嵌套PCR技术用于快速检测牛油果和可可幼苗中的Lasiodiplodia和Ceratocystis病害

《Tropical Plant Pathology》：Nested PCR for early detection of Lasiodiplodia and Ceratocystis in avocado and cocoa seedlings

　　

摘要

Persea americana和Theobroma cacao植物可能会受到Lasiodiplodia属真菌的感染，这种真菌会导致枯萎病；而Theobroma cacao还会受到Ceratocystis属真菌的感染，从而导致可可萎蔫病。这些真菌首先会破坏植物的内部维管组织，因此在感染初期不会出现明显症状，这使得诊断变得困难。因此，在本研究中，我们开发了一种嵌套PCR技术，用于从受感染和无症状的幼苗茎样本中早期检测Ceratocystis和Lasiodiplodia。为了便于从可可和鳄梨幼苗的木质化样本中提取DNA，我们对样本进行了甘油和96%乙醇的预处理。随后，通过扩增actin基因确认了样本中的核酸不含PCR抑制剂，从而可以应用诊断技术并避免出现假阴性结果。本研究设计的Cer.ITS119-F/Cer.ITS379-R和Las.ITS77-F/Las.ITS452-R引物对分别对Ceratocystis和Lasiodiplodia具有特异性，检测灵敏度为2–4 ng/μL。利用ITS1/ITS4和Cer.ITS119-F/Cer.ITS379-R引物对检测CeratocystisLasiodiplodia，我们无需在培养基中进行真菌分离即可直接从受感染的茎样本中检测出这两种病原体。结果通过琼脂糖电泳根据片段大小差异得以清晰解读：人工感染C. cacaofunesta的样本产生了279 bp的扩增产物，而感染L. theobromae和L. subglobosa的样本产生了397 bp的扩增产物。综上所述，使用ITS1/ITS4和Cer.ITS119-F/Cer.ITS379-R引物对检测Ceratocystis，以及ITS1/ITS4和Las.ITS77-F/Las.ITS452-R引物对检测Lasiodiplodia的嵌套PCR方案，能够实现对无症状可可和鳄梨幼苗茎中这两种病原体的早期诊断。