使用非靶向液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）和套索回归（LASSO）统计分类方法来确定单花蜂蜜的植物来源

《Microchemical Journal》：Non-targeted LC-HRMS and LASSO statistical classification to assign the botanical origin of monofloral honey

　　

罗伯托·斯特拉（Roberto Stella）| 安德烈亚·马萨罗（Andrea Massaro）| 卡梅拉·扎科梅蒂（Carmela Zacometti）| 亚历山德拉·塔塔（Alessandra Tata）| 罗伯托·皮罗（Roberto Piro）| 弗兰科·穆蒂内利（Franco Mutinelli）| 吉安卡洛·比安科托（Giancarlo Biancotto）

威尼托实验动物防疫研究所（Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie），SCS2 – 化学系，大学大道10号（Viale dall'Università），35120莱尼亚罗（Legnaro，帕多瓦省，意大利）

摘要

单花蜂蜜因其独特的植物来源而备受重视，但由于不同蜂蜜复杂的化学成分和潜在的掺假行为，验证其真实来源仍然具有挑战性。本研究旨在应用非靶向液相色谱法结合高分辨质谱法（LC-HRMS），并结合最小绝对收缩选择算法（LASSO），对来自不同植物来源的意大利单花蜂蜜样品进行分类。为此，分析了2023年、2024年和2025年参加“Tre Gocce d'Oro”比赛的意大利养蜂人提供的245份单花蜂蜜样品（包括相思树、柑橘、桉树、椴树、sulla和栗树）。在比赛期间，通过感官分析和理化分析验证了这些蜂蜜样品的真实性。

选取了70份样品进行LC-HRMS分析，并用作基于LASSO的分类模型训练集。该模型利用LASSO选出的16个代谢物特征作为预测因子，内部交叉验证的准确率达到98.9%，在五个独立的外部验证集中的准确率也超过90%（每个验证集包含35份样品，总计175份）。

这些结果表明，LC-HRMS结合LASSO是确定单花蜂蜜植物来源的可靠工具，有助于提升蜂蜜市场的质量控制。

引言

蜂蜜是由蜜蜂从植物花蜜或活体植物部位分泌物中提取的天然甜物质，被广泛认为是一种具有重要营养价值和健康益处的天然食品[1]、[2]、[3]。蜂蜜的高营养价值主要源于其高糖含量以及多种次要成分，如维生素、矿物质、酶、游离氨基酸和挥发性化合物[4]。此外，蜂蜜的健康促进作用很大程度上与植物来源的次生代谢物有关，例如酚酸、黄酮类和其他抗氧化化合物[5]、[6]。在欧洲联盟，法律法规旨在通过禁止改变其化学成分和严格规范标签来保持蜂蜜作为未经加工农产品的质量[7]、[8]、[9]。

由于单花蜂蜜的需求不断增加且商业价值较高，同时产量有限，蜂蜜经常被掺假或虚假标注以牟取经济利益[10]。单花蜂蜜这一术语通常表示蜜蜂采集的大部分花蜜来自单一植物种类，这赋予了蜂蜜独特的感官特性，如风味和香气[11]、[12]。然而，只有少数植物来源的化合物会对蜂蜜的感官和营养特性产生显著影响[13]。实际上，没有任何蜂蜜可以完全认为是纯单花的，因为多种植物来源的花蜜和环境因素都会影响其化学成分[14]、[15]。因此，验证蜂蜜的植物来源是蜂蜜真实性研究中的一个重要挑战。尽管最近提出了许多分析方法和策略[4]、[16]、[17]、[18]、[19]，但迄今为止，区分单花蜂蜜的植物来源仍然是一项挑战。目前，官方控制方法主要依赖于蜜粉学和感官分析。蜜粉学通过显微镜观察蜂蜜中的花粉粒和其他植物成分来确定其植物和地理来源[20]。这种方法通常结合感官评估，评估外观、香气、口感和质地等属性[21]、[22]。然而，这些方法耗时较长，需要对样本进行复杂的准备，并且依赖经验丰富的分析人员，这可能限制了其常规应用[23]。

为克服这些限制，人们提出了一些先进的分析技术来验证蜂蜜的植物来源[15]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。这些技术包括电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、核磁共振（NMR）、近红外光谱（NIR）、涂层刀片喷雾质谱和高分辨质谱（HRMS）[16]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。其中，非靶向代谢组学已成为发现反映蜂蜜植物来源的化学标记物的有效策略[34]。特别是液相色谱与高分辨质谱（LC-HRMS）的结合，能够全面分析来自不同植物来源的蜂蜜中的代谢物。由于此类分析会产生大量复杂的数据集，因此化学计量学和统计模式识别技术对于提取有意义的信息至关重要。化学计量学提供了多变量工具，用于识别模式、选择区分变量以及构建能够根据植物来源区分蜂蜜样品的分类模型[17]、[18]、[35]、[36]。例如，主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和机器学习方法已成功应用于基于代谢组学、挥发性组学或光谱数据对蜂蜜品种进行分类[18]、[37]、[38]、[39]。特别是最小绝对收缩选择算法（LASSO）是一种监督学习分类方法，它同时执行变量选择和模型构建，可以识别出负责样品区分的最相关标记物[40]、[41]。因此，在本研究中，使用LC-HRMS结合基于LASSO的化学计量学建模，对六种单花蜂蜜（相思树、栗树、柑橘、桉树、椴树和sulla）及蜜露蜂蜜的化学成分进行了全面分析，以评估其验证蜂蜜植物来源的有效性。

章节摘录

化学物质和试剂

水（LC-MS级）购自Fisher Scientific（美国新泽西州费尔劳恩），甲醇和乙腈（LiChrosolv，MS级）购自Merk（美国密苏里州圣路易斯）。同位素标记的内标物质（肌酸-D₃、亮氨酸-5,5,5-D₃、L-色氨酸-2,3,3-D₃、吲哚-2,4,5,6,7,3-乙酸-D₅、1,14-十四烷二酸-D₂₄）购自Merk（美国马萨诸塞州圣路易斯）和CDN Isotopes（加拿大魁北克）。内标标准溶液以甲醇配制

结果与讨论

共分析了70份水溶性蜂蜜样品提取物（每种植物来源各10份），使用反相柱分离代谢物，并在两种极性下进行离子化。标记内标物质（肌酸-D₃、亮氨酸-5,5,5-D₃、L-色氨酸-2,3,3-D₃、吲哚-2,4,5,6,7,3-乙酸-D₅、1,14-十四烷二酸-D₂₄）的信号强度在质量控制样品中的变异性低于30%

结论

本研究分析了245份代表意大利全国生产的单花蜂蜜样品，以评估LC-HRMS结合基于LASSO的统计工具在验证蜂蜜植物来源方面的适用性。基于水/甲醇提取的快速样品制备协议使得在单次LC-HRMS分析批次中就能提取和分析30多份样品。重要的是，统计方法

CRediT作者贡献声明

罗伯托·斯特拉（Roberto Stella）：撰写——原始稿件、方法学、研究设计、概念化。安德烈亚·马萨罗（Andrea Massaro）：撰写——审稿与编辑、验证、研究、数据分析。卡梅拉·扎科梅蒂（Carmela Zacometti）：撰写——审稿与编辑、资源协调、方法学。亚历山德拉·塔塔（Alessandra Tata）：撰写——审稿与编辑、方法学、资金获取。罗伯托·皮罗（Roberto Piro）：数据可视化、概念化。弗兰科·穆蒂内利（Franco Mutinelli）：撰写——审稿与编辑、资金获取。吉安卡洛·比安科托（Giancarlo Biancotto）：撰写——审稿与编辑

资助

本研究得到了意大利农业、粮食主权与森林部（MASAF）的支持，项目编号为0628067，涉及“2024年度国家养蜂计划子项目的资金分配及相关拨款申请”。根据欧盟法规（EU）2021/2115号条例——2024年行动计划，以及与专业研究机构在相关领域的合作

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢来自Osservatorio Nazionale Miele的Lucia Piana、Giancarlo Naldi和Alberto Contessi的宝贵合作。