n = 10），以及1.98 ± 0.06（hiHomoEx，n = 10）。在（c）和（e）中使用单因素ANOVA进行统计分析。仅显示具有显著性的比较的p值。比例尺，1 μm（a, d）。

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为了进一步确认hiHomoExM保持了均匀的扩张，我们量化了未扩张和扩张样品中远端附属蛋白的径向对称性。观察到的组织结构与之前研究中报道的蛋白质依赖性变化一致（37,42），并使用U-ExM再次得到验证（图S4）。这反映了分辨率依赖性的圆形度差异（图S5），表明hiHomoExM以接近dSTORM分辨率的方式保留了分子结构。我们还检查了中心粒的方向，发现即使在不同的观察角度下也能观察到保存良好的中心粒结构；然而，只有在精确的轴向视图中才能实现近乎完美的圆形，而即使是相对于成像平面的轻微倾斜也会使环状结构在投影中显得椭圆或不那么圆形（图S6）。这些分析共同证明，hiHomoExM在整个细胞中实现了均匀的扩张，同时忠实地保留了不同中心粒区室内的分子组装的空间结构。因此，hiHomoExM成为研究中心粒超微结构的一个强大工具。

hiHomoExM和iU-hiHomoExM揭示了多样的亚细胞结构

为了进一步展示hiHomoExM的广泛用途，我们评估了其在多个亚细胞目标上的性能，包括微管（α-tubulin）、高尔基体（GM130）、线粒体（TOMM20）和核孔复合体（NUP96）（图5和6）。在这些结构中，与扩张前的成像相比，hiHomoExM的有效分辨率提高了约8-9倍，使得之前无法辨别的结构特征得以可视化。特别是，成束的微管纤维和标记有TOMM20的线粒体外膜清晰可见，显示出增强的纳米级结构细节（图5a,c）。

图5

图5. hiHomoExM对多种细胞结构的通用适用性。（a）用α-tubulin（灰色；CF568）标记的微管的代表性扩张前和hiHomoExM图像；白色框表示扩张前放大视图中的区域。比例尺，500 nm。（b）用GM130（青色热色；AF647）标记的高尔基体的代表性扩张前和hiHomoExM图像。比例尺，2 μm。（c）用TOMM20（洋红色热色；CF568）标记的线粒体外膜的代表性扩张前和hiHomoExM图像。比例尺，2 μm。所有比例尺均以生物尺寸显示。

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图6

图6. 核孔复合体的均匀扩张及hiHomoExM与迭代扩张的兼容性。（a）使用扩张前成像、dSTORM、hiHomoExM和U-ExM获得的NUP96（U2OS-NUP96-mEGFP细胞；灰色；CF568）标记的核孔复合体的代表性图像；白色虚线框表示dSTORM放大视图中的区域。比例尺，100 nm。（b）iU-hiHomoExM的第一凝胶和最终凝胶的图像。（c）在iU-hiHomoExM的第一凝胶中用NUP98-96（灰色；CF568）标记的NUP96的代表性图像。比例尺，100 nm。（d）用NUP98-96（灰色；CF568）标记的iU-hiHomoExM中的NUP96的代表性图像；放大图像对应于白色虚线框。比例尺，100 nm。（e）使用hiHomoExM量化归一化的NUP96直径。归一化直径的平均值±标准差：101 ± 11.3 nm。（f）使用iU-hiHomoExM量化归一化的NUP96直径。归一化直径的平均值±标准差：95.7 ± 7.1 nm。

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接下来，我们使用核孔复合体成分NUP96来评估超微结构的保真度，NUP96是超微结构测量的一个公认参考。在包括扩张前成像、dSTORM和使用hiHomoExM的U-ExM在内的各种成像模式中观察到了相似的核孔尺寸（图6a）。使用hiHomoExM测量的归一化NUP96直径（约101 nm）与之前报道的电子显微镜值（约107 nm，（43,44）非常接近，（43,44）表明扩张后原生态超微结构尺寸得到了忠实的保留（图6e）。此外，我们还展示了hiHomoExM与更高阶扩张策略的兼容性。通过将hiHomoExM与迭代U-ExM（iU-hiHomoExM）结合，我们实现了大约30倍的总体扩张因子，同时保持了凝胶和嵌入结构的均匀扩张，NUP96的归一化直径约为95 nm，与单独使用hiHomoExM获得的测量结果一致（图6b–d,f）。值得注意的是，这种混合的iU-hiHomoExM方法能够在非常高的扩张因子下可视化NUP98-96标记的核孔复合体，清晰地分辨出NUP96的八个角点（图6d）。这些结果共同证明，hiHomoExM能够在保持亚细胞结构一致性的同时，实现高分辨率成像。

hiHomoEx-dSTORM阐明中心粒超微结构

最后，我们使用hiHomoExM研究了从远端到近端的中心粒蛋白（图7a–c）。这种方法使得在传统荧光显微镜下通常无法区分的多个超分辨率结构特征变得可见，包括环状结构、9倍对称性以及顶部视图中的中心粒手性，以及在侧视图中不同的纵向蛋白分布（图7a）。为了进一步评估超微结构的保存情况，我们在特别优化的重新嵌入条件下对hiHomoEx处理的细胞进行了dSTORM成像（图7d, S7和S8a,b）。我们首先检查了中心粒远端腔蛋白C2CD3的组织结构，比较了UEx-dSTORM和hiHomoEx-dSTORM的结果。虽然UEx-dSTORM显示了预期的C2CD3的9倍对称模式，但hiHomoEx-dSTORM揭示了每个C2CD3簇内的额外点状结构，表明了更细微的亚结构细节（图7e和S9）。接下来，我们研究了中心粒的近端，许多超微结构特征以前已经通过电子显微镜进行了表征（45?47）。具体来说，我们成像了位于车轮状结构到微管三联体连接处的CEP44（48?50）。我们的结果显示，CEP44在纵向分布中广泛定位（图7a,b）。令人惊讶的是，hiHomoEx-dSTORM成像表明CEP44的排列可能反映了车轮状结构的周期性（图7f和S10a）。进一步的定量傅里叶分析显示，CEP44点状结构之间的间距约为26 nm，这与之前电子显微镜研究观察到的周期性一致（图7g,h）（45）。此外，凭借所达到的分子分辨率，我们成功解析了车轮状结构的典型9倍对称性，其直径约为90 nm（SAS6-C末端，图7i和S10c）。为了进一步了解微管三联体相互连接的中心粒复合体，我们进行了双色hiHomoEx-dSTORM成像。显著的是，结果揭示了CCDC77在连接一个三联体的C微管到相邻三联体的A微管之间的超微结构细节（图7j和S10b）。这些发现共同证明了hiHomoEx-dSTORM能够以高保真度可视化中心粒的超微结构。

图7

图7. 揭示纳米级细节：hiHomoEx-dSTORM和宽场成像显示了中心粒蛋白的周期性模式和结构组织。（a）从顶部视图到侧视图不同方向捕获的中心粒蛋白的hiHomoExM图像，如中心粒示意图所示。比例尺，250 nm。（b）使用UEx-dSTORM和hiHomoEx-dSTORM捕获的中心粒蛋白（洋红色；AF488）的双色代表性图像，其中acetylated α-tubulin（Ac-tub，绿色；CF568）作为结构参考，从顶部、倾斜和侧视图捕获。示意图指示了相应的中心粒方向。比例尺，250 nm。（c）描绘（a,b）中显示的结构示意图。（d）Ex-dSTORM的工作流程示意图，概述了从扩张到dSTORM成像的关键步骤。（e）使用UEx-dSTORM和hiHomoEx-dSTORM捕获的C2CD3的代表性顶部视图图像。标尺，60纳米。（f–h）CEP44的周期性分析。（f）CEP44的代表性侧视图hiHomoEx-dSTORM图像，白色虚线框突出显示了周期性模式。标尺，100纳米。（g）CEP44周期性模式的快速傅里叶变换（FFT）平均堆栈。红色箭头表示CEP44周期性的特征频率。（h）通过FFT分析确定的CEP44的标准化周期长度。平均值 ± 标准差：26.7 ± 1.7纳米（N = 9个中心体，n = 54个间隔）。（i）SAS6 C末端的代表性hiHomoEx-dSTORM图像（CF568；绿色），从倾斜角度看，与乙酰化微管（Ac-tub，AF647；洋红色）的宽场图像合并。标尺，200纳米。（j）Ac-tub（AF647；洋红色）和CCDC77（CF568；绿色）的双色hiHomoEx-dSTORM图像，顶部视图。标尺，100纳米。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

在这项研究中，我们开发了hiHomoExM，这是一种简单而有效的高倍扩展显微镜方法，可以保留蛋白质复合物的超微结构。通过优化关键参数，包括水凝胶配方、分子锚定和变性条件，hiHomoExM实现了凝胶-样品复合体约8倍的均匀扩展。此外，采用扩展后标记策略提高了表位的可访问性，从而提高了标记效率并增加了标记密度（图S11）。重要的是，它能够可视化传统3-4倍ExM技术无法访问的超微结构特征。这些特征包括中心体蛋白的典型9倍对称性和中心体手性（CEP44和Ac-Tub；图7a和S12a,b）。此外，凝胶改进的机械稳定性使其与各种成像模式兼容，并便于样品处理。hiHomoExM的凝胶组成也作为迭代ExM中的第二轮扩展候选者具有潜力，因为其刚性和高扩展因子（图6b–d）。此外，通过加入快速甲基丙烯酸酯基锚定步骤，总体样品准备时间大大缩短，该过程可在10分钟内完成（图S13和表S1）。

作为进一步的进步，将hiHomoExM与dSTORM结合，通过优化的重嵌入程序实现（图S8a,b），可以解析相距仅2-3纳米的生物分子。这种方法利用了高空间分辨率和精确的分子标记来揭示超微结构细节。使用hiHomoEx-dSTORM，我们观察到：有趣的是，CCDC77表现为连接相邻微管三联体的连接器，而CEP44在近端表现出周期性分布（图7f–h,j），这是传统光学方法无法看到的。这些发现利用了超微结构保存与hiHomoEx-dSTORM高分辨率之间的协同作用。

另一方面，扩展因子可能因水凝胶和细胞组分、不同细胞器之间甚至在同一细胞器内的不同区域而有所不同。虽然hiHomoExM主要是使用中心体作为超微结构模型进行验证的，但我们的结果表明该方法广泛适用于各种亚细胞结构。这表明hiHomoExM中使用的凝胶化学和处理条件建立了一个稳定且均匀的扩展环境，能够在不同的细胞结构中保持结构组织。然而，由于细胞器在蛋白质组成、密度和超微结构组织方面存在差异，可能仍需要针对特定目标优化锚定、变性或染色条件。总体而言，这些发现使得hiHomoExM成为一种通用的超微结构成像框架，同时保留了适应不同生物系统的灵活性。

总之，hiHomoExM是一种实用且稳健的单轮高倍扩展方法，可以保留蛋白质复合物的超微结构完整性。除了使用传统荧光显微镜进行超分辨率成像外，hiHomoExM与dSTORM结合使用时还能进一步揭示分子细节。这种样品准备和SMLM基成像的进步为在超微结构水平上研究细胞生物学提供了有价值的工具。

材料
试剂
甲醇（methanol，15306121，Macron），磷酸盐缓冲盐水（10X PBS，70011044，Gibco），多聚甲醛（PFA，16%，15710，Electron Microscopy Sciences），戊二醛（GA，8%，16020，Electron Microscopy Sciences），甲基丙烯酸甲酯（MAL，96%，043124.AA，Thermo Fisher Scientific），N,N-二甲丙烯酰胺（DMAA，99%，274135，Sigma-Aldrich），丙烯酸钠（SA，97%，408220，Sigma-Aldrich），丙烯酰胺（AA，40%，A4058，Sigma-Aldrich），N,N'-亚甲基双(丙烯酰胺)（Bis，2%，M1533，Sigma-Aldrich），N,N'-（1,2-二羟乙基）-双(丙烯酰胺)（DHEBA，98%，D2864，TCI Chemical），丙烯酰胺/双丙烯酰胺（30%，29:1，1610156，Bio-Rad），N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED，1610801，Bio-Rad），过硫酸铵（APS，1610700，Bio-Rad），十二烷基硫酸钠（SDS，0227，VWR Life science），氯化钠（NaCl，31434，Sigma-Aldrich），乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA，0.5M，E7889，Sigma-Aldrich），尿素（U5378，Sigma-Aldrich），Tris（1.5M，pH 8.8，J831，VWR Life science），Tris（0.5M，pH 6.8，J832，VWR Life science），牛血清白蛋白（BSA，A9647，Sigma-Aldrich），Tween 20（P137，Sigma-Aldrich），Triton X-100（T8787，Sigma-Aldrich）。

抗体
本研究中使用的一抗的详细信息见表S2。本研究中使用的二抗包括Alexa Fluor 647（1/100稀释度，抗小鼠A31571，抗兔A31573，抗山羊A-21447；Thermo Fisher Scientific），CF568（1/100稀释度，抗小鼠20105，抗兔20098；Biotium），Alexa Fluor 488（1/100稀释度，抗小鼠A21202；Thermo Fisher Scientific）。

细胞培养
人视网膜色素上皮细胞（hTERT RPE-1，ATCC-CRL-4000）在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/F-12和HEPES（1:1；Gibco，Thermo Fisher Scientific，11330-032）中培养，温度为37°C，置于5% CO2的 humidified 孵育箱中，添加10%胎牛血清（FBS，Hyclone，SH3010903）、碳酸氢钠（NaHCO3，S6014，Sigma-Aldrich）和1%青霉素-链霉素。U2OS-CRISPR-NUP96-mEGFP细胞（Cytion，300174）在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中培养，添加GlutaMAX（Gibco，Thermo Fisher Scientific，10566-016），温度为37°C，置于5% CO2的 humidified 孵育箱中，同样添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。这两种细胞系分别接种在涂有聚-L-赖氨酸的12毫米盖玻片上用于扩展显微镜观察，以及在18毫米盖玻片上进行dSTORM或扩展前的成像。然后根据目标蛋白质和成像方式使用适当的固定条件固定细胞（表S3）。

hiHomoEx
固定后，将带有盖玻片的细胞在37°C下用0.1%（v/v）的甲基丙烯酸甲酯固定7-10分钟。接下来，吸出固定液并用1x PBS清洗样本两到三次（每次5分钟）。然后将每个盖玻片浸泡在凝胶单体溶液中（12%（v/v）DMAA，34%（w/v）SA，10%（w/v）AA，0.0001%（w/v）Bis，1%（w/v）NaCl和1x PBS）。APS和TEMED的最终浓度均为0.15%（w/v），并在37°C下进行凝胶化1小时。凝胶化完成后，将带有水凝胶的盖玻片放入新鲜变性缓冲液（200 mM SDS，200 mM NaCl，50 mM Tris（pH6.8）中，在室温下处理直至水凝胶从盖玻片上分离。随后将水凝胶在85°C的新鲜变性缓冲液中孵育1.5小时。变性后，将水凝胶在室温下用1x PBS清洗三次，并在新鲜ddH2O中至少扩张五次（每次20分钟），轻轻摇晃直至水凝胶完全扩张，然后在ddH2O中孵育过夜。整个过程总结在表S3中。（注意：不同品牌或批次的丙烯酸钠可能略微影响锚定和变性步骤的最佳条件。）

U-ExM
固定后，将盖玻片样品在37°C下用灌注液（1.4% PFA和2% AA）孵育5小时。接下来，吸出灌注液并用1x PBS清洗样本两到三次（每次5分钟）。然后将每个盖玻片浸泡在U-ExM单体溶液中（19%（w/w）SA，10%（w/w）AA，0.1%（w/w）Bis），并在37°C的 humidified 室中加入APS和TEMED，最终浓度为0.5%（w/v），孵育1小时。凝胶化完成后，将带有水凝胶的盖玻片放入新鲜变性缓冲液（200 mM SDS，200 mM NaCl，50 mM Tris（pH8.8）中，在室温下处理直至水凝胶从盖玻片上分离。然后将水凝胶在95°C的新鲜变性缓冲液中孵育1.5小时并摇晃。变性后，将水凝胶在室温下用1x PBS清洗三次，并在新鲜ddH2O中至少扩张三次（每次20分钟），轻轻摇晃直至水凝胶完全扩张，然后在ddH2O中孵育过夜。

iU-hiHomoExM
样品首先在37°C下用0.1%甲基丙烯酸甲酯处理7-10分钟以固定细胞成分。然后将盖玻片浸入第一种凝胶溶液中，该溶液由10%（w/v）AA，19%（w/w）SA，0.1%（w/v）DHEBA和0.25%（w/v）APS/TEMED组成。在冰上凝胶化15分钟，然后在37°C下孵育45分钟。随后在含有200 mM SDS，200 mM NaCl和50 mM Tris（pH 6.8）的缓冲液中变性1.5小时，之后通过反复浸泡在ddH2O中扩张。

中间免疫标记
对于中间免疫标记，将扩张后的凝胶在1x PBS中平衡，然后在37°C下依次与一抗和二抗孵育3小时。染色后，将凝胶在ddH2O中重新扩张。为了稳定结构，将凝胶嵌入中性聚合物溶液中（10%（w/v）AA，0.05%（w/v）DHEBA，0.1%（w/v）APS/TEMED），在冰上连续孵育三次，每次10分钟并轻轻摇晃，然后在37°C的 humidified 环境中聚合1小时。

重新锚定
将水凝胶在含有1.4% PFA和2% AA的溶液中孵育3小时，然后在1x PBS中清洗30分钟。然后将凝胶在第二个凝胶溶液中平衡（12%（v/v）DMAA，34%（w/v）SA，10%（w/v）AA，0.0001%（w/v）Bis，1%（w/v）NaCl，1x PBS中孵育三次，每次10分钟并在冰上轻轻摇晃。去除多余的溶液后，将凝胶在37°C的 humid chamber中聚合1小时。通过用200 mM NaOH在室温下处理1小时并搅拌，随后用1x PBS彻底清洗至pH恢复中性，实现最终扩张。

扩展后标记
首先将凝胶在1x PBS中收缩，然后在37°C下与一抗孵育至少12小时，随后在37°C下与二抗孵育6小时。然后用0.1% PBS-Tween20清洗样本三次（每次30分钟），并在ddH2O中重新扩张。

预标记免疫染色
固定后，将带有样品的盖玻片在0.1% PBS-Triton X-100中清洗三次，每次5分钟，然后在湿润的环境下转移到染色室中。细胞在室温下用0.1% PBS-Triton X-100渗透10分钟，然后用3% BSA在PBS-Triton X-100中封闭非特异性抗体结合30分钟。

免疫染色
首先将样品在室温下用3% BSA/PBS-Triton X-100稀释的一抗孵育1小时，然后在室温下用0.1% PBS-Triton X-100清洗五次。接着在室温下用3% BSA/PBS-Triton X-100稀释的二抗孵育1小时，然后按照与一抗相同的条件进行清洗。最后将样品在1x PBS中储存以备进一步使用。

后标记免疫染色
免疫染色前，将水凝胶从ddH2O转移到1x PBS中并过夜，然后将其切成适当的大小进行染色。首先在37°C下用2% BSA/PBS稀释的一抗孵育3小时或在室温下过夜，在Eppendorf中轻轻摇晃。然后将样品在室温下用0.1% PBS-Triton X-100稀释的一抗孵育3小时，然后用1% PBS-Triton X-100清洗三次。之后在室温下用2% BSA/PBS稀释的二抗孵育3小时，并按照与一抗相同的条件进行清洗。hiHomoEx扩展水凝胶的重新包埋

在Ex-dSTORM成像之前，需要将扩展的水凝胶重新包埋在中性丙烯酰胺凝胶中，以在dSTORM成像过程中保持水凝胶的尺寸（见图S7）。首先，将扩展的水凝胶分别浸入新鲜的重新包埋溶液中（10%（w/w）AA、0.15%（w/w）Bis、0.025%（w/w）TEMED、0.025%（w/w）APS，溶剂为ddH2O），每次浸泡30分钟，室温下轻轻摇晃。在聚合之前，需要使用Kimwipe彻底清除剩余的重新包埋溶液。在聚合过程中，将水凝胶转移到带有两个未处理盖玻片的重新包埋室中，并在充满氮气的潮湿箱中于37°C下培养1.5小时。聚合完成后，用ddH2O洗涤水凝胶三次，每次10分钟，然后将样品保存在ddH2O中直至进行Ex-dSTORM成像。

Ex-dSTORM成像

我们围绕一台商用倒置显微镜（Eclipse Ti2-E，Nikon）搭建了一个定制的成像平台，该平台集成了自动对焦系统和激光合并模块（ILE，Spectral Applied Research），支持独立控制四条激发光束。为了实现扩展样品的均匀表观照明，使用波长为637 nm（140 mW，OBIS 637 LX，Coherent）、561 nm（150 mW，Jive561，Cobolt）、488 nm（150 mW，OPSL 488 LX，Coherent）和405 nm（100 mW，OBIS 405 LX，Coherent）的激光，并通过Borealis Conditioning Unit（Spectral Applied Research）对这些光束进行空间均匀化处理。这些激光束被对准并聚焦到高数值孔径油浸物镜（100×，NA 1.49，CFI Apo TIRF，Nikon）的后焦平面上，以实现适合单分子成像的宽场照明。

成像前，将重新包埋的水凝胶安装在定制的支架上（见图S14），并在成像缓冲液中培养两次。成像缓冲液由Tris–HCl和NaCl（TN buffer，pH 8.0）、10–100 mM mercaptoethylamine（MEA，pH 8.0）、10%葡萄糖（G5767，Sigma-Aldrich）、0.5 mg/mL葡萄糖氧化酶和40 μg/mL过氧化氢酶组成，以促进荧光团闪烁。同时采集宽场和超分辨率图像。宽场成像采用表观荧光照明进行。在Ex-dSTORM成像过程中，使用高功率的637 nm和561 nm激光（约3 kW cm–2）将大部分Alexa Fluor 647和CF568荧光团切换到暗态。通过405 nm激光实现重新激活，而488 nm激光则每800帧触发一次以进行原位漂移校正。荧光信号由EMCCD相机（像素大小：83.5 nm）检测。通常每个数据集采集20,000–30,000帧图像，每帧曝光时间为20 ms。实时单分子定位使用MetaMorph Super-Resolution Module（Molecular Devices）完成。

漂移校正和色差校正

为了实现精确的单分子定位，需要在成像后校正由成像系统引起的横向漂移。使用Alexa Fluor 488标记的ATP合成酶（1/100稀释，ab109867，Abcam）作为漂移跟踪的参考标记。利用ImageJ中的自定义插件评估横向位移和荧光强度。标记信号去除和漂移校正结合LabVIEW、MATLAB和ImageJ程序完成。对齐后，在MetaMorph中重建图像序列，然后使用ImageJ中的高斯滤波器（0.75–1.2像素）增强超分辨率图像（见图S15）。对于双色数据集，使用自定义代码根据预定义的变换函数在红色荧光通道中对每个像素进行空间调整，以校正色差。

变形测试

通过将约20 μL的凝胶溶液放入1.5 mL的Eppendorf管中并在37°C下聚合来制备空白凝胶。聚合完成后，将凝胶浸入去离子水中以实现完全膨胀。根据Trex论文中的描述，通过计算变形半径与原始凝胶半径的比值来评估变形程度（见图S3a）。

成像分析

为了评估中心粒的直径，在对应于远端附属蛋白或远端腔蛋白位置的远端区域进行一致性的测量，使用FBF1或C2CD3作为参考标记（见图S16a）。中心粒和FBF1的直径通过除以每种方法特定的平均凝胶膨胀因子进行归一化（U-ExM为4.3，Magnify为9.6，hiHomoExM为8.3）。为了评估同一细胞器内不同蛋白质之间的膨胀均匀性，我们计算了每个细胞器顶视图图像中FBF1与远端中心粒区域的直径比值（见图S16b）。

圆形度量化

圆形度采用基于径向分布的指标进行量化。首先识别出各个蛋白质簇，获取每个点的（xi,yi）坐标。然后计算每个环形结构的质心（x0,y0）：??0=1??∑????=1????,??0=1??∑????=1????。接着计算每个点与质心的径向距离：????=(???????0)2+(???????0)2。圆形度通过圆形度指数（CI）表示：????=1???????mean，其中rmean代表平均径向距离，σr代表径向距离的标准差。该分析应用于U-ExM、hiHomoEx和非扩展的dSTORM数据集，以便直接比较不同成像模式下的结构圆形度。

统计分析

不同实验之间的统计分析使用GraphPad Prism中的单尾t检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素方差分析（two-way ANOVA）进行。此外，本研究中的每项数据均来自至少两次至三次独立实验的结果。