成像质谱流式技术在泡型棘球蚴病免疫微环境研究中的应用

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Imaging mass cytometry of the immune microenvironment in alveolar echinococcosis

　　

背景：泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcosis, AE）由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）引起，是一种具有类肿瘤生长特性及显著免疫逃逸能力的严重寄生虫病，其病灶微环境中的空间组织结构与免疫抑制机制尚未得到充分解析。 方法：研究人员对6例经组织学确诊的AE患者的肝组织切片开展高维成像质谱流式（Imaging mass cytometry, IMC）分析，比较病灶近端（邻近肝组织，Close liver tissue, CLT）与病灶远端（远隔肝组织，Distant liver tissue, DLT）区域的免疫特征，同步实现免疫细胞浸润、空间异质性、免疫检查点表达及微环境结构的多参数分析；同时结合免疫荧光与免疫组化技术，评估儿童与成人患者中性粒细胞亚群的的年龄相关差异。 结果：IMC共鉴定出16种免疫细胞类型并揭示其特异性空间分布模式：CD15-中性粒细胞与CD4+效应记忆T（Effector memory T, Tem）细胞聚集于部分坏死区域；M1/M2巨噬细胞与树突状细胞（Dendritic cells, DC）在富含细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）的区域周围形成环状结构；CD4+与CD8+效应T细胞呈分散环状分布。M2巨噬细胞与T细胞呈负相关（提示T细胞耗竭），且与CD15+中性粒细胞呈正相关，但与CD15-中性粒细胞无显著相关性。CLT区域免疫检查点分子整体低表达，存在局灶性PD-1/PD-L1共表达、广泛CD47分布、罕见的NKG2A+细胞，且T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains, TIGIT）富集于固有自然杀伤（Natural killer, NK）细胞。基于TIMELASER分类系统，AE免疫微环境可分为三种亚型：髓系富集免疫抑制型、基质富集免疫抑制型与免疫驻留型。儿童患者CLT区域中CD15+与CD15-中性粒细胞密度均显著高于成人。 结论：本研究首次绘制了人类AE免疫景观的空间分辨图谱，揭示了由髓系-淋巴系交互作用及检查点调控塑造的动态免疫抑制微环境，为解析早期免疫逃逸机制及开发宿主导向治疗策略提供了新视角。

研究背景

泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcosis, AE）是由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）幼虫感染引起的严重人兽共患寄生虫病，主要流行于北半球欧洲、北美及亚洲地区，全球每年新增病例约1.8万例，其中91%集中于中国，青藏高原地区超声筛查阳性率可达10.95%，10~14岁人群阳性率显著高于成人。该病潜伏期长达5~15年，早期无症状，晚期可出现肝大、梗阻性黄疸、门静脉高压等严重并发症，未治疗患者诊断后10~15年死亡率达90%，因手术难度极高被称为肝胆胰外科“珠穆朗玛峰”，给公共卫生与社会经济带来沉重负担。目前AE的免疫应答机制尚未完全明确，传统蛋白质组学技术仅能提供细胞或组织的全局蛋白表达信息，无法解析组织微环境的空间异质性；而新兴的成像质谱流式（Imaging mass cytometry, IMC）技术可同步获取组织样本的高分辨率细胞图像与多参数蛋白表达数据，已在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）及疟疾研究中揭示关键免疫特征，为解析AE的免疫微环境空间架构提供了可行路径。为此，研究人员开展本研究，旨在系统表征肝AE病灶周围的免疫细胞组成、空间组织与互作网络，阐明寄生虫建立持续感染的免疫学机制，为开发新型免疫治疗策略提供依据。该研究成果发表于《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》。

主要技术方法

研究人员纳入21例经病理确诊的AE患者（儿童组0~18岁、成人组19~69岁），其中6例（3例儿童、3例成人）的肝组织用于IMC分析，每例样本分为病灶近端（CLT，距病灶<0.5 cm）与病灶远端（DLT，距病灶>2.5 cm）区域；剩余15例（10例儿童、5例成人）样本用于验证实验。采用Hyperion?成像系统对甲醛固定石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）切片进行IMC检测，定制30种金属偶联抗体panel覆盖先天免疫、适应性免疫、免疫检查点与结构标志物；原始数据经Ilastik概率图训练、CellProfiler核与细胞边界分割、histoCAT单细胞特征提取、Harmony去除批次效应、Rphenograph细胞聚类及t-SNE降维可视化完成分析；空间分析采用cytomapper处理多通道图像、imcRtools开展邻域分析，基于TIMELASER系统框架进行免疫微环境分型；采用免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）与免疫荧光（Immunofluorescence, IF）技术验证中性粒细胞亚群分布差异，统计学分析采用R软件完成。

研究结果

3.1 基于IMC的肝AE生态系统空间分辨表型分析

研究人员从6例患者共348张图像中分割获得82112个单细胞，通过定制30标记IMC panel实现AE病灶微环境的多参数空间解析，各标记蛋白的表达与分布得到明确呈现。

3.2 细胞表型的数据驱动推导

基于phenograph聚类算法将细胞分为36个簇，最终注释为16种细胞类型：B细胞、CD4效应T（Te）细胞、CD4效应记忆T（Tem）细胞、调节性T（Treg）细胞、CD8 Te细胞、CD8 Tem细胞、单核细胞、M1巨噬细胞（Mac M1）、M2巨噬细胞（Mac M2）、树突状细胞（DC）、CD15^-中性粒细胞、CD15⁺中性粒细胞、自然杀伤（NK）细胞、上皮细胞、基质细胞及CD45⁺VEGF⁺未定义细胞。DLT区域以肝细胞为主，含少量Mac M2、CD8 Te、CD4 Te细胞；CLT区域以免疫细胞为主，CD8 Te、CD4 Te、CD15^-中性粒细胞占比最高，其次为Mac M2、Mac M1、DC与Treg细胞。

3.3 肝AE病灶周围免疫微环境细胞的空间异质性与定量分析

CLT区域CD4 Te、CD8 Te、CD8 Tem、单核细胞、DC及CD15^-中性粒细胞密度显著高于DLT区域（P<0.05）；上皮细胞密度在CLT区域显著降低（P<0.05）；B细胞、CD4 Tem、Treg、巨噬细胞及NK细胞密度在两组间无显著差异（P>0.05）。

3.4 肝AE病灶相关免疫微环境细胞的空间拓扑关系

皮尔逊相关性分析显示，CLT区域B细胞与CD4 Tem、CD8 Tem、CD15^-中性粒细胞的互作强于DLT区域；CD4 Tem与CD8 Tem、CD15^-中性粒细胞在CLT区域的互作显著增强；Mac M2与DLT区域的CD8 Te、CLT区域的Treg存在潜在互作；Treg与NK细胞在CLT区域呈正相关，提示巨噬细胞、Treg及NK细胞可能参与AE免疫耐受。以肝细胞为参考点的距离分析显示，DLT区域多数细胞集中在距肝细胞5~15 μm范围内；CLT区域Treg、CD8 Tem、CD4 Te、单核细胞及CD15^-中性粒细胞在0~25 μm范围内密度逐步升高。

3.5 AE免疫检查点的空间异质性

PD-1信号主要分布于淋巴样群体，CLT区域上皮细胞PD-1表达降低；PD-L1呈异质性分布，在髓系与淋巴样群体中相对富集，CLT区域CD4 Tem、Mac M1及CD15⁺中性粒细胞中表达升高；CD47广泛分布，CLT区域CD4 Tem与基质细胞中表达降低；NKG2A信号主要局限于NK细胞，CLT区域CD15^-中性粒细胞、基质细胞及上皮细胞中表达下降；TIGIT主要分布于CD4 Tem、Treg、CD8 Tem及NK细胞，CLT区域基质细胞、上皮细胞及CD45⁺VEGF⁺未定义细胞中表达降低。免疫检查点分子的表达具有标记特异性和细胞类型依赖性，CLT与DLT的差异为选择性而非全局性。

3.6 肝AE的免疫微环境网络

基于K最近邻（K-nearest neighbor, KNN）算法与层次聚类，将AE免疫微环境分为5种细胞邻域（Cellular neighborhood, CN）：CN1主要位于CLT区液化坏死病灶内，以B细胞、CD15^-中性粒细胞、NK细胞为主，对应免疫驻留表型；CN2呈环状分布于CN3外侧，以CD4 Te、CD8 Te、Treg细胞为主，对应免疫激活表型；CN3呈环状紧邻病灶，以Mac M1、Mac M2、CD15⁺中性粒细胞为主，缺乏T细胞，对应髓系富集免疫抑制表型；CN4主要位于DLT区，以上皮细胞为主，免疫细胞匮乏，对应免疫排斥表型；CN5以基质细胞为主，散在分布少量Mac M2，对应基质富集免疫抑制表型。

3.7 儿童与成人患者免疫微环境中中性粒细胞分布的差异

儿童患者CLT区域CD15⁺中性粒细胞与Treg细胞聚集程度高于成人；儿童CLT区域CD15^-中性粒细胞密度显著高于成人及自身DLT区域（P<0.05）。IHC与IF验证显示，儿童CLT区域CD15⁺中性粒细胞、CD15^-髓过氧化物酶（Myeloperoxidase, MPO）⁺中性粒细胞占比均显著高于成人（P<0.05），提示中性粒细胞可能在AE进展中发挥重要作用，且儿童与成人的免疫微环境存在差异。

讨论与结论

本研究首次将IMC技术应用于肝AE的免疫微环境解析，突破了传统技术的空间信息缺失局限，揭示了AE病灶周围免疫细胞组成的复杂性及空间分布的特异性。研究结果验证了既往报道的巨噬细胞和DC环绕病灶的环状分布模式，进一步发现其与T细胞的空间关联符合先天免疫先于适应性免疫激活的顺序；同时明确了M2巨噬细胞与T细胞的负相关提示T细胞耗竭，为靶向TIGIT等免疫检查点逆转T细胞功能障碍的治疗策略提供了依据。关于中性粒细胞的研究发现，儿童CLT区域两类中性粒细胞亚群均显著富集，CD15^-中性粒细胞与B细胞共同存在于部分液化坏死病灶，可能参与早期免疫应答，而CD15⁺中性粒细胞与M2巨噬细胞的正相关可能促进Th1免疫应答抑制及疾病进展，这一年龄差异或与儿童处于感染早期阶段有关，也为理解AE的慢性炎症机制提供了新线索。免疫检查点的异质性分析表明，AE微环境并非统一的免疫抑制状态，而是存在局部检查点定义的微环境生态位，避免了“泛免疫检查点激活”的认知偏差。

研究局限性包括IMC样本量较小（n=6）、未控制疾病分期与治疗背景的混杂影响、单时间点采样无法反映动态变化等，未来需扩大队列并结合功能实验验证。总体而言，该研究绘制了首张人类AE免疫微环境的空间分辨图谱，阐明了髓系-淋巴系互作与检查点调控塑造的动态免疫抑制网络，为解析AE免疫逃逸机制、开发宿主导向的免疫治疗靶点奠定了重要基础。