利用胚胎发生细胞悬液培养技术进行根瘤蚜（Microvine）的农杆菌介导的转化

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Harnessing embryogenic cell suspension culture for Agrobacterium-mediated transformation of microvine

　　摘要
Microvine 04C023V0004 (V4) 是一种酿酒葡萄（Vitis vinifera）的模式基因型，携带一种杂合的赤霉素不敏感基因 (Vvigail) 突变，使得植株体型紧凑且持续结果。然而，其应用受到较长再生时间和较低转化效率的限制。为了提高 Microvine V4 的转化效率，我们开发了一种利用胚胎发生细胞悬浮液 (ECS) 文化和新的农杆菌介导转化协议的方法。从 Microvine 胚胎发生愈伤组织中分离出的易碎的球形（透明或乳白色）体细胞胚胎被用来启动悬浮培养。ECS 文化需要较少的时间和精力来维持，并在几个月内产生大量快速生长的外植物材料。在转化过程中，ECS 细胞在 45°C 下进行热休克处理，并与携带含有 Microvine Ubiquitin 7 (VviUbi7) 启动子的二元载体的农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 共培养，该启动子控制 mCherry 基因的表达，从而可以利用红色荧光作为可见标记。通过在培养基中添加赤霉素，转基因 Microvine 植株的发育得到了改善。通过液滴数字 PCR (ddPCR) 对 18 株独立的转基因植株进行了鉴定，结果表明其中 9 株（50%）携带一个或两个引入的选择标记基因拷贝。这种方法在共培养 5 个月后，每 100 毫克新鲜重量的 ECS 文化可以产生大约 30 株转基因植株。使用 Microvine V4 ECS 文化和改良的转化协议可以高效生成转基因植株，从而推动葡萄生物技术研究的发展。

引言
葡萄通常通过来自生殖组织的体细胞胚胎或胚胎发生愈伤组织进行基因工程改造。然而，其较大的体型、较长的幼年期以及每年仅开花一次的特性阻碍了研究进展。‘Pinot Meunier’ 品种的葡萄在其顶芽分生组织的表皮细胞 L1 层中携带 Vvigail（赤霉素不敏感 1）基因突变（Boss 和 Thomas 2002）。VviGAI1 参与赤霉素信号传导，该蛋白质的 DELLA 结构域中单个核苷酸突变将亮氨酸替换为组氨酸（Boss 和 Thomas 2002；Pellegrino 等人 2019；Torregrosa 等人 2019），导致植株表现为绒毛密布的表型。从 ‘Pinot Meunier’ 体细胞衍生出的杂合植株被称为“microvine”，具有矮小且多毛的表型，同时卷须会转化为花序，能够持续结果但开花和结果过程在生理上是正常的。因此，Microvine 成为葡萄研究和功能基因组学的理想模型系统。最初的 Microvine 突变株不适合农杆菌介导的转化，为此进行了杂交实验，对杂交后代进行了胚胎发生愈伤组织的形成和转基因植株的再生能力测试。由 L1 突变株与黑果品种 ‘Grenache’ 杂交得到的 Microvine 基因型 04C023V0004 (V4) 显示出更高的转化效率（Cha?b 等人 2010），并已在先前的研究中用于创造转基因植株（Cha?b 等人 2010；Gouthu 和 Deluc 2019）。尽管 Microvine 作为模型具有优势，但其转化效率较低，转基因芽的再生和发育效率不高，且再生植株在土壤中的生长较为困难。

先前，胚胎发生细胞悬浮液 (ECS) 文化已被用于显著提高多种作物的植株再生和转化效率（Ondzighi-Assoume 等人 2019；Shivani 和 Tiwari 2019；Tripathi 等人 2015；Woo 等人 2021）。ECS 文化繁殖迅速，比愈伤组织更容易传代，并能有效再生植株（Finer 1994；Jayasankar 等人 1999）。使用 ECS 文化还能提高农杆菌介导的转化效率，因为这种培养方式使得外植物组织更均匀，感染更加容易，转化组织的筛选效果更好（Finer 1994）。尽管有这些优势，ECS 文化容易受到微生物污染，传代间隔较短，如果不及时传代可能会出现早衰现象。在葡萄中，细胞悬浮培养已被证明可以改善 ‘Thompson Seedless’、‘Chardonnay’、‘Richter 110’、‘Cabernet Sauvignon’、‘Chancellor’ 和 ‘Mencía’ 等品种的再生效果（Acanda 等人 2015；Amar 等人 2007；Forgács 等人 2017；Jayasankar 等人 1999；Jiao 等人 2012；Torregrosa 等人 2002）。也有报道指出，来自葡萄种间杂交体的体细胞胚胎可以在液体培养基中再生植株（Zlenko 等人 2005）。‘Chardonnay’ 的悬浮培养还被用于基因编辑研究（Park 等人 2014；Ren 等人 2016），但尚未有关于在 Microvine 中使用 ECS 文化的报道。在液体培养基中生长的体细胞胚胎可以发育出称为“悬浮器”的独特胚胎结构，这是一种连接胚胎与周围组织的细胞结构，负责传输营养和生长调节因子以促进胚胎发育（Jayasankar 等人 2003；Kawashima 和 Goldberg 2010），并且其子叶比在固体培养基上生长的原胚体更小。这些结构与更先进的芽顶端分生组织发育相关，在萌发期间的休眠程度更低，从而更高效地产生植株（Jayasankar 等人 2003；Kawashima 和 Goldberg 2010）。

本研究的目的是从胚胎发生愈伤组织建立 Microvine V4 悬浮培养，并利用农杆菌介导的转化快速高效地生成转基因植株。所报道的协议成功建立了高存活率的悬浮培养，提供了充足的胚胎发生外植物材料用于转化，并产生了大量转基因 Microvine 植株。

材料与方法
**愈伤组织的诱导与增殖**
Microvine V4 植株（由澳大利亚联邦科学与工业研究组织 (CSIRO) 的 Paul Boss 博士和 Ian Dry 博士提供，通过 Laurent Deluc 博士转交）在加利福尼亚州奥尔巴尼的 USDA 温室中种植。在花朵簇开始分离开来时（Wang 等人 2023），在阶段 57 收集花序作为外植物材料。花朵在流动水中清洗，分成小簇，然后用含有 100 毫升新鲜 20% 漂白剂溶液和约 50 微升 Tween-20 的锥形烧瓶进行表面消毒 1 分钟。再次用无菌水清洗三次以去除残留的漂白剂，然后沥干，直接用于解剖或储存在 4°C 下最多三天后再进行解剖。按照之前的方法（Torregrosa 等人 2015）解剖花朵，并在愈伤组织诱导培养基 (PIV: 在线资源 1 A) (Franks 等人 1998) 上培养。培养皿在黑暗中于 28°C 下孵育，三周后将形成的愈伤组织转移到愈伤组织增殖和维护培养基 (CIM: 在线资源 1B) 中进行进一步增殖。每三周将胚胎发生愈伤组织转移到新鲜的 CIM 培养基上，并在黑暗中于 28°C 下孵育，直到用于 ECS 启动、植株再生或植株转化。Microvine 悬浮培养可以维持长达两年。

**ECS 文化的建立**
从约 4 个月大的胚胎发生愈伤组织中分离出的单个未成熟体细胞胚胎用于启动悬浮培养。从胚胎发生愈伤组织中分离出大约 50 毫克（新鲜重量）的易碎球形体细胞胚胎（透明或乳白色），转移到含有 7 毫升悬浮培养基 (在线资源 1 C) 的 50 毫升 Erlenmeyer 烧瓶中，在旋转振荡器上以每分钟 90 转的速度在黑暗中孵育。每周更新一次 ECS 文化，替换 6 毫升培养基为新鲜悬浮培养基。随着悬浮细胞的增殖，将细小细胞（尺寸 < 0.6 毫米）转移到无菌烧瓶（120 或 250 毫升）中，保持悬浮细胞/培养基体积比为 5–10%（大约 15 毫升悬浮培养基在 120 毫升烧瓶中，通过测量 50 毫升无菌 Falcon 管中的悬浮细胞沉淀体积来确定）。初始 50 毫升烧瓶中的较大细胞团簇按上述方法维持。每 10 天对大型 ECS 文化进行传代。转移到 120 毫升烧瓶后，悬浮培养可用于转化或进一步培养。使用直径 3.3 英寸、孔径 0.6 毫米的筛子过滤大型烧瓶中的较大细胞团簇，以同步培养物的发育阶段（图 S2）。初始的小烧瓶培养无需过滤，它们在 50 毫升烧瓶中持续增殖。将悬浮细胞连同培养基放置在玻璃载玻片上，加盖盖玻片，直接在奥林巴斯显微镜 BX51（Olympus Corporation，日本东京）下观察其状态，并生成图 2 所示的图像。

**再生与植株发育**
为了检查再生情况，从烧瓶底部吸取少量沉淀的细小悬浮细胞（< 0.6 毫米）和 200–300 微升悬浮培养基，转移到体细胞胚胎发育和成熟培养基 (SEDM: 在线资源 1D) 上。轻轻摇晃培养皿以确保细胞均匀分布。培养皿在黑暗中的生长室（Percival Scientific，美国艾奥瓦州）中于 28°C 下孵育。在 SEDM 培养 30–50 天后，细胞发育成成熟的体细胞胚胎，当它们处于鱼雷形/子叶阶段时，转移到悬浮生长培养基 (SSM: 在线资源 1E) 中继续生长，并在 28°C 下进行 16 小时光照/8 小时黑暗的循环条件（40–70 微摩尔/平方米·秒）。当植株长到 4–5 厘米高时，将它们转移到盆栽中，用聚乙烯袋或塑料罩覆盖以保持湿度进行适应，并在生长室（Conviron，北达科他州，美国）中在 16 小时光照/8 小时黑暗的循环条件下培养。

**构建设计**
VviUbi7 启动子（Genbank 登录号：PV929291），包括其 5’ 内含子（2,151 bp），此前已证明在葡萄组织中具有强的表达能力（Li 等人 2012），从 Microvine V4 基因组 DNA 中扩增并克隆到 MoClo Golden Gate 文库的 Level 0 Golden Gate 接受载体骨架中（Engler 等人 2008）。PCR 扩增使用 Q5 高保真度 DNA 聚合酶（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）和特异性引物（在线资源 2 表 S1）以及 Microvine V4 基因组 DNA，在以下条件下进行：98°C 保温 30 秒，35 个循环每轮 98°C 保温 10 秒，67°C 保温 10 秒，72°C 保温 1.10 分钟，最后 72°C 保温 2 分钟。含有 VviUbi7 启动子的 Level 0 载体通过 Sanger DNA 测序进行验证，并克隆到 Level 2 接受载体中，该载体驱动红色荧光基因 mCherry 的表达，并带有 CaMV35S 终止子和卡那霉素抗性植物选择盒。该构建在转基因葡萄组织中表现出强烈的红色荧光，因此在转基因事件中提供了易于检测的可见表型。载体构建 T-DNA 的示意图见图 4A。

**农杆菌介导的转化**
悬浮细胞使用含有 VviUbi7-mCherry 二元载体质粒的农杆菌 Agrobacterium tumefaciens 株株 AGL1 进行转化。使用含有选择抗生素（卡那霉素 50 毫克/升）的单个菌落建立农杆菌起始培养（5 毫升），并在 28°C 下培养过夜。然后将一毫升起始培养物接种到含有选择抗生素（卡那霉素 50 毫克/升）的 50 毫升 LB 培养基中，以 250 转/分钟的旋转速度孵育 3–5 小时，直至变为浑浊。然后将培养物转移到一个无菌的Falcon管中，在18°C下以4000 x g的离心力离心10分钟，然后重新悬浮至OD600 = 0.2的共培养基（CCM）中（在线资源1G），并加入400 μM的acetosyringone。收集ECS细胞（新鲜重500毫克，通过移液管去除Falcon管中沉淀细胞的上清液后测量），将其放入50毫升的Falcon管中，并将原始培养基替换为新鲜的培养基。在农杆菌共培养之前，将ECS细胞在45°C的水浴中热休克5分钟。将含有农杆菌的10毫升CCM加入500毫克新鲜重量的悬浮细胞中，在美国德克萨斯州Crystal Technology & Industries公司生产的平台摇床上调速至50 rpm下室温混合10分钟。混合后，让悬浮细胞沉淀到管底。取出5毫升培养基，然后用无菌的血清学移液管将剩余的溶液和细胞转移到无菌滤纸上（将2-3张无菌滤纸盘叠放在一个无菌培养皿中），并在无菌流动罩中干燥约10分钟。当细胞不再湿润时，将最上层的含有细胞的滤纸转移到CIM培养板上，在22°C下黑暗条件下共培养2天。共培养后，使用细胞刮刀（Alkali Scientific，佛罗里达州，美国）将悬浮细胞转移到含有400 mg/L头孢噻肟的10毫升悬浮培养基中，并在平台摇床上以50 rpm的转速室温下混合15-30分钟。用悬浮培养基清洗细胞3-4次以去除农杆菌，然后将其转移到无菌培养皿中的叠置滤纸上，在层流罩中空气干燥（直到不再明显湿润）。干燥后的细胞使用细胞刮刀转移到含有头孢噻肟（250 mg/L）的半固体SEDM培养基中，并分成小群（图4C）以追踪单个转化事件。培养物在28°C下黑暗条件下培养20天，并在显微镜下观察红色荧光以确认转基因表达。将转化细胞每月重新培养一次到含有250 mg/L头孢噻肟和植物选择抗生素（50 mg/L卡那霉素）的SEDM培养基中，直到它们发育出成熟的体细胞胚胎。然后将表现出非嵌合、均匀红色荧光的成熟体细胞胚胎转移到含有250 mg/L头孢噻肟和赤霉素（GA3，5 mg/L）的SSM培养基中，并在光照强度为40-70 μmol m?2s?1的光照条件下，在培养箱中保持28°C（16小时光照/8小时黑暗）。再生的小苗被转移到含有GA3（10 mg/L）的SSM-I培养基中进一步发育，之后在相同条件下转移到土壤中适应环境，最后移入温室。该过程的流程图如图1所示。

图1
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农杆菌介导的ECSM转化协议

分子分析
使用改良的Puregene试剂盒协议（Qiagen，美国加利福尼亚州红木城）提取基因组DNA。将叶片样本（约0.5克）快速冷冻在液氮中的1.5毫升离心管中，并用塑料杵研磨成细粉。向研磨后的样本中加入400微升细胞裂解液和25微升β-巯基乙醇，搅拌后置于65°C下孵育1小时，并在30分钟和60分钟时额外搅拌。加入5微升RNase A（10 mg/mL）溶液，轻轻搅拌后在37°C下孵育30分钟。将样本置于冰上1分钟，然后加入133微升蛋白质沉淀缓冲液。混合物搅拌20秒后置于冰上20分钟。然后以13,000 x g的离心力离心3分钟，将上清液转移到新的1.5毫升微量离心管中。加入等量的氯仿：异戊醇溶液，颠倒50次，再以13,000 x g的离心力离心5分钟。将上清液转移到新的1.5毫升微量离心管中，加入等量的100%异丙醇，通过颠倒试管混合50次。然后将样本置于冰上5分钟，再以13,000 x g的离心力离心1分钟。丢弃上清液，将DNA沉淀物用300微升70%乙醇洗涤，通过颠倒试管混合，再以13,000 x g的离心力离心1分钟。丢弃上清液，将基因组DNA沉淀物风干，然后溶解在30微升无菌超纯水中。使用DeNovix微量光谱仪（DeNovix，美国加利福尼亚州戴维斯）对基因组DNA进行定量，并在使用前通过1%琼脂糖凝胶进行完整性检测。

滴液数字PCR（ddPCR）用于测量温室中建立T0转基因事件后nptII的拷贝数（Collier等人，2017年）。使用葡萄藤查尔酮合成酶（VviCHI）基因（Costa等人，2022年；Harris等人，2013年）作为单拷贝参考基因。根据制造商的说明（Bio-Rad Laboratories，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯），为参考基因设计了引物和探针（在线资源2/表S1），并像之前为nptII那样使用（Thilmony等人，2022年）。使用FAM?标记的探针检测参考基因扩增子，使用HEX?标记的探针检测nptII扩增子。在ddPCR之前，用EcoRI-HF限制性内切酶（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）消化转基因和对照植物的基因组DNA（200 ng）。每个20微升的反应液包含10微升2x ddPCR supermix（不含dUTP）（Bio-Rad），每种引物0.5微升（22.5 μM），参考和目标探针各0.25微升（25 μM），3微升消化后的DNA（60-100 ng），以及5.5微升水，总反应体积为20微升。在QX200滴液生成器中为每个样本生成滴液，并在以下条件进行PCR：95°C孵育10分钟，40个循环（94°C 30秒，60°C 1分钟），98°C 10分钟，12°C保持。PCR后，在Bio-Rad QX200滴液读取器中读取滴液数据，并使用QuantaSoft软件（Bio-Rad）进行分析。PCR扩增还用于检测用于测量转基因拷贝数的T0转基因事件中的潜在农杆菌污染。使用为农杆菌tumefaciens C58 fliG序列设计的引物（表S1）和Taq DNA聚合酶（New England Biolabs，美国马萨诸塞州）进行扩增，循环条件如下：95°C 30秒，35个循环95°C 15秒，62°C 20秒，68°C 20秒，最后在68°C延伸5分钟。每个微葡萄样本大约使用100 ng的基因组DNA和来自溶解的A. tumefaciens AGL1细胞的基因组DNA（作为阳性对照）作为模板进行PCR扩增。扩增后，将样本在1.5%琼脂糖凝胶上分离40分钟，用溴化乙锭染色，并在紫外透射仪下观察结果。

图2
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微型葡萄的愈伤组织和悬浮培养物的发育
图2展示了使用雄蕊外植体培养愈伤组织和悬浮培养物的过程。图2A显示了一个早期阶段的微型葡萄花序。最适于诱导胚胎发生愈伤组织的未成熟花朵是在它们开始在花序中分离的阶段（Lorenze等人，1995年；图2B）。在这个阶段，雄蕊呈淡黄色且看起来半透明（图2C）。我们测试了雄蕊、花丝、花药、雌蕊以及有花被和无花被的整个花朵作为愈伤组织诱导的组织的类型，发现没有花被的完整花朵产生了最多的胚胎发生愈伤组织，但雄蕊和切开的花丝也能产生胚胎发生愈伤组织（数据未显示）。在切解后的20天内，花药会变成棕色，附着在子房上的花丝尖端会膨胀（图2D）。诱导的愈伤组织在CIM培养物中经过两轮传代后开始增殖，并通过每2-4周转移到新鲜的CIM培养基中继续维持。微型葡萄V4的胚胎发生愈伤组织生成效率为2-6%（胚胎发生愈伤组织数量/雄蕊总数*100），这些植物是在温室中生长的健康植物。

图2
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微型葡萄的愈伤组织和ECS发育。A 开花中的微型葡萄植物。B 用于切割的未成熟花序（花朵刚开始分离）。C 用于愈伤组织接种的略微透明且呈黄色的雄蕊阶段。D 在PIV培养基上去除花被后产生愈伤组织的生殖性花组织。E 在CIM培养约4个月后，从胚胎发生愈伤组织中出现的易碎、透明的体细胞胚胎。F 用红色箭头标记的理想的易碎体细胞胚胎（新鲜重量约50毫克），用于启动ECS。G 在悬浮培养基中接种体细胞胚胎以启动ECS培养。H 在28°C下黑暗条件下连续摇晃两个月后，悬浮细胞在培养皿中增殖（从底部观察）。

在CIM培养大约四个月后，选择易碎、透明或奶油色的球形体细胞胚胎（图2E和F）在50毫升烧瓶中启动ECS培养（图2G）。选择球形体细胞胚胎作为起始材料，而不是使用整个胚胎发生愈伤组织块，是建立ECS培养最关键的步骤。紧凑的愈伤组织块在液体培养基中无法发育成ECS，并最终在2-3周内变成棕色（在线资源3_Fig. S1 A-C）。大约使用50毫克新鲜重量的体细胞胚胎在50毫升Erlenmeyer烧瓶中的7毫升悬浮培养基中启动细胞悬浮培养。在传代过程中，去除棕色细胞簇（如果有的话）有助于维持健康的ECS培养。胚胎发生培养物通常在2个月内增殖（图2H）。增殖后，将培养物中的小细胞簇（< 0.6毫米）转移到更大的烧瓶（125或250毫升）中，留下原始烧瓶中的较大细胞簇继续增殖，保持细胞和悬浮培养基的比例为5-10%，如在线资源3_Fig. S2所示。在较大的烧瓶中培养1-2个月后（所需时间因不同细胞系而异），通过0.6毫米筛子过滤掉较大的细胞簇。这个过程有助于维持ECS培养中细胞簇大小均匀（< 0.6毫米）。ECS培养物的显微镜观察显示了小细胞簇（图3A）。能够有效生成茎的胚胎发生悬浮细胞培养通常包含小而球形的细胞簇，其中细胞充满密集的细胞质（淀粉颗粒），如图3A-C所示。非胚胎发生培养物包含形状不规则的细胞和细胞簇，具有大的液泡，且淀粉颗粒明显较少（图3D）。这些非胚胎发生细胞和细胞簇在较老的ECS培养物中经常出现，并随着时间的推移变得更加普遍。当这些非胚胎发生细胞在培养物中占主导时，该培养物不再适用于植物再生。使用这种方法维持的能够有效再生植物的胚胎发生微型葡萄ECS培养物可长达两年，但不同培养物之间存在差异，有些在一年后开始失去其胚胎发生能力。应定期评估已建立的ECS培养物的状态，以确保其用于转化和茎再生的能力。

图3
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ECS的显微镜观察。A-C是同一ECS细胞系培养的图像。A 大的胚胎发生细胞簇（E，带箭头），细胞质密集（充满淀粉颗粒）。B 和 C 不同大小的胚胎发生细胞簇，形状紧凑且大致呈球形。D 非胚胎发生细胞（NE，带箭头），形状不规则，具有大的液泡且没有淀粉颗粒，来自不能有效再生茎的旧细胞悬浮培养物。

从微型葡萄ECS培养物中再生植物
将悬浮细胞（连同200-300微升悬浮培养基）转移到SEDM培养板上，以监测其茎的再生能力（在线资源3_Fig. S3A）。悬浮细胞在半固体培养基上培养约30-50天后，在SEDM上发育成成熟的体细胞胚胎（在线资源3_Fig. S3B），尽管具体时间可能因独立建立的ECS培养物而异。在显微镜下观察到成熟的球形和鱼雷形状的体细胞胚胎（在线资源3_Fig. S3C），这些培养物具有再生茎的能力。这些外植体在SSM培养基中经过15-30天后变成了绿色，并长出了带有根的小苗（在线资源3_图S3D）。这些小苗在含有赤霉素激素的SSM-I培养基中继续培养1-2个月后发育成了幼苗（在线资源3_图S4）。随后，高度约为4-5厘米的幼苗被转移到土壤中以适应环境并继续生长（在线资源3_图S3F）。通过农杆菌介导的手段对微葡萄（microvine）细胞系（ECST）进行了转化。

为了评估在微葡萄细胞系中的转化效率，我们采用了农杆菌介导的转化方法。转化构件的示意图见图4A。图4B展示了含有二元载体构建体的农杆菌与悬浮细胞共培养的过程。共培养后，细胞被洗涤并分成小群体转移到含有卡那霉素和头孢噻肟的半固态SEDM培养基中（图4C）。共培养4天后，转化细胞显示出红色荧光（图4D）。这些转化细胞在SEDM选择培养基中1-3个月内成熟为胚性胚胎（图4E）。这些成熟的胚性胚胎表现出均匀的亮红色荧光，证实了mCherry转基因的表达（图4F）。转化后的胚性胚胎随后被转移到SSM培养基中，并长出了根和芽（图4G），但部分新长出的芽生长缓慢或异常，未能正常伸长和产生新的茎和叶子（在线资源3_图S5）。为了促进芽的生长，我们在SSM培养基中添加了不同浓度的赤霉素（GA3）：5 mg/L、8 mg/L、10 mg/L和15 mg/L。在含有GA3的SSM-I培养基中，微葡萄芽经过额外60天的培养后发育成了健康的幼苗（图4H）。我们观察到添加GA3后正常芽的数量增多，其中10 mg/L GA3的处理效果最佳（在线资源3_图S4，在线资源2_表S2）。使用15 mg/L GA3培养的植株部分表现出芽尖卷曲的不理想现象。两个月后，这些已生根的植株被转移到土壤中并表现出正常的生长（图4I）。通过这种方法，从500毫克鲜重的起始ECS培养物中产生了大约150株红色荧光的转基因植株。随机选取的18株植株在土壤中进一步培养以进行进一步表征。从ECS培养物中生成转基因微葡萄V4植株的整个流程如图5所示。

**图4**
**农杆菌介导的ECS培养物转化及转基因微葡萄植株的恢复**：
A. 用于ECS转化的T-DNA构建体示意图。番石榴碱合成酶启动子（NOSp）和终止子（NOSt）控制nptII基因的表达（使植物对卡那霉素产生抗性），微葡萄泛素7启动子（VviUbi7p）及其5'内含子（虚线箭头）和CaMV35S终止子（35St）控制mCherry报告基因的表达；农杆菌的T-DNA左边界（LB）和右边界（RB）。
B. 被农杆菌感染后的悬浮细胞。
C. 洗涤后分组的悬浮细胞（含有头孢噻肟）。
D. 共培养4天后显示红色荧光的转化细胞。
E. 共培养3个月后，在含有头孢噻肟（250 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）的SEDM培养基中发育的胚性胚胎。
F. 共培养3个月后显示红色荧光的转化悬浮细胞（曝光1秒）。
G. 在不含选择抗生素的SSM培养基中20天后再生出的芽和根。
H. 在含有GA3（10 mg/L）的SSM-I培养基中培养60天后再生出的植株。
I. 在土壤中生长的转基因微葡萄植株。

**转基因植株的分子验证**
对18株独立的疑似转基因植株进行了ddPCR分析以测定nptII的拷贝数。转基因量以内源的单拷贝葡萄基因VviChi为参考进行计算（Costa等人2022年；Harris等人2013年）。在测试的植株中，4株含有一个拷贝的转基因，5株含有两个拷贝的nptII，9株含有三个或更多的转基因拷贝（图6，在线资源2_表S3）。这些结果表明，使用农杆菌转化ECS培养物可以稳定地生成携带一个或两个转化构建体的转基因微葡萄V4植株，成功率约为50%。在其他植物物种的转基因事件中，使用ddPCR测定拷贝数时也得到了类似的结果（Collier等人2017年）。我们通过使用检测农杆菌fliG序列的引物进行PCR扩增，确认了测试的18株微葡萄样本中没有混入的农杆菌（见方法部分）。所有18株测试样本均为阴性，而使用农杆菌基因组DNA作为模板的阳性对照反应则扩增出了预期产物。这些结果证实了ddPCR结果能够准确反映各转基因事件的转基因拷贝数。

**图5**
**农杆菌介导转化后从ECS培养物中生成植株的时间线**

**图6**
**从ECS衍生的18株独立转基因微葡萄植株中的nptII拷贝数**

**讨论**
葡萄生物技术中的一个主要瓶颈是快速再生携带目标转基因构建体的植株。微葡萄作为一个理想的葡萄研究模型系统，因其具有几个有利特性，但由于其对赤霉素的不敏感性，在培养中的芽再生能力较弱且生长速度相对较慢（Cha?b等人2010年；Pellegrino等人2019年；Torregrosa等人2019年）。在这项研究中，我们报道了一种新型且高效的微葡萄V4基因转化方法，解决了这些问题。该改进的方案包含几个独特的技术创新，使其区别于现有的葡萄和微葡萄转化方法：
1. 为了启动ECS培养，我们专门选择了易碎、半透明或奶油色的胚性胚胎，而不是整个愈伤组织块，以建立高质量的增殖悬浮培养物。
2. 在悬浮培养基中加入 zeatin 激素以加速细胞增殖。
3. 在与低密度（OD600约为0.2）的农杆菌培养物共培养之前，对ECS培养物进行5分钟、45°C的热休克处理，该农杆菌培养物被诱导产生了高浓度的acetosyringone（400 μM）。
4. 共培养后，用含有400 mg/L头孢噻肟的液体培养基洗涤细胞，以确保转基因葡萄细胞得以再生，同时防止农杆菌过度生长。
5. 使用两阶段、无选择压力的芽再生过程：首先在新培养基中添加植物激素，然后不添加激素以促进芽的再生和发育。
6. 通过红色荧光进行早期可视化选择，以分离非嵌合的转基因植株，并从芽再生培养基中去除可能抑制植物生长的抗生素选择试剂。
7. 使用GA3促进芽的再生和生长，弥补了微葡萄外植体对赤霉素的部分不敏感性，从而改善了健康芽的发育。
8. 通过标记探针的单反应ddPCR测定法精确测量nptII的拷贝数，以便高效识别单拷贝转基因事件。

该方案的成功实施始于选择适合生成胚性愈伤组织的起始材料。之前的葡萄研究使用雄蕊、雌蕊和整朵花在PIV培养基上生成胚性愈伤组织（Capriotti等人2022年；Dhekney等人2009年；Gambino等人2007年）。在本研究中，从雄蕊和不带花被的花中提取的微葡萄细丝组织能够诱导愈伤组织。与仅使用雄蕊的培养相比，使用整朵花获得的胚性愈伤组织更多（Capriotti等人2022年；Dhekney等人2009年；Gambino等人2007年）。这可能是由于这些生殖结构中含有内源性激素，有助于更有效的胚性愈伤组织诱导（Jiménez 2001年；Jiménez和Bangerth 2000年；Mostafa等人2020年）。建立ECS的第二个关键因素是选择高质量的起始材料——即易碎的球形未成熟胚性胚胎。即使使用携带球形胚性胚胎的整块愈伤组织进行接种，也可能导致混合悬浮培养物的生长不良并最终变褐。选择球形胚性胚胎作为ECS的起始材料显著提高了悬浮培养物的质量和均匀性。早期研究还表明，‘Chardonnay’愈伤组织产生的悬浮培养物生长迅速（Jayasankar等人1999年）。然而，其他研究中并未提及用于建立‘Chardonnay’ ECS的起始材料的特异性（Ren等人2016年；Torregrosa等人2002年；Vidal等人2003年）。一些研究报道在‘Chardonnay’、‘Cabernet Sauvignon’、‘Mencìa’葡萄品种中使用了胚性细胞、胚胎团块和前胚团块（Acanda等人2015年；Amar等人2007年；Villette等人2024年）。我们的研究表明，在液体培养中，未成熟、易碎、半透明/奶油色的球形胚性胚胎具有最高的胚性潜力，这一结论与其他作物物种的研究结果一致（Abohatem等人2011年；Shivani和Tiwari 2019年）。维持ECS时，悬浮细胞与培养基的比例也很重要，因为细胞过多会导致培养物褐变和细胞死亡（Abohatem等人2011年；Jayasankar等人1999年）。如先前的‘Chardonnay’和‘Thompson Seedless’研究所示，经常将细胞分装到新的培养瓶中可以减少细胞褐变（Jayasankar等人1999年）。附着在培养瓶内壁的细胞碎片也可能导致细胞褐变，因此将培养物转移到新培养瓶中以去除死细胞对于维持健康的悬浮培养至关重要。使用本研究报道的方案，我们能够维持高质量的微葡萄ECS培养物长达两年，直到它们失去高效再生植株的能力。悬浮细胞也被证明是原生质体分离的良好来源（Li等人2021年；Masani等人2013年），因此这种方法也可能适用于生产微葡萄原生质体。

尽管之前已有研究使用葡萄细胞悬浮液进行生物弹射法和农杆菌介导的转化（Hebert等人1993年；Martinelli和Mandolino 1994年；Ren等人2016年；Torregrosa等人2002年；Villette等人2024年），但与其他物种相比，这种方法在植株生成效率上较低。有研究报道使用Chardonnay悬浮液在10毫升沉淀细胞体积中产生了240株植株，另一项使用生物弹射法的报道在使用Chancellor细胞悬浮液的情况下产生了37株阳性植株（Kikkert等人1996年；Vidal等人2003年）。另一项关于Chardonnay农杆菌转化的研究使用液体选择培养基生成了4株转基因植株（Ren等人2016年）。然而，迄今为止只有使用愈伤组织外植体的农杆菌转化方法被报道用于微葡萄的转化，且没有研究描述微葡萄细胞悬浮液的培养。其中一项研究报道恢复了9株微葡萄转基因植株（Costa等人2018年），其他研究指出微葡萄转基因植株的生成时间为6-10个月（Gouthu和Deluc 2019年；Torregrosa等人2019年）。相比之下，ECS培养物对农杆菌感染反应强烈，适用于香蕉、柑橘、柳枝稷和药用植物等作物的高效芽再生（Babich等人2020年；Moniruzzaman等人2021年；Ondzighi-Assoume等人2019年；Shivani和Tiwari 2019年）。本研究中报道的方案从500毫克鲜重的ECS培养物开始，在5-7个月内产生了大约150株转基因微葡萄植株，所有被选中进行分子鉴定的18株转基因植株均表现出红色荧光且转基因阳性。为了更好地回收转基因植株，我们在农杆菌感染前对悬浮细胞进行了热休克处理（如之前报道的那样以提高转化效率Gurel等人2009年；Hiei等人2006年；Khanna等人2004年；Patel等人2013年），并在芽发生阶段停止使用抗生素选择，因为卡那霉素选择已被证明会对葡萄植株的芽生长和再生产生负面影响（Li等人2006年；Saporta等人2014年；Torregrosa等人2016年）。有研究表明，热休克处理可以促进转化细胞的存活，因为该处理能够防止程序性细胞死亡（Khanna等人，2004年），并诱导热休克蛋白的产生，这些蛋白能够稳定农杆菌的毒性蛋白（如VirE2），从而促进农杆菌介导的转化过程（Hwang等人，2015年；Park等人，2014年；Tsai等人，2009年）。在本研究中，我们描述了一种快速培养微葡萄ECS（microvine ECS）的方法。实验结果表明，这些ECS培养物是进行农杆菌介导转化的理想材料，能够在大约5-7个月内产生荧光转基因芽和转基因植株（每500毫克新鲜ECS重量可产生150株转基因植株）。使用微葡萄ECS培养物的优势在于它们生长迅速，可以为转化及其他实验提供充足的材料来源，同时维护这些培养物所需的时间和精力相对较少。所提出的方法可用于高效地引入新的性状，或利用CRISPR基因编辑技术来更好地了解微葡萄中的基因功能。这种方法也可能适用于其他葡萄品种，从而推动这一重要作物的生物技术研究更加高效地进行。