使用MALDI MSI技术研究FXR在肝细胞癌脂质生物化学中的作用

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Roles of FXR in Lipid Biochemistry within Hepatocellular Carcinoma Using MALDI MSI

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肝细胞癌（HCC）是一种常见的癌症类型，具有较高的死亡率，其发病与肝脏中的法尼索伊德X受体（FXR）有关。FXR是一种配体激活的核受体，参与脂质代谢和稳态调节。基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI MSI）能够实现空间分辨的分子分析，特别适用于研究组织内的脂质分布。在这项研究中，使用MALDI MSI来探讨与HCC和FXR表达相关的肝脏脂质组成变化，重点是磷脂酰胆碱（PC）种类。观察到HCC与非肿瘤区域在PC脂质的空间和组成上存在显著差异。此外，基于细胞培养实验，我们假设PC(38:4)在HCC中起一定作用，这些实验中Hep3B细胞在PC(38:4)存在下进行培养。

**专题**
作为《美国质谱学会杂志》“纪念Richard M. Caprioli”专题的一部分发表。

**引言**
肝细胞癌（HCC）的死亡率位居第三，是第六大常见癌症类型，且其发病率持续上升。(1) HCC的风险因素包括肥胖或饮酒引起的脂肪变性。(2,3) 在人类和小鼠的HCC模型中，胆汁酸(4)和脂质(5)的谱型发生变化，这可能与法尼索伊德X受体（FXR）基因的表达减少有关。(4,6,7) FXR是一种主要在肝脏和肠道中表达的配体激活核受体，也存在于肝细胞和肠细胞中。当FXR基因被敲除时，会导致多种生理变化，如体型减小、胆汁酸积累、炎症以及HCC的自发发生。(4,8) 全身敲除（KO）小鼠会自发出现脂肪变性、代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎，并进展为HCC。(9?11) 此外，西方饮食摄入在男性中会促进这些代谢性疾病的发展，这与人类情况相似。(12?14) FXR有超过80种潜在配体，它们可以是激动剂或拮抗剂，其中包括内源性胆汁酸(7)，以及多不饱和脂肪酸（PUFAs），如二十二碳六烯酸（DA, 22:6）、花生四烯酸（AA, 20:4）和亚油酸（LA, 18:3）。(15) 许多这些配体参与脂质生物合成。先前的研究已经证明了FXR与HCC(4,6,8,16,17)以及胆汁淤积和肝纤维化(18,19)之间的关联。值得注意的是，FXR的失活会导致胆汁酸积累和肝脏癌变。(8,17)

**脂质**
脂质是一类两亲性或疏水性的代谢物，参与许多生物过程，并构成细胞膜的主要组成部分。(20,21) 在哺乳动物中，脂质由肝脏产生并通过多种受体发挥作用，包括FXR。(22) 最丰富的磷脂类别是磷脂酰胆碱（PC），它还占哺乳动物细胞膜的45–55%，并与肝病的进展有关。(23,24) 脂质在癌症研究中备受关注，因为它们与营养、信号传导和膜流动性有关，后者对于转移（包括上皮-间充质转化（EMT）至关重要。(25,26) 因此，我们通过磷脂的空间分析来研究FXR与HCC之间的联系，以揭示FXR影响的脂质代谢变化。

PC脂质由甘油骨架、sn-1和sn-2位置的两个脂肪酸酰基链以及sn-3位置的磷酸基团和胆碱头基组成。(27) PC脂质主要通过胞苷二磷酸胆碱（CDP-胆碱）途径合成，利用膳食中的胆碱；或者通过肝脏中的磷脂乙醇胺N-甲基转移酶途径利用磷脂乙醇胺（PE）合成。(28) 哺乳动物细胞膜具有多种功能，含有多种脂质种类，不同类型的细胞和大多数癌症会导致脂质代谢的变化。(29?33) 例如，HCC中磷脂乙醇胺N-甲基转移酶的活性降低，导致PC:PE比值下降。(34,35) 此外，含有单不饱和脂肪酸的PC脂质增加与肝细胞增殖和HCC癌变有关。(36) 脊髓鞘脂（SM）脂质也参与HCC的发生。(37,38) 在肿瘤相关研究中值得注意，因为缺乏这些脂质的哺乳动物细胞需要外源添加才能增殖。(39,40)

**质谱技术**
质谱是唯一能够检测特定脂质的方法之一，而基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像（MSI）可以在空间上获取这些信息。MALDI MSI是一种无标记、非靶向的分析技术，可以测量数百到数千种分子在其天然的空间环境中。(41) 约10–20 μm的组织切片被固定在导电玻璃载玻片上，然后覆盖一层有机小分子基质。(42) 该基质吸收紫外线激光，帮助组织内内源性生物分子的解吸和电离。(43) 当紫外线激光以网格状模式扫描组织时，会从组织切片上指定位置获取质谱数据，用于构建每种检测到的离子的相对丰度热图。(45) MALDI MSI常用于分析数毫米大小的组织区域，具有细胞分辨率，适用于多种样本类型，包括肿瘤。(46?50) 通过使用组织切片和MALDI MSI保持样本的空间完整性，可以观察肿瘤微环境。(51) HCC的空间代谢组学分析特别有意义，因为空间分析避免了将肿瘤与非肿瘤组织物理分离进行单独分析的难度。(52) 在这里，我们通过研究FXR敲除后HCC内的磷脂分布来揭示磷脂代谢的变化。利用MALDI MSI，我们确定PC(38:4)可能参与了肿瘤的发生过程，这一结论得到了细胞培养实验的支持。

**材料与方法**
**化学品**
除非另有说明，所有化学品均无需进一步纯化即可使用。

**小鼠模型**
8周大的C57B6/L野生型和FXR KO小鼠通过动态注射质粒pT3-EF1α-HA-myr-AKT、pT/pT/Caggs-Nras-v12和pCMV-SB11进行实验，具体方法如前所述。(53?55) 简而言之，肿瘤基因质粒和转座子被稀释至2 mL（体重百分比10%），并在5～7秒内注入小鼠尾静脉。注射一个月后对小鼠实施安乐死以收集HCC组织。使用无HCC的性别和年龄匹配的小鼠作为对照组。通过H&E染色确认注射小鼠是否具有HCC。

**MALDI质谱成像**
新鲜冷冻的肝脏样本切成10 μm厚的切片，并固定在氧化铟-锡镀层的玻璃载玻片上（Delta Technologies, Ltd., Loveland, CO）。在施加基质之前不对组织进行洗涤，以维持盐梯度并减少分子扩散。使用HTX M3+喷雾器（HTX Technologies, LLC, Chapel Hill, NC）施加α-氰基-4-羟基肉桂酸基质（Sigma-Aldrich, Co., St. Louis, MO，浓度为5 mg/mL in 70%甲醇）。所有化学品均无需进一步纯化。喷雾参数包括80°C喷嘴、15 psi氮气压力、120 μL/分钟的溶剂流速以及8次喷涂。MALDI MSI实验使用timsTOF fleX双源MALDI质谱仪（Bruker Scientific, Billerica, MA）进行。每次实验均在正离子模式下进行，栅格宽度为50 μm × 50 μm。方法的具体细节见支持信息。全局衰减值设置为5%，局部激光功率设置为88%，单次喷射150次，质谱范围为m/z 350–1200。MALDI MSI数据集以.imzml和 ibd文件格式存储在https://metaspace2020.org/project/bender-2026。后续组织切片的特征脂质峰通过 CID和氮气（碰撞能量40 eV）进行MS/MS分析，所有操作均在相同的timsTOF fleX质谱仪上进行（质谱数据见支持信息）。

**细胞培养**
Hep3B细胞系以每孔5 × 10^4个细胞的速度接种在24孔板中。细胞在含有4.5 g/L d-葡萄糖、l-谷氨酰胺和100 mg/L丙酮酸的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco, Grand Island, NY）中培养。加入胎牛血清（Gibco, Grand Island, NY）、非必需氨基酸（Gibco, Grand Island, NY）和抗生素-抗真菌剂（Gibco, Grand Island, NY）。24小时后，培养基更换为不含抗生素-抗真菌剂的血清-free DMEM。当细胞达到50%汇合度时，培养基更换为含有0.5% DMSO或0.5%乙醇的脂质添加培养基或不含脂质的对照培养基。细胞在含脂质培养基中培养48小时后，再更换为新鲜的含脂质培养基。每种细胞生长条件进行三次重复实验，用于MTT检测（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）和电喷雾离子化实验。所有细胞均在37°C和5% CO2条件下培养。

**电喷雾离子化**
对于ESI实验，从24孔板的每个孔中收集1 × 10^5个Huh-7和Hep3B细胞系的细胞，每个条件进行三次重复。通过Bligh和Dyer方法提取细胞中的脂质。(56) 提取的脂质在氮气流下干燥，然后根据干燥后的质量用HPLC级甲醇（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）稀释至适当浓度（最终浓度为10 mg/mL）。由于未加入外部标准品，因此结果不是绝对定量值。每个重复样本直接注入timsTOF fleX双源MALDI质谱仪（Bruker Scientific, Billerica, MA）。每个重复样本的平均质谱经过基线峰归一化处理，然后通过学生t检验比较目标离子的相对强度。(57,58)

**数据分析**
在DataAnalysis（Bruker Scientific）软件中使用常见的脂质特征([PC(26:0)+H]+、[PC(32:0)+H]+、[PC(32:0)+Na]+、[PE(36:1)+H]+、[PC(34:2)+H]+和[PC(36:1)+Na]+）完成内部二次质谱校准。使用LIPID MAPS数据库进行脂质鉴定（<5 ppm），(59) 排除含有奇数链脂肪酸的脂质（见SI表S1）。LIPID MAPS数据库搜索仅考虑H+、Na+和K+加合物。特征脂质峰的MS/MS分析根据文献中与脂质头基和加合物相关的值进行注释。(60?62) 使用SCiLS Lab版本2024b Pro（Bruker Scientific）进行接收操作特征曲线下面积（ROC AUC）计算、箱线图和MALDI MSI离子图像分析，采用总离子计数归一化方法和15 ppm的离子窗口。所有数据分析均在同一SCiLS迭代中进行。使用SCiLS软件中的分割工具，通过弱去噪、峰面积间隔处理模式、相关距离度量和总离子计数归一化方法将肿瘤与非肿瘤组织分离。后续肿瘤周围的分割区域空间分析见支持信息（SI图S1）。PCA分析使用MetaboAnalyst 6.0在线分析软件和离子窗口（SI图S2）完成。(63)

**结果与讨论**
**HCC对野生型和FXR KO小鼠肝脏脂质的影响**
对野生型（WT, n = 4）、WT/HCC（n = 4）、FXR KO（n = 3）和FXR KO/HCC小鼠（n = 3）的肝脏进行了MALDI MSI分析。检测到87个磷脂峰，鉴定出74种磷脂。鉴定出的磷脂包括36种磷脂酰胆碱（PC）、18种磷脂酸（PA）、9种磷脂乙醇胺（PE）和11种脊髓鞘脂（SM）。需要注意的是，PC、PE或PS磷脂可能在源处发生衰变，产生类似PA的伪峰。(64) 被鉴定为PA脂质的质谱特征可能是内源性PA脂质或类似PA的伪峰（图1B–F，浅灰色）。

**图1**
图1. HCC存在时肝脏磷脂谱的变化。检测到磷脂酰胆碱（PC）、脊髓鞘脂（SM）、磷脂乙醇胺（PE）和磷脂酸（PA）等脂质类别。由于这些元素参与质谱检测中的离子化过程，因此检测到含有氢、钠或钾的脂质。半圆半径按强度类别线性缩放（A–F），以表示磷脂的相对丰度。由于不同脂质间的强度差异较大，每个强度类别（A–F）分别独立缩放。图中圆圈表示每个强度类别的最大强度，比例为0.5。非常高强度的脂质（A）的最大强度为5200，高强度脂质（B）的最大强度为2500，中高强度脂质（C）的最大强度为1100，中低强度脂质（D）的最大强度为500，低强度脂质（E）的最大强度为300，而非常低强度的脂质（F）的最大强度为150。半圆形的颜色代表了比较结果，颜色越深表示ROC得分越高（请参见图例左上角的颜色刻度）。较高的ROC得分表示根据该磷脂在两组之间的区分度更强。成对比较样本组的ROC得分有：WT与WT/HCC（粉色），FXR KO与FXR KO/HCC（绿色）。在74种被鉴定出的磷脂中，有47种在至少一项上述比较中的ROC得分大于0.800，表明它们具有区分能力。

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在这种情况下，ROC得分被用来定量评估一种磷脂区分两组的能力。ROC得分的范围是0.5到1.0，其中0.5表示没有区分能力，1.0表示完美区分。这些比较的目的是为了了解肝脏脂质如何因肝癌（HCC）而发生变化，以及FXR表达如何影响HCC背景下的脂质谱型。HCC的发展会导致代谢变化，从而影响磷脂组成（图1）。在区分WT肝脏和WT/HCC的脂质中（ROC得分>0.800），大多数脂质在HCC中更为丰富（图1，粉色）。在健康的肝脏中，67%的检测到的PC脂质的ROC得分大于或等于0.800，而44%的PC脂质的ROC得分大于或等于0.900（图1，粉色）。有趣的是，在WT肝脏比较中ROC得分大于或等于0.900的所有PC脂质，在WT/HCC中都比在WT中更为丰富。这些PC脂质的高区分度ROC得分表明它们在HCC中上调。在WT与WT/HCC以及FXR KO与FXR KO/HCC的比较中，单不饱和脂质[PC(34:1)+K]+、[PC(34:1)+H]+、[PC(36:1)+K]+、[PC(32:1)+K]+、[PC(36:1)+H]+在HCC中显著增加（图1A–E，粉色，绿色）。总体而言，我们的结果与先前的研究一致。例如，Lu等人发现当存在肝癌时，m/z 758.57 [PC(34:2)+H]+、m/z 782.57、m/z 806.57、m/z 808.58、m/z 820.53 [PC(36:4)+K]+、m/z 832.58 [PC(38:4)+Na]+ 和 m/z 856.59这些脂质在人血清、人体组织和小鼠组织中发生了显著变化。(1,31)尽管许多脂质在HCC中更为丰富，但有些脂质则较少或变化不显著，例如SM脂质（图1，粉色）。在WT小鼠中，没有SM脂质的ROC得分高于0.800，这表明SM脂质在HCC中没有发生变化（图1，粉色）。与WT和WT/HCC的比较（图1，粉色）相反，所有具有ROC区分能力的SM脂质在FXR KO/HCC中都比在FXR KO中更为丰富。[SM(34:1;O2)+K]+ 和 [SM(34:1;O2)+Na]+ 在FXR KO中都能区分HCC和非HCC（图1C,E，绿色），但在WT中则不会（图1C,E，粉色）。相反，[SM(42:2;O2)+K]+ 在WT/HCC和FXR KO/HCC中都更为丰富（图1D）。鞘磷脂含量的升高与肿瘤促进有关(65,66)，因此我们假设SM(34:1;O2)可能在FXR缺失时参与肿瘤促进。[PA(36:3)+Na]+（图1C，粉色）、[PA(38:3)+Na]+（图1C，粉色）和 [PA(34:1)+Na]+（图1E，粉色）在WT/HCC中的含量低于在WT中的含量。我们推测[PA(36:3)+Na]+、[PA(38:3)+Na]+ 和 [PA(34:1)+Na]+ 的下调是HCC进展过程中发生的代谢变化的下游效应。例如，PA脂质会被转化为二酰甘油(67)，随后通过Kennedy途径与CDP-胆碱结合形成PC脂质。预计Kennedy途径在HCC中会被上调(68)。因此，[PA(36:3)+Na]+、[PA(38:3)+Na]+ 和 [PA(34:1)+Na]+ 在WT/HCC中可能由于转化为PC(36:3)、PC(38:3)和PC(34:1)而减少。HCC对肝脏脂质的影响在FXR KO中似乎有所不同。例如，[PA(36:3)+Na]+ 和 [PA(38:3)+Na]+ 是HCC特异性的，因为它们在WT/HCC和FXR KO/HCC中的含量低于各自的对照组（图1C）。然而，[PA(34:1)+Na]+ 能够区分HCC和WT非HCC肝脏（图1E，粉色），但在FXR KO肝脏中则不能（图1E，绿色）。与WT的比较不同，许多脂质在FXR KO肝脏中的含量低于在FXR KO/HCC中的含量（图1，绿色）。有趣的是，在FXR KO/HCC肝脏中含量较低的具有区分能力的脂质（ROC得分大于或等于0.800）都被鉴定为含有多不饱和脂肪酸的脂质。不饱和膜脂质相比饱和脂质会导致脂质包装更松散(69)，这会影响膜的流动性(69)。因此，FXR KO/HCC肝脏中多不饱和脂肪酸含量较低可能导致了HCC中观察到的肝脏硬度增加(70)。总体而言，有许多脂质可以区分HCC肝脏和非HCC肝脏。然而，在没有FXR的情况下，许多具有区分能力的脂质并不能以相同的方式区分HCC和非HCC。这一发现突显了FXR对HCC的影响。

FXR的缺失会影响HCC中的脂质谱型（图2）。由于FXR的存在，肝脏中的脂质会发生变化（图2）。能够区分WT和FXR KO肝脏的脂质可能表明FXR调节了某些脂质以维持脂质稳态(71)。在没有FXR的情况下，SM和PE脂质类别的代谢没有明显的区分变化（ROC得分>0.800）（图2，棕色）。然而，当FXR被敲除时，PA和PC脂质类别却发生了变化。大多数能够区分FXR KO肝脏和WT肝脏的脂质（ROC得分>0.800）在FXR KO肝脏中更为丰富（图2，棕色）。不过，[PC(34:1)+H]+（图2B，棕色）和 [PC(32:0)+H]+（图2D，棕色）在FXR KO肝脏中的含量较低。最能强烈区分FXR KO肝脏和WT肝脏的脂质（ROC得分>0.900）是 [PC(34:2)+K]+、[PC(36:4)+K]+、[PC(36:2)+K]+、[PC(38:4)+K]+、[PA(36:3)+K]+、[PA(38:3)+K]+ 和 [PA(40:5)+K]+（图2A–C，棕色）。有趣的是，这些具有强烈区分能力的脂质在FXR KO肝脏中的含量都比在WT肝脏中更高。这引发了关于上述区分FXR KO和WT肝脏的含钾脂质的疑问，因为这些脂质比不含钾的脂质更具区分能力。由于FXR是胆酸受体，而先前的研究表明胆酸可以激活BK(Ca)钾通道(72,73)，这些数据可能反映了钾调节的趋势。虽然FXR与肝脏中的钾之间的联系很重要，但本实验没有进行以盐为中心的分析。

图2：肝脏的磷脂谱型受FXR的影响。检测到了磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酸（PA）等脂质类别。检测到带有氢、钠或钾加合物的脂质，因为这些元素参与了质谱法检测过程中的脂质离子化。半圆形的半径根据每个强度类别（A–F）线性缩放，以表示脂质的相对丰度。每个强度类别（A–F）为了视觉效果进行了单独缩放，因为不同脂质的强度差异很大。每个强度类别的最大强度在圆圈中以0.5表示，如图例所示。非常高强度的脂质（A）的最大强度为5200，高强度脂质（B）的最大强度为2500，中高强度脂质（C）的最大强度为1100，中低强度脂质（D）的最大强度为500，低强度脂质（E）的最大强度为300。半圆形的颜色代表了比较结果，颜色越深表示ROC得分越高（请参见图例左上角的颜色刻度）。较高的ROC得分表示根据该磷脂在两组之间的区分度更强。成对比较样本组的ROC得分有：WT与FXR KO（棕色），WT/HCC与FXR KO/HCC（紫色）。在74种被鉴定出的磷脂中，有35种在至少一项上述比较中的ROC得分大于0.800，表明它们具有区分能力。

尽管[PC(34:2)+K]+、[PC(36:4)+K]+、[PC(36:2)+K]+、[PC(38:4)+K]+、[PA(36:3)+K]+、[PA(38:3)+K]+ 和 [PA(40:5)+K]+ 能够区分FXR KO肝脏和WT肝脏（图2，棕色），但这些脂质不能区分FXR KO/HCC和WT/HCC肝脏（图2，紫色）。这突显了FXR在HCC中的代谢作用差异。能够区分WT/HCC和FXR KO/HCC的PC、PE和PA脂质（ROC得分>0.800）在FXR KO/HCC中的含量都较低（图2，紫色）。相反，所有具有区分能力的SM脂质在FXR KO/HCC中的含量都较高（图2，紫色）。SM脂质高度饱和，并具有多种生物学作用。已知SM脂质与胆固醇在细胞膜中共定位(74)，并影响胆固醇的稳态(75,76)。此外，肿瘤需要胆固醇来维持增殖(77)并促进HCC中的肿瘤形成(78)。由于SM脂质的增加与肿瘤促进有关(65,66)，[SM(34:1;O2)+K]+、[SM(42:2;O2)+K]+ 和 [SM(34:1;O2)+Na]+ 在FXR KO/HCC中的上调可能证明了FXR在HCC中的作用（图2C–E，紫色）。

主成分分析（PCA）显示WT（深蓝色）、FXR KO（红色）、WT/HCC（浅蓝色）或FXR KO/HCC（绿色）小鼠肝脏组织（SI条目图S2）的聚集情况。主成分1（PC1）占了数据方差的32.1%，并将有HCC和没有HCC的WT肝脏样本分开。相反，WT/HCC样本主要聚集在PC1的负方向上。与PC1相关的脂质有 [PA(36:3)+Na]+、[PC(34:2)+H]+、[PA(38:3)+Na]+ 位于正方向，而 [PC(34:1)+K]+、[PC(34:2)+K]+ 和 [PC(36:4)+K]+ 位于负方向。在WT/HCC中 [PA(36:3)+Na]+（p = 0.038）和 [PA(38:3)+Na]+（p = 0.048）的含量显著较低。相反，[PC(34:2)+H]+ 在WT/HCC中的含量较高（p = 0.080）。此外，PC2解释了23.7%的方差，并主要将WT/HCC与WT、FXR KO和FXR KO/HCC分开。PC2主要受到 [PC(34:2)+H]+、[PC(34:1)+H]+ 和 [PC(34:1)+Na]+ 的影响。最后，PC3解释了19.4%的方差，并主要将FXR KO与FXR KO/HCC分开。PC3主要受到 [PC(34:1)+K]+（p = 0.013）、[PC(34:1)+H]+（p = 0.018）和 [PA(36:2)+K]+（p = 0.035）的影响，这些脂质在FXR KO/HCC中的含量显著较高。在负方向上，[PC(34:2)+K]+、[PC(34:2)+Na]+ 和 [PA(36:3)+K]+ 在PC3中造成了最大的分离。根据我们的空间分析，在肿瘤中的脂质比周围组织中的脂质更丰富（图3A-D.1和A-D.2），这些脂质在PC1和PC3上产生了相同的影响（SI图S2）。PCA表明HCC存在时肝脏中的磷脂有所不同。此外，聚类结果表明在没有FXR的情况下，脂质受HCC的影响也不同。具有HCC的肝脏聚集在一起，非HCC的肝脏也是如此（图3）。

图3：肿瘤与肿瘤环境之间的磷脂表达存在差异。MALDI MSI以正离子模式检测了WT/HCC（A-I.1）和FXR KO/HCC组织（A-I.2）中的74种脂质特征。在这些脂质中，[PC(32:1)+K]+、[PA(36:2)+K]+、m/z 774.5975（未知脂质）以及 [PC(34:1)+K]+ 在WT/HCC和FXR KO/HCC组织中都位于肿瘤区域内（A.1-D.1和A.2-D.2）。另一方面，[PC(38:6)+K]+、[PC(38:4)+K]+、[PA(40:5)+K]+ 和 [PC(40:6)+K]+ 在WT/HCC和FXR KO/HCC组织中都位于非肿瘤区域内（E.1-H.1和E.2-H.2）。WT/HCC（I.1）和FXR KO/HCC（I.2）的H&E染色显示了可见肿瘤的位置（黑色虚线）。结合H&E染色组织使用分割技术来确定肿瘤边界并突出显示较小且不明显的肿瘤（SI图S1）。ROC AUC得分用于确定哪些脂质能够区分肿瘤组织和非肿瘤组织。

MALDI MSI检测到的磷脂显示肿瘤与周围组织在表达上存在差异（图3）。通过ROC AUC分析，确定了[PC(32:1)+K]+、[PA(36:2)+K]+、m/z 774.5975（未知脂质）和[PC(34:1)+K]+来表征肿瘤（AUC > 0.750）（图3A-D.1，A-D.2）。脂质特征m/z 774.5975的精确质量与LIPID MAPS数据库中发现的几种脂质相似。然而，串联质谱显示其碎片化与数据库的建议不一致（补充信息见图S6）。同时，某些脂质在肿瘤环境中的含量高于在正常组织中的含量。[PC(38:6)+K]+、[PC(38:4)+K]+、[PA(40:5)+K]+和[PC(40:6)+K]+强烈地表征了肿瘤环境（AUC > 0.800）（图3E-H.1，E-H.2）。能够区分肿瘤与正常组织的磷脂在WT/HCC组（图3I.1）和FXR KO/HCC组（图3I.2）之间是一致的，[PC(38:6)+K]+除外（图3E.1–2）。[PC(38:6)+K]+是WT/HCC样本中区分肿瘤和正常组织最有效的磷脂（图3E.1），但在FXR KO/HCC中则区分度较低且含量较低。这表明[PC(38:6)+K]+可能受到FXR基因敲除的影响。HCC样本中的肿瘤单不饱和磷脂[PC(32:1)+K]+和[PC(34:1)+K]+的含量高于周围组织（图3A.1–2和3C.1–2）。Hall等人（36）先前已经将单不饱和磷脂的增加与HCC中的细胞增殖和肝癌发生相关联。此外，Cotte等人（79）也在HCC患者血浆中报告了PC(32:1)和PC(34:1)的增加。在这里，这些单不饱和磷脂主要出现在高度增殖的肿瘤区域。在能够强烈表征肿瘤的磷脂中[PA(36:2)+K]+是唯一不是单不饱和的（图3B.1–2）。肿瘤外相对含量较高的磷脂通常具有更多的不饱和点（图3E-H.1，E-H.2）。[PC(38:6)+K]+和[PC(40:6)+K]+（分别见图3E.1–2和H.1–2）可以有多种异构形式，但通常含有二十二碳六烯酸脂肪酸尾部。二十二碳六烯酸是一种含有22个碳原子链的ω-3脂肪酸，具有六个顺式不饱和双键，已知对人类健康有益，包括预防癌症（80,81）。[PC(38:4)+K]+（图3F.1–2）和[PA(40:5)+K]+（图3G.1–2）的脂肪酸尾部通常含有花生四烯酸，后者已知与炎症有关。使用SCiLS实验室软件中的二分k均值标准进行了分割和聚类，以实现质谱数据的无监督聚类，将数据分为肿瘤组织和非肿瘤组织。这种数据驱动的分离方法允许在不同样本之间一致地分类肿瘤位置，并通过组织的苏木精-伊红（H&E）染色进行了验证（补充信息见图S1）。分割和H&E结果用于确定组织周围不同距离的分子环境。在数据分析中，建立了50 μm宽的同心边界来比较距离肿瘤越来越远的组织区域的脂质谱。对于WT/HCC和FXR KO/HCC肝脏，[PC(32:1)+K]+通过ROC AUC得分最有效地区分了肿瘤与非肿瘤组织。[PC(32:1)+K]+在WT/HCC肿瘤中的含量是肿瘤周围非肿瘤组织的2.5倍，在FXR KO/HCC肿瘤中的含量是1.8倍（图4A）。在距离肿瘤150 μm处，WT/HCC和FXR KO/HCC肿瘤中的[PC(32:1)+K]+含量分别是非肿瘤组织的3.4倍和4.1倍。这表明[PC(32:1)+K]+的含量随距离肿瘤的增加而减少。[PA(36:2)+K]+（m/z 774.5975）和[PC(34:1)+K]+也能区分肿瘤与非肿瘤组织，并且其平均含量随距离肿瘤的增加而减少（图4B-D）。相反，最能代表非肿瘤组织的磷脂是[PC(38:6)+K]+、[PC(38:4)+K]+、[PA(40:5)+K]+和[PC(40:6)+K]+（图4E–H）。在WT/HCC肝脏中，[PC(38:6)+K]+通过ROC AUC分析是肿瘤而非肿瘤组织中的独特磷脂。[PC(38:6)+K]+在非肿瘤组织中的含量是肿瘤中的2.3倍（图4E）。随后，在WT/HCC肿瘤和肿瘤微环境中[PC(38:6)+K]+的含量显著高于FXR KO/HCC（图4E）。在FXR KO/HCC肝脏中，通过ROC AUC分析最能表征非肿瘤组织的磷脂是[PC(38:4)+K]+（图4F）。[PC(38:4)+K]+在FXR KO/HCC肿瘤微环境中的含量是肿瘤中的2.9倍（图4F）。[PC(38:4)+K]+在WT/HCC肿瘤微环境中的含量明显低于FXR KO/HCC（图4F）。[PC(38:6)+K]+预计含有二十二碳六烯酸尾部，而[PC(38:4)+K]+预计含有花生四烯酸尾部（59）。[PC(38:6)+K]+和[PC(38:4)+K]+的表达差异可能表明由于FXR基因敲除，这些脂肪酸尾部的数量或吸收方式有所不同。

图4显示，MALDI MSI表明肿瘤在分子水平上与WT/HCC和FXR KO/HCC组织中的微环境不同。在WT/HCC和FXR KO/HCC组织之间差异表达的磷脂在周围组织中的定位也不同。定义肿瘤的脂质（A–D）随距离肿瘤的增加而相对含量减少。在WT/HCC中，这些脂质在距离肿瘤超过100 μm时相对含量几乎恒定（n = 4）。然而，在FXR KO/HCC中，这些脂质在距离肿瘤至少150 μm时相对含量仍然继续减少（n = 3）。相反，定义肿瘤微环境的脂质（E–H）随距离肿瘤的增加而相对含量增加。由于肿瘤的接近性，未考虑更远的同心边界。显著性表示为* = p < 0.1，** = p < 0.05，*** = p < 0.01。

一些能够区分肿瘤环境的脂质在WT/HCC中的含量高于FXR KO/HCC。例如，[PC(38:6)+K]+和[PC(40:6)+K]+在WT/HCC肿瘤中的含量显著高于FXR KO/HCC肿瘤（图4E和H分别），这表明FXR基因可能参与调节这些脂质在HCC中的表达。膜流动性受饱和脂质更紧密的排列和不饱和脂质较松散的排列的影响（69）。高度不饱和的脂质（图4E–H）主要分布在肿瘤外部，表明肿瘤环境中的细胞膜更加流动，而肿瘤内的细胞膜则较为僵硬。在肿瘤附近的组织中观察到磷脂表达的不均匀变化，这反映了肿瘤微环境的复杂性，并说明了在临床环境中识别肿瘤外界的难度。例如，距离肿瘤50 μm以内的组织在m/z 774.5975和[PC(40:6)+K]+方面与肿瘤和非肿瘤组织有相似性（图4C和H分别）。在FXR KO/HCC肿瘤周围的50 μm边界中，m/z 774.5975的含量与肿瘤中的没有显著差异（图4C）。相比之下，[PC(40:6)+K]+在肿瘤周围的50 μm边界中与肿瘤中的含量有显著差异（图4H）。这些不均匀的磷脂变化可能是由于肿瘤周围存在不同类型的细胞所致。磷脂是细胞膜的重要组成部分，可以指示细胞类型（65,83）。除了表明肿瘤生长、上皮-间充质转化或转移外，一些磷脂可能还表示其他细胞类型的存在，例如已知存在于肿瘤微环境中的免疫细胞（84）。未来研究可以尝试使用不同于此处使用的H&E染色的方法，如基于抗体的免疫荧光来揭示同一组织切片中的细胞类型（85,86）。

关于PC(38:4)在肝细胞癌中的作用，MALDI MSI提供的信息对于建立可验证的假设至关重要。我们观察到PC(38:4)存在于肿瘤周围的细胞中，并计划通过细胞培养来验证这一点。我们用不同浓度的PC(38:4)培养Hep3B细胞，以了解其对细胞增殖的影响（图5）。总体上，我们使用MTT测定法发现，当细胞在含有5 × 10^3 μg/L PC(38:4)磷脂标准的无血清培养基中生长时，细胞增殖显著减少（图5A）。最初我们认为这种脂质促进了细胞生长，但最终过量的PC(38:4)可能导致细胞死亡。然后我们使用细胞提取物评估了其他脂质的变化，以进一步了解这些细胞机制。事实上，当许多其他脂质保持不变时，CE(20:4)的含量随PC(38:4)浓度的增加而显著增加（图5B）。有趣的是，PC(18:0/20:4；我们使用的标准物）可以通过卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（LCAT）转化为CE(20:4）[PC(18:0/20:4) + 胆固醇 → LCAT → CE(20:4) + LPC (18:0)]，提供了额外的见解。事实上，肿瘤细胞需要胆固醇来维持增殖（87），并且LCAT对HCC具有保护作用（88）。这种联系可能表明肿瘤周围的细胞会耗尽胆固醇，从而限制肿瘤生长，这是一个值得进一步探索的假设。然而，另一个可能的假设是高浓度的PC(38:4)脂标准在细胞培养实验中导致了细胞死亡。未来的实验将需要进一步验证这些假设，以确定这些观察结果背后的机制。

总之，本研究展示了当FXR（一种抑制HCC和调节脂质稳态的基因）被敲除时，HCC磷脂谱发生了显著变化。通过MALDI MSI，我们观察到HCC的存在改变了肝脏中的磷脂组成，而且在缺乏FXR的情况下这些变化非常明显。值得注意的是，单不饱和磷脂如[PC(32:1)+K]+和[PC(34:1)+K]+在肿瘤区域富集，而多不饱和脂质如[PC(38:4)+K+]在肿瘤微环境中更为丰富，特别是在FXR KO模型中。功能性测定进一步支持了PC(38:4)可能影响细胞增殖和胆固醇代谢的假设。这些发现强调了FXR不仅在脂质调节中的作用，还在塑造肿瘤及其周围组织的分子结构方面发挥作用。总体而言，我们的结果突显了空间脂质组学的实用性，有助于揭示与肿瘤进展相关的代谢特征，并表明FXR的丢失驱动了HCC中的特定脂质组重塑。未来的研究将涉及进一步评估这些机制，包括使用转录组学和蛋白质组学分析，以及在其他类型癌症中的研究。