利用蜂蜜介导的可持续合成方法制备了寡壳聚糖功能化的Ca(OH)?纳米颗粒，该纳米颗粒具有优异的抗菌性能和生物相容性

《Nano Trends》：Sustainable Honey-Mediated Synthesis of Oligochitosan-Functionalized Ca(OH)? Nanoparticles with Enhanced Antibacterial and Biocompatible Properties

　　**Saidun Fiddaroini | Ardini Nurul Janah | Budi Mulyati | Ahmad Luthfi Fahmi | Yosep Yuswanto Tri Ananda | Andini | Nike Fitayatul Khusnah | Moh. Farid Rahman | Akhmad Sabarudin**

**印度尼西亚玛琅布拉维贾亚大学理学院化学系**

**摘要**

抗菌素耐药性（AMR）仍然是一个全球性的关键挑战，尤其是在耐金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）方面。本研究提出了一种使用杨树蜂蜜（Ceiba pentandra）作为直接还原-稳定剂的绿色合成方法来制备Ca(OH)?纳米颗粒的技术。其创新之处在于省去了提取步骤，并将蜂蜜介导的合成与寡壳聚糖（oligochitosan）涂层结合，以增强稳定性和抗菌性能。通过蜂蜜介导的方式合成了Ca(OH)?纳米颗粒，并随后用寡壳聚糖对其进行功能化处理。利用UV-Vis、FTIR、FESEM-EDX、TEM-SAED、XRD、DLS和TGA分析了其结构、形态和胶体性质，同时通过肉汤微量稀释法评估了其抗菌活性。FTIR证实了表面成功功能化，TEM显示涂层后的纳米颗粒直径（20–30 nm）较为均匀且分散性得到改善。DLS分析显示动力粘度增加，ζ电位发生变化，表明形成了稳定的聚合物壳层。涂层后抗菌活性显著增强，针对金黄色葡萄球菌的增强效率为443%，针对铜绿假单胞菌为545%，显示出强烈的协同效应。基于计算机模拟的分子对接（in silico molecular docking）研究表明，这种纳米颗粒通过与膜蛋白和细胞壁相关蛋白的强相互作用具有多靶点的抗菌机制。通过卤虫致死性测试（brine shrimp lethality test）评估了生物相容性，结果表明涂层纳米颗粒的LC??值更高，表明其毒性降低。本工作表明，基于杨树蜂蜜的Ca(OH)?-寡壳聚糖纳米复合材料是一种有前景的、环保且具有生物相容性的抗菌平台，可用于对抗耐药性病原体。

**1. 引言**

抗菌素耐药性（AMR）被认为是当今最严重的全球健康威胁之一，主要是由于微生物（细菌、病毒、真菌、寄生虫）对抗生素的耐药性。如果管理不当，预计到2050年每年将导致多达1000万人死亡，超过癌症成为主要的死亡原因[1,2]。其中最棘手的细菌病原体是金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌，两者在2019年全球直接导致约929,000人死亡和超过350万例与AMR相关的死亡病例[3]。金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌，是皮肤和软组织感染的主要诱因，尤其是高度耐药的USA300菌株；而铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性机会性病原体，因其内在和获得性的耐药机制而引起严重且持久的感染。抗生素的滥用和过度使用，包括高达26%的非处方使用，进一步加速了多重耐药菌株的出现[4,5]。尽管抗生素仍是抗菌治疗的主要依靠，但其效果逐渐减弱，迫切需要替代抗菌策略。依赖现有药物化学修饰或发现新抗生素的传统方法速度缓慢、成本高昂，且越来越无法应对快速进化的病原体。与此同时，基于金属的纳米颗粒因其独特的物理化学性质（如纳米级尺寸、大表面积和高反应性）而受到关注[6]。其中，钙基纳米颗粒（CaNPs或Ca(oxide)NPs）因具有生物相容性和催化活性以及报道的抗菌效果而受到关注，尤其是对革兰氏阳性细菌的有效性。然而，大多数报道的CaNPs是通过耗能大、对环境有害且容易产生有毒残留物的物理或化学方法合成的[7], [8], [9]。

以往关于Ca(OH)?纳米颗粒合成的研究主要依赖于植物提取物，如Phyllanthus emblica、Aloe vera等草药系统，其中的植物化学物质作为还原和稳定剂。虽然这些方法对环境友好，但通常存在重现性有限、植物化学成分变化较大以及需要提取步骤从而引入额外加工步骤和溶剂消耗的问题[10,11]。相比之下，基于生物废物或蛋壳衍生钙源的替代绿色方法通常需要高温煅烧或多步骤转化过程，这可能降低方法的整体可持续性和能源效率[12]。此外，比较研究表明，合成路线强烈影响纳米颗粒的大小、形态和抗菌性能，因此选择合适的绿色前驱体系至关重要[13]。绿色合成方法通过使用天然生物分子作为还原和稳定剂提供了可持续的替代方案。多种植物提取物（如大蒜、月桂叶、辣木叶和木瓜叶）已被成功用于合成钙基纳米颗粒，其中多酚、黄酮类和糖类作为金属还原的电子供体[14], [15], [16]。然而，这些方法通常重现性较差，难以控制纳米颗粒大小，并且胶体稳定性不足。此外，尽管印度尼西亚生产了充足的杨树蜂蜜（Ceiba pentandra），但其作为天然还原剂和稳定剂在CaNP合成中的作用尚未得到充分探索。蜂蜜富含葡萄糖和果糖，可以有效还原金属离子，并通过氢键和羟基相互作用形成包覆层[17], [18], [19]。

与常见的植物提取物介导的绿色合成方法相比，使用蜂蜜具有多个优势，可以直接解决纳米颗粒制备中的关键问题。首先，蜂蜜本身具有水溶性，可以直接使用，无需预先提取、纯化或繁琐的溶剂处理步骤，这显著提高了合成过程的可重复性和可扩展性[20]。其次，蜂蜜含有高浓度的还原糖（如葡萄糖和果糖）以及生物活性化合物，使其能够在单一系统中同时发挥还原剂和稳定剂的作用，从而促进可控的成核和增强胶体稳定性[18]。此外，蜂蜜本身具有抗菌活性，可能与Ca(OH)?纳米颗粒协同作用，提高整体抗菌效果。这与大多数主要作为还原剂的植物提取物不同，后者通常不直接贡献于抗菌效果。此外，选择杨树蜂蜜（Ceiba pentandra）是因为先前的研究表明其含有高含量的还原糖和生物活性成分，这些成分与改善的纳米颗粒大小稳定性和增强抗菌活性相关[17], [18]。

在表面功能化方面，基于壳聚糖的系统因其生物相容性、阳离子性质和固有的抗菌性能而被广泛认可，适用于稳定和增强纳米颗粒与细菌之间的相互作用[21]。然而，大多数报道的系统使用的是块状壳聚糖或传统配方，这些配方往往溶解性有限且涂层效率不均匀。此外，金属基纳米颗粒的固有聚集倾向会进一步限制其表面活性和抗菌性能。为了解决这些问题，使用寡壳聚糖等生物聚合物进行表面功能化是一种有前景的策略[22,23]。寡壳聚糖具有优异的水溶性、生物相容性，并含有能够与纳米颗粒表面静电和化学相互作用的质子化胺基和羟基[24,25]。因此，本研究中使用寡壳聚糖不仅实现了更均匀的表面相互作用，还增强了生物性能。然而，将蜂蜜介导的钙基纳米颗粒合成与寡壳聚糖功能化和抗菌机制评估系统整合的研究仍然有限。

因此，本研究提出了一种绿色合成方法，用于生产经寡壳聚糖功能化的杨树蜂蜜衍生Ca(OH)?纳米颗粒，以生成稳定且具有生物活性的纳米复合材料。主要目标是开发一种环保、生物相容且有效的抗菌纳米材料，能够抑制革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）和革兰氏阴性（铜绿假单胞菌）病原体。值得注意的是，在优化阶段，表征主要依赖于UV-Vis光谱、FTIR和FESEM-EDX分析，以监测纳米颗粒的形成、官能团相互作用和形态特征。对所得材料的全面物理化学表征使用了UV-Vis光谱（光学性质）、FTIR（官能团相互作用）、XRD（结晶度）、FESEM-EDS（形态和元素组成）和TEM-SAED（形态和晶体结构）。此外，通过最小抑菌浓度（MIC）测定评估了抗菌活性，而CaNP基纳米复合材料与关键细菌蛋白的结构和化学相互作用则通过计算机模拟的分子对接确定。最后，通过卤虫致死性测试评估了体内毒性，以确保生物安全性和环境兼容性。

**2. 方法论**

**2.1. 材料和仪器**

使用二水合氯化钙（CaCl?·2H?O，≥99%，Merck）作为钙前驱体。杨树蜂蜜（Ceiba pentandra）来自印度尼西亚东爪哇玛琅的Tawon Rimba Raya农场。氢氧化钠（NaOH，Merck）和盐酸（HCl，Merck）用于调节pH值。所有实验过程中均使用蒸馏水（aquadest）作为溶剂。低分子量壳聚糖（脱乙酰度75–85%，Sigma-Aldrich）作为包覆剂。冰醋酸（CH?COOH，99%，EMSURE）用于壳聚糖的溶解。过氧化氢（H?O?，30%，SMART-LAB）用作解聚试剂。抗菌试验中使用了金黄色葡萄球菌（ATCC 25922）和铜绿假单胞菌（ATCC 9027）菌株。Mueller-Hinton肉汤（MHB，Merck）作为培养基。氯化钠（NaCl，分析纯度，Merck）用于溶液制备。毒性评估中使用了卤虫（Artemia salina）幼体进行卤虫致死性测试（BSLT）。

光学性质使用UV-Vis分光光度计（Shimadzu UV-1601 Series）分析，而官能团和表面相互作用通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，Shimadzu 8400S）检测。颗粒大小分布和ζ电位使用颗粒大小和ζ电位分析仪（PSA-DLS，Malvern Panalytical，英国）测定。表面形态和元素组成使用场发射扫描电子显微镜结合能量分散X射线光谱（FESEM-EDX，FEI Quanta FEG 650）研究。高分辨率形态和晶体结构分析使用带有选区电子衍射的透射电子显微镜（TEM-SAED，JEOL JEM-2100）进行。晶体结构通过X射线衍射（XRD，PANalytical X’Pert PRO）分析。热稳定性和有机含量使用差热-热重分析仪（DTG-TGA，Shimadzu DTG-60）评估。

**2.2. Ca(OH)?纳米颗粒的绿色合成优化**

Ca(OH)?纳米颗粒通过使用杨树蜂蜜（Ceiba pentandra）作为生物还原剂和二水合氯化钙（CaCl?·2H?O）作为钙前驱体的绿色合成路线制备。典型的制备过程中，水基蜂蜜溶液（1.75–5% v/v，pH 5.6–6.3）显示出微酸性至接近中性的pH值（pH 5.8–6.1），具体取决于稀释程度。CaCl?前驱体溶液的pH值为接近中性（pH 6.9）。在固定比例（1:1 v/v，250 rpm，27–30°C）下混合两种溶液，可以得到初始pH值为6.8的均匀反应混合物。反应混合物在80°C下磁力搅拌并热处理预定时间。Ca(OH)?纳米颗粒的形成可通过逐渐出现的黄色胶体悬浮液直观判断。为了确定最佳合成条件，对四个关键参数进行了系统实验：反应pH（4–12），使用10% NaOH或2 M HCl调节；蜂蜜浓度（1.75%、2.5%和5%）；CaCl?前驱体浓度（0.025、0.05和0.1 M）；以及反应时间（30、45和60分钟），其他参数保持不变，详见表1。

**表1. Ca(OH)?纳米颗粒绿色合成的优化参数**

| 优化参数 | pH | 蜂蜜浓度（%） | CaCl?浓度（M） | 反应时间（分钟） |
|------------------|-------------|--------------|-------------|-----------|
| | | | | |
| | 4.0 | 0.05 | 4.5 | 5.0 |
| | 5.0 | 0.05 | 4.5 | 8.5 |
| | 10.0 | 0.05 | 4.5 | 12.0 |
| | 12.0 | 0.05 | 4.5 | 12.5 |
| | 15.0 | 0.05 | 4.5 | 12.5 |
| | 25.0 | 0.025 | 4.5 | 12.5 |
| | 25.0 | 0.05 | 4.5 | 12.5 |

**2.3. 表面改性的Ca(OH)?纳米颗粒**

在优化条件下合成的Ca(OH)?纳米颗粒通过寡壳聚糖涂层进行表面改性。合成后，纳米颗粒悬浮液经过纯化以去除未结合的蜂蜜残留物和过量的寡壳聚糖。悬浮液在10,000 rpm下离心10分钟，丢弃含有游离有机成分的上清液。收集的沉淀物用蒸馏水洗涤三次，确保去除松散结合或游离的生物分子。然后使用温和的超声处理将纯化的纳米颗粒重新分散在蒸馏水中，以获得稳定的胶体悬浮液。这一步确保后续表征主要反映的是表面结合的配体而非溶液中的游离残留物。

寡壳聚糖是通过低分子量壳聚糖的受控解聚和部分脱乙酰化制备的，遵循先前的报道[12]。简要来说，将0.4克壳聚糖溶解在20毫升1%（v/v）醋酸中，连续搅拌2小时得到均匀溶液。加入20毫升10%（v/v）过氧化氢开始解聚反应，再搅拌2小时。随后使用10% NaOH将反应混合物调整至pH 7，过滤后收集滤液作为寡壳聚糖溶液。在涂层过程中，Ca(OH)?纳米颗粒与新鲜制备的寡壳聚糖溶液以1:1的体积比混合。在室温（27–30°C）下持续搅拌250 rpm的情况下逐渐将纳米颗粒引入寡壳聚糖溶液中。这种受控的添加过程促进了寡壳聚糖链在Ca(OH)?纳米粒子表面的均匀吸附，生成了稳定的Ca(OH)?–寡壳聚糖纳米复合材料，这些复合材料以分散良好且光学透明的胶体悬浮液的形式获得。2.4. 特性分析2.4.1. 结构特性合成的Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖纳米复合材料的光学特性通过UV–Vis光谱法进行了表征。测量在200–800纳米的波长范围内进行，以检测特征吸收特性并评估纳米颗粒的形成和分散稳定性。与纳米颗粒制造和表面涂层相关的官能团通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱法进行了研究。FTIR光谱在4000–400厘米?1的波数范围内记录了纯蜂蜜、寡壳聚糖、Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖纳米复合材料。分析重点关注羟基、胺和碳酸盐相关振动的变化，以确认Ca(OH)?的形成和寡壳聚糖在纳米粒子表面的吸附。通过XRD分析检查了合成材料的晶体结构和相组成。使用Cu Kα辐射（λ = 1.5406 ?）在2θ范围10–80°内收集衍射图谱。获得的衍射图与标准参考数据进行了比较，以确认Ca(OH)?的结晶形成，并评估寡壳聚糖涂层对结晶性的影响。此外，结合TEM进行了SAED分析，以提供关于纳米尺度上结晶性和晶格结构的补充信息。SAED图案被分析以识别与Ca(OH)?相对应的特征衍射环或点，从而支持XRD结果并提供局部结构确认。TGA用于评估冻干Ca(OH)?–寡壳聚糖中的有机含量和配体覆盖率。样品在氮气气氛下以10°C分钟的加热速率从30°C加热到800°C。重量损失曲线用于区分物理吸附的水、有机成分和无机残留物，从而估计表面结合的寡壳聚糖和蜂蜜衍生的生物分子。2.4.2. 形态和颗粒大小特性使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）研究了Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?–寡壳聚糖纳米复合材料的表面形态和微观结构特征。分析前，样品被干燥，粘贴在导电碳带上，并溅射了一层薄导电层。使用ImageJ软件从FESEM图像定量分析了颗粒大小分布。从多个显微图中随机选择了至少100个单独的颗粒以确保统计可靠性。颗粒直径被测量并使用Origin软件处理以获得大小分布直方图。使用与FESEM系统耦合的EDX分析了元素组成和空间分布，以确认钙和氧作为主要成分，并验证不存在不需要的杂质。此外，还进行了TEM分析，以进一步阐明内部结构、颗粒大小分布和纳米尺度的形态。使用颗粒大小分析（PSA）确定了纳米颗粒的大小分布和平均流体动力学直径。在环境条件下对样品的水性分散液进行了测量。获得的大小分布用于评估合成参数和寡壳聚糖涂层对纳米颗粒分散和聚集行为的影响。2.5. 体外抗菌活性测试使用肉桂树蜂蜜、Ca(OH)?纳米颗粒、寡壳聚糖和Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性，ATCC 25922）和铜绿假单胞菌（革兰氏阴性，ATCC 9027）的抗菌活性进行了评估，采用肉汤稀释法。细菌菌株首先在营养琼脂斜面上复苏并在37°C下孵育24小时[26]。Mueller–Hinton肉汤（MHB）通过将5克培养基溶解在250毫升蒸馏水中制备，灭菌后接种测试细菌。在96孔微孔板中评估了肉桂树蜂蜜、Ca(OH)?纳米颗粒、寡壳聚糖和Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖纳米复合材料的抗菌活性。测试样品的浓度分别为1000、500、300、150、50、25和5 ppm，然后进行两倍系列稀释。每个孔接受了20微升标准细菌悬浮液（约10? CFU mL?1）。环丙沙星被用作阳性对照，而无菌蒸馏水作为阴性对照。环丙沙星被用作阳性对照来验证实验，而无菌蒸馏水（水）作为阴性对照。所有实验进行了三次重复（n = 3），数据以平均值±标准差（SD）表示。使用单向方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行事后检验以评估组间差异。p值小于0.05（p < 0.05）被认为是统计学上显著的。在37°C下孵育24小时后，通过使用微孔板读取器在420纳米处测量光密度来量化细菌生长。最小抑制浓度（MIC）定义为防止任何可检测到的光密度增加或可见细菌生长的最低浓度[18]。2.6. 计算机模拟抗菌活性进行了分子对接模拟，以研究Ca(OH)?纳米颗粒（裸露的和寡壳聚糖功能化的）与金黄色葡萄球菌（PDB ID: 1MWT）和铜绿假单胞菌（PDB ID: 6UN1）的关键细菌蛋白的相互作用。蛋白质1MWT代表参与革兰氏阳性细胞壁生物合成和固定的关键酶，而6UN1是一种负责革兰氏阴性细菌外膜稳定性和运输调节的膜相关蛋白。选择这些靶标是因为它们的生物学功能与基于Ca(OH)?的纳米材料的预期抗菌机制一致，这些纳米材料预计会干扰细胞壁完整性和膜稳定性。通过去除天然配体、添加极性氢原子并验证结构完整性来准备受体结构，以确保准确的结合预测。使用ChemSketch 12.0构建了配体结构，包括天然配体、Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?–寡壳聚糖纳米复合材料，并使用Avogadro进行了能量最小化。由于经典对接算法不是为完整的纳米粒子设计的，Ca(OH)?被建模为一个化学上代表性的Ca–OH簇，保留了氢氧化钙的局部配位，而寡壳聚糖涂层系统则由同一个Ca–OH簇与短链质子化寡壳聚糖寡聚物复合物表示。这种简化表示保留了负责蛋白质和膜相互作用的关键官能团（羟基化的Ca位点和质子化的胺），同时与原子级对接兼容。使用Marvin Sketch 5.2.5.1生成了多种配体构象，并使用AutoDock 4.0和Lamarckian遗传算法（LGA）进行了柔性对接。基于对接能量得分评估结合亲和力，其中较低的值表示更 favorable的相互作用。使用PyMOL 3.0可视化和分析了得分最高的复合物，以研究三维结合模式和分子间相互作用，包括氢键、静电力和疏水接触。对接实验还提供了关于天然配体、Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?–寡壳聚糖纳米复合材料在革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌靶标上不同结合行为的机制洞察，从而证实了实验观察到的抗菌活性。2.7. 体内毒性评估使用盐水虾致死试验（BSLT）在伦理批准号177-KEP228 UB-2024下评估了Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖纳米复合材料的体内毒性。使用的测试生物是Artemia salina nauplii，20个幼虫用不同浓度的测试溶液处理。在标准环境下孵育24小时后，评估了幼虫的存活率。如果在30秒内没有观察到前进运动，则认为幼虫已经死亡[17]。记录了每个浓度的活幼虫和死幼虫的数量，并使用公式（1）计算死亡率：(1)[Math Processing Error]%死亡率=死幼虫数量/总幼虫数量(死+活)×100我们使用死亡率数据来确定LC??值，定义为引起50%死亡率所需的浓度。LC??作为毒性的定量指标，用于比较Ca(OH)?纳米颗粒与Ni(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖的生物相容性和环境安全性。3. 结果和讨论3.1. Ca(OH)?纳米颗粒合成的原理使用蜂蜜合成Ca(OH)?纳米颗粒（Ca(OH)? NPs）是一个多步骤过程，包括离子化、络合、成核和生长，其中蜂蜜作为天然的螯合和稳定基质。最初，氯化钙二水合物（CaCl?·2H?O）在水中容易解离，释放出自由的Ca2?离子[27]，反应式如下：(1)a)CaCl?·2H?O → Ca2? (aq) + 2Cl? + 2H?O。在没有蜂蜜的情况下，Ca2?离子立即与NaOH提供的氢氧根离子反应，导致Ca(OH)?沉淀物的快速形成，其尺寸控制较差且聚集明显。然而，在蜂蜜的存在下，糖类、氨基酸和多酚中的丰富官能团（如羟基（–OH）、羰基（C=O）和羧基（–COOH）与Ca2?离子相互作用，形成弱配合物（反应式（2）：(2)Ca2? (aq) + (C=O/OH/COOH)????? ? [Ca–honey]2?。这种瞬态络合步骤有效地缓冲了自由Ca2?离子的可用性，从而调节了过饱和度，从而减慢了成核速率。随着NaOH的逐渐添加，氢氧根离子与未络合的Ca2?和[Ca–honey]2?复合物反应，导致Ca(OH)?核的受控生成（反应式（3）：(3)[Ca–honey]2? + 2OH? → Ca(OH)? (核)。与没有蜂蜜时突然的沉淀不同，这种受控的Ca2?释放导致了均匀的成核和更细小的颗粒形成。随后在80°C下的温和加热促进了Ca(OH)?纳米颗粒的生长和结晶，同时使蜂蜜中的生物分子通过氢键和静电相互作用吸附到纳米粒子表面（反应式（4）：(4)Ca(OH)? (核) + 生物分子????? + Δ (80°C) → Ca(OH)? NPs–honey。在这个最终阶段，蜂蜜生物分子作为有效的封盖和稳定剂，形成了围绕纳米粒子表面的保护性有机层。这一层提供了空间和静电稳定，防止聚集并确保胶体的均匀性[28]。重要的是，蜂蜜在整个合成过程中起着双重机制作用。在初始阶段，它作为还原和络合剂，其中丰富的还原糖（例如葡萄糖和果糖）和含氧官能团通过瞬态配位相互作用调节Ca2?离子的可用性，从而控制成核并防止快速、不受控制的沉淀。在随后的阶段，这些生物分子吸附到纳米粒子表面，作为钝化和稳定生长颗粒的封盖剂。这种综合功能使得在一个系统中实现了受控的成核–生长动力学和有效的表面稳定。因此，形成了均匀且稳定的Ca(OH)?纳米颗粒，具有更好的分散性和减少的聚集，显示出比传统合成方法明显的优势。3.2. pH对Ca(OH)?纳米颗粒形成和特性的影响反应介质的pH在控制通过蜂蜜介导途径合成的Ca(OH)?纳米颗粒的成核和生长动力学中起着关键作用[29]。视觉观察（图1a）显示了反应混合物的明显颜色变化，从酸性和中性条件（pH 4–8）的无色到pH 10的淡黄色，再到pH 12的深黄色。在较高pH值下颜色的增强表明Ca2?水解速率增加和随后Ca(OH)?核的形成增加，这是由于强碱性介质中氢氧根离子的可用性更高。相反，在低pH值下，蜂蜜中的羟基和羰基的质子化抑制了它们的配位和还原能力，导致颗粒形成几乎没有。下载：下载高分辨率图像（453KB）下载：下载全尺寸图像图1. 不同pH条件下Ca(OH)?纳米颗粒的视觉外观（a）、UV–Vis吸收光谱（b）和FTIR光谱（c）。UV–Vis分析（图1b）进一步证实了这一观察。在pH 12下制备的样品在368纳米处显示出一个明显的吸收峰，与pH 10相比吸收强度明显更高，确认在更碱性条件下Ca(OH)?纳米颗粒的成核和生长增强。这个吸收带归因于与纳米化Ca(OH)?的电子结构相关的带间跃迁，并反映了分散在胶体相中的纳米颗粒密度增加。pH 10时更平滑且强度较低的曲线表明还原不完全和成核有限，产生较少且较大的聚集物。FTIR光谱（图1c）提供了关于形成的纳米颗粒化学环境的补充信息。两个样品都显示了特征振动带，分别在3261厘米?1（O–H伸缩）、1621厘米?1（C=O伸缩）和1407厘米?1（C–H弯曲），表明蜂蜜衍生的生物分子（如多酚、碳水化合物和蛋白质）成功吸附在纳米粒子表面。777厘米?1处的强吸收带对应于Ca–O伸缩模式，确认了Ca(OH)?的存在。在pH 12下该带的强度更高，表明在高度碱性条件下Ca(OH)?的结晶度更高和产量更高。同时，1018厘米?1附近的持续C–O振动表明表面仍有有机官能团，这些官能团有助于纳米颗粒的立体和静电稳定。通过FESEM–EDX（图2）的形态和组成分析揭示了在pH 10和pH 12下合成的样品之间的明显差异。在pH 10时（图2a），显微照片显示了松散聚集的簇，形状不规则，平均粒径约为30.4纳米，表明生长过程未被有效控制且部分发生了团聚。相比之下，在pH 12时（图2b），纳米颗粒呈现出明显的片状或板状结构，平均粒径显著减小至17.3纳米，这一点通过更窄的粒径分布（R2 = 0.92077）得到了验证。这种形态表明晶体生长具有各向异性，这是由于氢氧根离子选择性地吸附在特定的晶面上，促进了超薄纳米片的形成。虽然动态光散射（DLS）通常用于评估胶体系统中的粒子尺寸，但它对粒子团聚非常敏感。在本研究中，尺寸分析主要基于扫描电子显微镜（SEM）测量来得出实际的核心粒径。SEM图像中观察到的团聚现象归因于样品制备过程中的干燥效应，而非粒子本身的性质。

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图2. 对pH 10（a）和pH 12（b）条件下合成的Ca(OH)2纳米颗粒的FESEM–EDX分析：表面形态（放大30,000倍）、元素分布图以及粒径分布。EDX元素分析证实了Ca和O为主要成分（见图S1），证实了基于钙的氢氧化物纳米结构的形成。检测到的C以及少量元素（Na、Cl、K）表明表面吸附了来自蜂蜜的有机残留物和前体物质。值得注意的是，pH 12样品中的均匀元素分布支持了这些纳米颗粒具有均匀分布且表面覆盖了一层薄有机膜的结论。这层有机膜通过空间位阻和静电稳定的作用防止了颗粒的聚集，保持了胶体的稳定性。

从机制角度来看，pH值在调控纳米颗粒的成核和稳定过程中起着双重作用。在较高pH值下，蜂蜜中的羟基和羧基发生脱质子作用，增强了它们与Ca2+离子的螯合作用，形成了弱的Ca–蜂蜜复合物，从而控制了钙离子向溶液中的释放。同时，丰富的OH-离子促进了Ca(OH)2纳米颗粒的快速饱和，从而引发了均匀的成核过程。吸附的蜂蜜生物分子作为封端剂，调节了晶体生长并防止了颗粒聚集。这些过程之间的协同作用导致pH 12下的纳米颗粒比pH 10下的更小、结晶度更高且更稳定。

光学、光谱和形态学证据表明，pH 12是合成Ca(OH)2纳米颗粒的最佳条件。碱性的增强环境促进了氢氧化物介导的成核过程，同时没有丧失蜂蜜生物分子的稳定作用。因此，生成的纳米颗粒分散性非常好，粒径分布狭窄，表面钝化均匀，这些特性对于高反应性、稳定性和生物相容性应用至关重要。

3.3 蜂蜜浓度对Ca(OH)2纳米颗粒形态和结构的影响
蜂蜜的固有稳定作用对确定这些合成纳米颗粒的成核速率、晶体生长及表面稳定性至关重要[30]。如图3a所示，随着蜂蜜浓度（1.75%、2.5%和5%）的增加，所有反应混合物均呈现黄色，且颜色逐渐加深。这一发现表明，大量的蜂蜜生物分子促进了Ca2+离子与羟基、羰基和羧基等官能团的配位，从而调节了成核与生长过程的平衡。

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图3. 不同蜂蜜浓度下Ca(OH)2纳米颗粒的视觉外观（a）、UV–Vis吸收光谱（b）和FTIR光谱（c）。
UV–Vis光谱（图3b）显示所有样品在367 nm附近都有一个稳定的吸收峰，这与Ca(OH)2纳米颗粒的光学转变一致。需要注意的是，吸光强度随蜂蜜浓度的增加而持续增强，在5%时达到峰值。更高的吸光强度表明纳米颗粒产率更高，因此表面等离子体共振效应更强，因为更多的有机配体使得成核位点更加密集。5%蜂蜜浓度下相对较宽的吸收峰也表明纳米颗粒数量增加且粒径分布略有改变。而在1.75%和2.5%的浓度下，吸光强度较低，可能是因为还原和封端分子较少，导致成核不完全。

图3c中的FTIR光谱进一步验证了蜂蜜在这些颗粒合成中的重要作用。所有样品中都存在典型的O–H伸缩振动（3267 cm-1），其中5%样品的振幅最强，表明纳米颗粒的氢键作用和表面羟基化程度更好。在1583 cm-1（C=O伸缩）、1414 cm-1（C–H弯曲）和1105 cm-1（C–O伸缩）处观察到的峰表明存在蜂蜜中的有机残留物，并且这些有机物质参与了成核过程。611 cm-1处的强峰对应于Ca–O伸缩振动，支持了Ca(OH)2的形成。5%浓度下O–H和Ca–O峰的强度增加表明结晶度更高，有机-无机相互作用更强烈，这得益于官能团的优化利用，有助于成核和表面钝化的进行。

FESEM-EDX形态学和元素分析（图4）进一步支持了这些光谱结果。在低浓度（1.75%）下，检测到较大的不规则聚集体（平均粒径120.47纳米），表明由于缺乏足够的封端剂而使得粒子生长失控（图4a）。将蜂蜜浓度增加到2.5%（图4b）后，产生的纳米颗粒呈小球状或片状，平均粒径为32.97纳米，显示出对成核和生长过程的更好控制。最高浓度（5%，图4c）下的纳米颗粒分布更均匀，呈现细颗粒状，平均直径为19.37纳米（R2 = 0.99072）。这一显著尺寸的减小证明了蜂蜜生物分子在稳定纳米颗粒表面、通过空间位阻和静电排斥防止团聚方面的有效性。

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图4. 对不同蜂蜜浓度（1.75%、2.5%和5%）下合成的Ca(OH)2纳米颗粒的FESEM–EDX分析：表面形态（放大30,000倍）、元素分布图以及粒径分布。EDX光谱证实了Ca和O为主要成分，进一步验证了氢氧化钙的形成。样品中检测到C、Cl以及少量Zn和Na，分别对应于蜂蜜中的有机成分和前体残留物。5%样品中均匀的元素分布进一步证实了纳米颗粒表面覆盖了一层均匀的有机膜（元素分布见图S2）。这层由糖类、氨基酸和多酚化合物组成的有机膜作为多功能封端层，减少了颗粒聚集并提高了胶体稳定性。

蜂蜜浓度的逐渐增加改善了成核与生长之间的平衡。在低浓度下，活性生物分子较少，导致Ca(OH)2快速但无序沉淀，形成粗糙的、多分散的聚集体。在中等到高浓度（2.5–5%）下，丰富的羟基和羰基有效协调了Ca2+离子，形成了短暂的Ca–蜂蜜复合物，使Ca2+缓慢释放到反应介质中。这种受控的离子释放促进了均匀的成核，同时周围的生物分子吸附在颗粒表面，限制了生长和团聚。结果是产生了更小、更结晶且高度稳定的纳米颗粒。

所有使用UV–Vis、FTIR和FESEM–EDX进行的分析均表明，增加蜂蜜浓度可以提高纳米颗粒的均匀性和结晶度，5%被认为是合成Ca(OH)2纳米颗粒的最佳条件。在这种条件下，生物分子介导的成核控制和表面封端的协同作用形成了单分散的纳米级Ca(OH)2颗粒，具有优异的胶体稳定性和表面功能，适用于生物医学和催化应用。

3.4 CaCl2浓度对Ca(OH)2纳米颗粒形成和结构特性的影响
前体CaCl2的浓度显著影响Ca(OH)2纳米颗粒的成核动力学、生长速率和总体产率[31]，尤其是在优化的绿色合成条件下（pH 12、5%蜂蜜、45分钟、80°C）。视觉观察（图5a）显示，随着前体浓度从0.025 M增加到0.1 M，胶体溶液逐渐变暗，表明颗粒形成增多，固体含量增加。黄色变深反映了纳米颗粒密度的增加以及光散射增强，表明在高Ca2+浓度下成核事件更快。UV–Vis光谱（图5b）进一步证实了这一点，所有样品在368 nm附近都有一个特征吸收峰。吸光强度随前体浓度的增加而持续增强，5%时达到峰值，表明纳米颗粒产率更高，表面等离子体共振效应更强，因为更多有机配体的存在提供了更密集的成核位点。5%浓度下相对较宽的吸收峰也表明纳米颗粒数量增加，粒径分布略有改变。相反，在1.75%和2.5%的浓度下，吸光强度较低，可能是因为还原和封端分子较少。

图3c中的FTIR光谱进一步强调了蜂蜜在这些颗粒合成中的重要作用。所有样品中都存在典型的O–H伸缩振动（3267 cm-1），5%样品中的振动强度最强，表明氢键作用和纳米颗粒表面羟基化程度更好。在1583 cm-1（C=O伸缩）、1414 cm-1（C–H弯曲）和1105 cm-1（C–O伸缩）处观察到的峰表明存在蜂蜜中的有机残留物，并参与了成核过程。611 cm-1处的强峰对应于Ca–O伸缩振动，支持了Ca(OH)2的形成。5%浓度下O–H和Ca–O峰的强度增加表明结晶度更高，有机-无机相互作用更强，这得益于官能团的优化利用，有助于成核和表面钝化的进行。

FESEM-EDX形态学和元素分析（图4）证实了这些光谱结果。在低浓度（1.75%）下，检测到较大的不规则聚集体（平均粒径120.47纳米），表明由于缺乏足够的封端剂而使得颗粒生长失控（图4a）。将蜂蜜浓度增加到2.5%（图4b）后，产生的纳米颗粒呈小球状或片状，平均粒径为32.97纳米，表明对成核和生长动力学的控制更好。在最高浓度（5%，图4c）下，纳米颗粒分布更加均匀，呈现细颗粒状，平均直径为19.37纳米（R2 = 0.99072）。这种尺寸的显著减小证明了蜂蜜生物分子在稳定纳米颗粒表面和防止团聚方面的有效性。

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图4. 对不同CaCl2浓度（1.75%、2.5%和5%）下合成的Ca(OH)2纳米颗粒的FESEM–EDX分析：表面形态（放大30,000倍）、元素分布图以及粒径分布。EDX光谱证实了Ca和O为主要成分，进一步验证了氢氧化钙的形成。样品中存在C、Cl以及少量的Zn和Na，分别对应于蜂蜜中的有机成分和前体残留物。5%样品中均匀的元素分布进一步证实了纳米颗粒表面覆盖了一层均匀的有机膜（元素分布见图S2）。这层薄有机膜由糖类、氨基酸和多酚化合物组成，作为多功能封端层，减小了颗粒聚集并提高了胶体稳定性。

蜂蜜浓度的逐渐增加改善了成核与生长之间的平衡。在低浓度下，活性生物分子较少，导致Ca(OH)2快速但无序沉淀，形成粗大、多分散的聚集体。在中等到高浓度（2.5–5%）下，丰富的羟基和羰基有效协调了Ca2+离子，形成了短暂的Ca–蜂蜜复合物，使Ca2+缓慢释放到反应介质中。这种受控的离子释放促进了均匀的成核，同时周围的生物分子吸附在颗粒表面，限制了生长和团聚。结果是产生了更小、分布更均匀、形态更均匀的纳米颗粒。

所有分析均使用UV–Vis、FTIR和FESEM–EDX技术进行，结果表明增加蜂蜜浓度可以提高纳米颗粒的均匀性和结晶度，5%被认为是合成Ca(OH)2纳米颗粒的最佳条件。在这种条件下，生物分子介导的成核控制和表面封端的协同作用形成了单分散的纳米级Ca(OH)2颗粒，具有优异的胶体稳定性和表面功能，适用于生物医学和催化应用。

3.4 CaCl2浓度对Ca(OH)2纳米颗粒形成和结构特征的影响
前体CaCl2的浓度显著影响Ca(OH)2纳米颗粒的成核动力学、生长速率和总体产率[31]。随着前体浓度从0.025 M增加到0.1 M（优化条件：pH 12、5%蜂蜜、45分钟、80°C），胶体溶液逐渐变暗，表明颗粒形成增多，固体含量增加。颜色由黄色变为黄棕色，反映了纳米颗粒密度的增加以及光散射增强，表明在高Ca2+浓度下成核事件更快。

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图5. 不同CaCl2浓度下Ca(OH)2纳米颗粒的视觉外观（a）、UV–Vis吸收光谱（b）和FTIR光谱（c）。

这一现象还得到了UV–Vis光谱（图5b）的佐证。所有样品在368 nm附近都显示出一个特征吸收峰，对应于Ca(OH)2纳米结构的带间跃迁。特别是，吸光强度随前体添加量的增加而逐渐增强，表明高Ca2+浓度有利于广泛的成核和颗粒生长。然而，在0.1 M时，光谱宽化，表明可能存在部分聚集或异质性，这是由于离子浓度过高导致成核动力学控制减弱。相比之下，0.025 M时的吸收曲线更尖锐且对称，表明纳米颗粒均匀形成，团聚现象较少。0.05 M的中间浓度样品表现出平衡的光学性质、适中的吸光强度和窄的光谱宽度，表明成核与生长之间的平衡得到优化。

这些光学观察结果符合浓度依赖性的胶体稳定性的一般原理。在低前体浓度（0.025 M）下，离子种类不足导致饱和过程缓慢，成核缓慢但控制效果增强，产生了较小的单分散纳米颗粒。在高浓度（0.1 M）下，快速饱和引发无控制的成核和二次聚集，产生了多分散且不稳定的胶体。0.05 M时观察到的最佳光学和胶体特性表明蜂蜜衍生配体与Ca2+离子之间的高效协调，促进了均匀的成核并保持了足够的表面钝化。

FTIR光谱（图5c）提供了这些相互作用的分子级证据。所有样品在3283 cm-1附近都显示出一个宽吸收峰，对应于O–H伸缩振动，证实了纳米颗粒表面的羟基化。1607 cm-1（C=O伸缩）和1420 cm-1（C–H弯曲）的峰来源于蜂蜜中的有机残留物，表明它们参与了成核过程。611 cm-1处的强峰对应于Ca–O伸缩振动，支持了Ca(OH)2的形成。5%浓度下O–H和Ca–O峰的强度增加表明结晶度更高，有机-无机相互作用更强，这得益于官能团的优化利用，有助于成核和表面钝化的进行。

FESEM-EDX形态学和元素分析（图4）支持了这些光谱结果。在低浓度（1.75%）下，检测到大的不规则聚集体（平均粒径120.47纳米），表明由于缺乏足够的封端剂，颗粒生长失控（图4a）。将蜂蜜浓度增加到2.5%（图4b）后，产生的纳米颗粒呈小球状或片状，平均粒径为32.97纳米，表明对成核和生长动力学的控制更好。在最高浓度（5%，图4c）下，纳米颗粒分布更加均匀，呈现细颗粒状，平均直径为19.37纳米（R2 = 0.99072）。这种尺寸的显著减小证明了蜂蜜生物分子在稳定纳米颗粒表面和防止团聚方面的有效性。

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图4. 对不同CaCl2浓度（1.75%、2.5%和5%）下合成的Ca(OH)2纳米颗粒的FESEM–EDX分析：表面形态（放大30,000倍）、元素分布图以及粒径分布。EDX光谱证实了Ca和O为主要成分，进一步验证了氢氧化钙的形成。样品中存在C、Cl以及少量的Zn和Na，分别对应于蜂蜜中的有机成分和前体残留物。5%样品中均匀的元素分布进一步证实了纳米颗粒表面覆盖了一层均匀的有机膜（元素分布见图S2）。这层有机膜由糖类、氨基酸和多酚化合物组成，作为多功能封端层，减少了颗粒聚集并提高了胶体稳定性。

蜂蜜浓度的逐渐增加改善了成核与生长之间的平衡。在低浓度下，活性生物分子较少，导致Ca(OH)2快速但无序沉淀，形成粗糙、多分散的聚集体。在中等到高浓度（2.5–5%）下，丰富的羟基和羰基有效协调了Ca2+离子，形成了短暂的Ca–蜂蜜复合物，使Ca2+缓慢释放到反应介质中。这种受控的离子释放促进了均匀的成核，同时周围的生物分子吸附在颗粒表面，限制了生长和团聚。结果是产生了更小、分布更均匀、形态更均匀的纳米颗粒。

所有使用UV–Vis、FTIR和FESEM–EDX进行的分析均表明，增加蜂蜜浓度可以提高纳米颗粒的均匀性和结晶度，5%被认为是合成Ca(OH)2纳米颗粒的最佳条件。在这种条件下，生物分子介导的成核控制和表面封端的协同作用导致形成了单分散的纳米级Ca(OH)2颗粒，具有优异的胶体稳定性和表面功能，适用于生物医学和催化应用。

3.4 CaCl2浓度对Ca(OH)2纳米颗粒形成和结构特征的影响
前体CaCl2的浓度显著影响Ca(OH)2纳米颗粒的成核动力学、生长速率和总体产率[31]。在优化的绿色合成条件下（pH 12、5%蜂蜜、45分钟、80°C），前体CaCl2浓度的变化显著影响了Ca(OH)2纳米颗粒的性质这些高度均匀且分布均匀的棒状颗粒表明，较低的前体浓度促进了可控的成核和逐渐增长，因为过饱和率适中，足以使蜂蜜中的生物分子有效协调并稳定新兴的核。EDX光谱显示Ca和O的主要峰值，证实了Ca(OH)?的成功形成，而Na和Cl的微量存在来自用于调节pH值的前体和NaOH。均匀的元素分布进一步支持了Ca和O在整个样品表面的均匀分布，表明蜂蜜衍生的有机配体起到了有效的稳定作用。在中等浓度（0.05 M，图6b）下，纳米颗粒呈现出短棒状和片状聚集体混合的形态，平均粒径增加到64.52纳米。这种粒径的适度增加反映了较高的离子过饱和度，加速了成核事件并促进了部分聚集。尽管如此，蜂蜜生物分子仍提供了足够的覆盖层，确保了良好的分散性并防止了完全的团聚。EDX分析确认了Ca、O、C以及少量的Na和Cl的存在，进一步证明了有机-无机杂化结构的存在。相应的元素分布图显示钙和氧的均匀分布，表明蜂蜜中的生物分子基质即使在较高的离子强度条件下也能保持活性。

在最高浓度（0.1 M，图6c）下，显微镜图显示出了由棒状纳米颗粒聚集而成的花状簇的显著形态转变。平均粒径显著增加到148.33纳米（R2 = 0.92344），表明发生了严重的聚集和次级粒子生长。这种形态演变可以归因于过高的离子强度导致过饱和，超过了蜂蜜生物分子的协调能力。结果，快速的成核和碰撞驱动的团聚发生了，产生了不规则的聚集体。EDX谱仍然显示Ca和O是主要元素，证实了化学成分仍然是Ca(OH)?，但更宽的峰型和不太均匀的元素分布表明了覆盖效率和胶体均匀性的下降。上述发现证明了成核控制与聚集之间的浓度依赖性平衡。在低Ca2?浓度下，有限的离子活性允许蜂蜜生物分子形成短暂的Ca–蜂蜜复合物，缓慢地向介质中释放Ca2?，从而确保了均匀的成核和有效的有机稳定。随着浓度的增加，过饱和率超过了稳定阈值，导致多个生长前沿的共存和次级聚集。过高的前体浓度（0.1 M）导致颗粒之间的碰撞频率增加，尽管有覆盖剂的存在，仍形成了微米级的组装体。

形态和组成分析表明，0.05 M是合成分散良好、晶态Ca(OH)?纳米颗粒的最佳前体浓度。在这种最佳条件下，Ca2?的可用性稳定性以及蜂蜜诱导的覆盖作用，导致了均匀的纳米级结构，元素分布相对均匀。相反，较低和较高的前体浓度破坏了这种平衡，导致了成核不足或过度聚集的产品。这一结果显示了前体浓度作为控制绿色合成的Ca(OH)?纳米颗粒的粒子大小、形态和表面功能的关键参数之一的重要性。

3.5 反应时间对Ca(OH)?纳米颗粒形成和结构特性的影响
特别是对于通过蜂蜜增强绿色途径获得的纳米结构材料（如Ca(OH)?纳米颗粒）的成核、生长和稳定而言，反应时间是一个关键因素[32,33]。图7a中观察到的胶体悬浮液显示，颜色从30分钟时的淡黄色逐渐变为60分钟后的黄褐色，表明随着时间的推移，形成纳米颗粒的潜力更大。这种视觉上的加深与更高的光学密度和颗粒浓度有关，这与Ca(OH)?核向稳定纳米颗粒形成的时间依赖性演变相对应。

这一观察结果的定量支持来自UV–Vis吸收光谱（图7b）。所有样品光谱中显示的吸收带位于330–350纳米范围内，对应于纳米级Ca(OH)?的电子跃迁。从30分钟到45分钟，吸收强度显著增加，似乎反映了反应过程中的成核和生长。45分钟时检测到最高的吸收强度，并与342纳米处的强峰相关，表明材料中聚集了密集的纳米级颗粒。将反应时间延长到60分钟并没有显著改变峰位，但导致光谱宽度略有增加，这是由于系统达到过饱和平衡后发生的二次聚集或颗粒团聚。因此，45分钟是成核和逐渐生长的最佳阶段，而高温通常会促进成熟过程而不是进一步纳米颗粒的形成。吸收波长的变化以及反应时间研究中观察到的约367纳米处峰值的消失在纳米颗粒合成系统中是正常的。在某些情况下，Ca(OH)?纳米颗粒并未显示单一固定的吸收峰，而是通常在330–370纳米范围内表现出宽的吸收范围，这取决于颗粒大小、分散状态和局部化学环境[34,35]。因此，367纳米处峰值的轻微移动或减弱可以归因于反应过程中成核和生长动态的变化。随着反应时间的延长，较小或中等大小的物种可能演变为更稳定的纳米颗粒结构，导致光学吸收行为的变化，包括峰值的宽化或移动。这种行为在颗粒大小分布和表面相互作用随时间演变的纳米颗粒系统中常见。

FTIR光谱（图7c）通过在不同反应周期中阐明表面活性和功能（相互作用）基团来确认这些结果。我们观察到所有样品在约3263厘米?1处都有强烈的O–H拉伸峰，证实了Ca(OH)?发生了羟基化，并且蜂蜜衍生的多元醇附着在纳米颗粒表面。1591厘米?1（C=O拉伸）、1416厘米?1（C–H弯曲）和1051厘米?1（C–O拉伸）的峰是由蜂蜜成分（碳水化合物和酚类）生成的有机基团，它们既是还原剂也是覆盖剂。值得注意的是，在接近606厘米?1处还观察到了特征性的Ca–O拉伸振动，进一步证实了Ca(OH)?的形成。应当注意的是，FTIR光谱显示，随着反应时间从30分钟增加到45分钟，O–H和Ca–O峰的强度都有所增强，表明结晶度提高，羟基组的表面覆盖也得到了改善。然而，在60分钟时，光谱显示出3200–1600厘米?1区域的轻微宽化和透射率降低，表明表面结合的有机配体发生了部分脱水或重组。这种现象可能是由于长时间的热暴露引起的，可能导致覆盖层的重新排列或羟基组的凝结，略微降低了有机-无机界面的均匀性。这些结果可以通过Ca(OH)?形成过程的逐步演变来解释。在早期阶段（30分钟），成核占主导地位，因为钙离子与蜂蜜生物分子反应形成初级核。在30到45分钟之间，这些核在覆盖分子的调节作用下稳定生长，形成了稳定的、结晶良好的纳米颗粒。超过45分钟后，由于系统接近平衡，生长速率减慢，Ostwald成熟或轻微聚集等次级过程变得更加显著。

结合UV–Vis和FTIR分析，确定45分钟是产生单分散且结构稳定的Ca(OH)?纳米颗粒的最佳反应时间。在这个时间点，成核-生长平衡达到稳定状态，形成了结晶度高、表面羟基化均匀且有机覆盖稳定的纳米颗粒。超过这个时间点的延长反应时间并没有带来实质性的优势，反而可能导致轻微的聚集或表面重构。因此，45分钟被确定为获得高质量、稳定性好且均匀的Ca(OH)?纳米颗粒的理想合成时间。

FESEM–EDX成像揭示了在固定合成条件（pH 12、5%蜂蜜、0.05 M CaCl?·2H?O、80°C）下Ca(OH)?颗粒形态和大小分布的时间依赖性演变。代表性的显微图和颗粒直方图分别对应30分钟（图8a）、45分钟（图8b）和60分钟（图8c）的反应时间，显示出在早期反应时间主要为大型不规则聚集体，在最长时间点转变为更小、更均匀的初级纳米颗粒的明显趋势。

在30分钟时（图8a），产物主要由大型、高度纹理化的聚集体组成，平均粒径约为89.95纳米（R2 = 0.93973）。形态呈现为融合的板状/不规则的簇状，与成核正在进行但生长和碰撞驱动的聚集速度快于有效表面钝化的系统一致。该样本的EDX光谱显示强烈的Ca和O信号，以及少量的C，证实了无机Ca(OH)?成分和有机（蜂蜜来源）的表面残留物。30分钟时较大的表观粒径和不规则的形态表明表面覆盖不完全，离散核的数量相对较少。到45分钟时（图8b），显微图显示了由更小的初级单元组成的更明确、类似花朵的/聚集结构；平均粒径减小到约65.30纳米（R2 = 0.94523）。这种形态表明成核和生长更为平衡：蜂蜜生物分子有更多时间协调Ca2?并吸附在新兴的核上，限制了不受控制的聚集并产生了更紧凑、反复成核的结构。EDX图仍然以Ca/O为主，但元素分布图的改善（图S4）表明相对于30分钟时表面钝化更为均匀。到60分钟时（图8c），颗粒群体明显变为细小、高度分散的初级颗粒，平均粒径约为23.37纳米（R2 = 0.96522）。FESEM图像显示的是密集的小球状或片状簇，而不是30分钟时看到的大型融合板。EDX成分与Ca(OH)?一致；仍能检测到来自蜂蜜的碳，表明生物分子覆盖在更长时间内持续存在。60分钟时较小的初级粒径表明，较长的反应时间有利于生成（或稳定）更多的核和/或将较大结构进一步分解为更小的初级单元。

形态评估系列反映了蜂蜜介导的Ca(OH)?形成的三种不同的动力学状态。最初（≤30分钟），成核开始但覆盖不足，因此生长和颗粒间的碰撞产生了大型不规则聚集体。在中间阶段（约45分钟），系统达到了成核和覆盖之间的有利平衡：蜂蜜衍生的配体协调Ca2?，减缓了氢氧化物的瞬时沉淀，并吸附在新兴表面上以限制不受控制的生长——因此形成了更紧凑、大小适中的结构。在延长时间（60分钟）时，两种非互斥的现象可能解释了观察到的向许多小初级颗粒的转变：（i）来自短暂Ca–蜂蜜复合物的Ca2?持续缓慢释放，增加了核的总数（增加了核的数量密度，从而减小了平均初级粒径）；（ii）热暴露加上动态配体重组有利于将较大结构重塑为更小、更精确钝化的初级单元。FTIR数据（前面部分）显示，在60分钟时带形/强度的轻微变化支持了在长时间加热过程中有机覆盖层的部分表面重组。

重要的是要协调光学（UV–Vis/FTIR）和形态观察结果。UV–Vis吸收在45分钟时达到最大强度（强且定义明确的带），而FESEM在60分钟时显示了最小的初级颗粒。这种明显的差异可以合理化：UV–Vis信号强度不仅对初级颗粒大小敏感，还对分散的、光学活性颗粒的有效浓度及其表面化学性质敏感。在45分钟时，颗粒看起来数量众多，在胶体尺度上分布均匀，并且具有最大化光学吸收的有机-无机界面。到60分钟时，尽管初级颗粒直径减小，但由于表面化学性质（部分重组或覆盖分子的丢失/凝结）和胶体尺度上的任何初始重新聚集，表面化学性质的微妙变化可能会放宽光学特征，从而降低UV信号的清晰度/强度。简而言之：45分钟的时间可以获得最佳的胶体光学响应和结晶度的组合；60分钟虽然会产生最小的初级构建单元，但其表面/钝化特性会发生改变，从而影响光学行为。在名义上相似的合成条件下观察到的形态和光学吸收的明显差异可以归因于绿色合成体系中成核和生长过程的动态性质。在蜂蜜介导的合成过程中，局部微环境的微小变化，如离子浓度、粘度和生物分子相互作用的瞬时波动，可能会影响成核动力学和粒子生长路径[36]。因此，尽管在总体可重复性上没有问题，但仍可能出现形态和光学特性上的细微差异。重要的是，粒子尺寸减小和分散性改善的整体趋势在重复实验中保持一致，这证实了该合成方法的可靠性。

3.6. 使用寡壳聚糖对Ca(OH)?纳米颗粒进行表面修饰
寡壳聚糖涂层显著改变了优化后的Ca(OH)?纳米颗粒的表面化学性质和明显的晶体学特征，这与形成了连续的有机壳层以及强大的有机-无机界面相互作用相符[37]。紫外-可见光谱（图9a）显示，之前与分散的Ca(OH)?相关的吸收峰（368 nm）在涂层后被有效抑制；涂覆材料的光谱与寡壳聚糖本身的光谱非常相似。Ca(OH)?吸收峰的消失最好解释为由于在无机核心周围形成了均匀的聚合物基质而产生的光学掩蔽效应：当Ca(OH)?初级颗粒被封装并良好分散在较高吸收率的聚合物薄膜中时，它们的个别电子跃迁要么被减弱，要么移出了可观测的范围，整个胶体的光学行为类似于富含聚合物的相。实际上，紫外-可见数据表明，无机成分不再以大的、具有光学活性的聚集体的形式存在，而是嵌入并均匀分布在寡壳聚糖基质中，主导了整个系统的光学响应。

FTIR分析（图9b）直接提供了界面结合性质的分子级证据。涂覆样品保持了 characteristic的Ca–O和O–H振动带，同时额外显示了与寡壳聚糖相关的明显信号，特别是大约1600 cm?1处的宽N–H/O–H弯曲振动和大约1450 cm?1处的C–O伸缩振动，证实了表面修饰的成功。涂层通过非共价和配位相互作用实现：(i) Ca(OH)?表面上丰富的羟基与寡壳聚糖的羟基和乙酰胺/氨基之间的氢键；(ii) 寡壳聚糖中的质子化胺基（–NH??）与颗粒表面带负电的氧位点或吸附的阴离子物种之间的静电吸引；以及 (iii) 携带孤对电子的氮原子与表面Ca2?中心的部分配位（路易斯酸-碱相互作用）。FTIR光谱的偏移（O–H和C–O/N–H区域的轻微带位变化和强度变化）支持这些相互作用的存在，而不是简单的物理吸附：这些扰动表明了表面的紧密复合以及改变了无机和有机部分的局部振动环境。此外，与杨树蜂蜜的参考光谱比较证实，纳米复合材料中观察到的特征性有机带主要来自表面结合的生物分子，而不是自由残留物，因为纯化步骤有效地去除了未结合的成分。这表明形成了稳定的有机-无机界面，而不仅仅是简单的物理混合。

XRD（图9c）显示，涂层后Ca(OH)?的尖锐衍射峰几乎完全消失，取而代之的是典型的非晶态或聚合物嵌入系统的宽低强度基线。这种消失并不意味着结晶Ca(OH)?在化学上转化为了另一种无机相；相反，它表明结晶域现在要么 (i) 在空间上被隔离并嵌入在一个厚实的有机基质中，该基质强烈散射和减弱了衍射信号[38]，要么 (ii) 遭受了表面无序和尺寸诱导的峰宽化，以至于衍射强度低于仪器噪声。这一现象表明XRD结果与由寡壳聚糖基质紧密接触引起的均匀封装和部分表面非晶化一致。

FESEM成像（图9d）直观地证实了封装层的形成：原本观察到的1-D壳/棒状或板状结构的颗粒现在被连续的涂层所包裹，白色/明亮的对比区域（背散射/电荷对比）指示无机核心簇嵌入在较暗的聚合物相中。重要的是，涂层引起了显著的形态演变，主导形态变成了伪立方颗粒，而不是原来的1-D鞘状形式。有几种非互斥的机制可以解释这种形状变化。首先，寡壳聚糖的吸附可以选择性地稳定特定的晶体面：优先结合高能面会抑制某些方向上的生长，并促进其他方向的相对生长，从而将平衡形态向更加多面的立方体型转变[39]。其次，涂层步骤（混合、温和搅拌、pH调整以及可能的部分溶解/再沉淀）可以在聚合物模板下触发钙氢氧化物核心的有限表面重构或再结晶（聚合物引导的矿化），产生更各向同性的多面岛屿，这些岛屿看起来是立方形的[40]。第三，封装可以驱动明显的“形态平滑”：当超薄片状或壳状颗粒被紧密包裹在聚合物基质中然后进行SEM观察时，聚合物可能会诱导毛细力和收缩作用，使片状颗粒凝聚成更紧凑的立方体聚集体[41]。这些现象都与观察到的FESEM显微图像以及伴随的光谱变化相一致。

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图9. Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖的特性：(a) 紫外-可见光谱，(b) FTIR光谱，(c) XRD图案，(d) 15,000×放大下的FESEM图像，以及(e) EDX光谱和元素映射。
EDX元素映射和光谱（图9e）证实了混合体的成功形成：涂覆材料显示出强烈的Ca和O峰（证实了核心的存在），同时还显示出来自寡壳聚糖骨架的C和N信号。共定位图（图S5）证明了Ca和有机标记物（C, N）之间的均匀空间重叠，证实了富钙区域在有机基质中均匀分布，而不是作为暴露的、未涂层的晶体存在。残留的Na和Cl痕迹反映了前体和pH调整的残留物，但相对于Ca和C，它们的强度较低，表明它们是次要的。表面处C/N比的相对增加，以及在表面敏感技术中Ca峰锐度的降低，支持了连续寡壳聚糖层的存在，该层有效地钝化了无机核心。

Ca(OH)?纳米颗粒–寡壳聚糖的TGA曲线（图10）显示了连续且单调的重量损失，带有平滑的过渡区域，这是混合有机-无机纳米材料的特征。没有突然或不规则的波动，证实了测量的稳定性和可靠性。初始的轻微重量损失在约150°C以下，对应于物理吸附和弱结合的水分子的去除。在约200–350°C之间观察到的更明显且连续的质量损失归因于有机组分的热分解，包括寡壳聚糖和蜂蜜衍生的生物分子。这种过渡的渐进性质表明表面结合的物种具有异质性的结合环境和不同的热稳定性。

在更高的温度（约400–600°C）下，观察到较慢的重量损失，对应于残留有机碎片的进一步降解和可能的结构重组。超过这个区域后，曲线趋于平稳，表明存在与钙基相相关的热稳定无机残留物。整体重量损失曲线证实了有机组分成功结合到纳米颗粒表面。重要的是，这种平滑的多步骤降解行为表明这些组分不仅仅是物理混合的，而是与纳米颗粒表面牢固结合，形成了稳定的有机-无机界面。这些发现与FTIR分析结果一致，并进一步支持了表面结合的寡壳聚糖和蜂蜜衍生生物分子的存在，而不是自由残留物。

在寡壳聚糖涂层的样品中，SAED图案仍然显示出了明显的衍射斑点/环，尽管强度略有降低，背景扩散增加。这种变化归因于围绕纳米颗粒的非晶态寡壳聚糖层，它部分减弱了电子衍射信号。重要的是，相同衍射特征的持续存在表明Ca(OH)?的晶体结构在表面修饰后得到了保持。这些结果表明，寡壳聚糖涂层并未改变Ca(OH)?纳米颗粒的内在晶体结构，而是在结晶无机核心周围形成了非晶态有机壳层。这一发现与优化样品的XRD结果一致，并支持了纳米复合系统的结构完整性。

PSA–DLS结果（表2）揭示了寡壳聚糖涂层后Ca(OH)?纳米颗粒的胶体性质的显著改变。平均水动力直径从原始Ca(OH)?纳米颗粒的72.3 ± 7.8 nm大幅增加到207.1 ± 45.6 nm，表明形成了明显更厚的聚合物层和/或聚合物桥接的纳米颗粒组装体。这种明显的尺寸增大表明寡壳聚糖不仅吸附在纳米颗粒表面，还可能通过链缠结或桥接作用在颗粒间诱导部分关联，特别是在寡壳聚糖链高度溶剂化的水环境中。较大的标准偏差进一步支持了涂层厚度的不均匀性和瞬态纳米颗粒簇的存在，而不是简单的单层覆盖。

表2. Ca(OH)?纳米颗粒和Ca(OH)?纳米颗粒-寡壳聚糖（n=5）的动态光散射（DLS）参数。
| 参数 | Ca(OH)?纳米颗粒 | Ca(OH)?纳米颗粒-寡壳聚糖 |
|--------------|------------------|---------------------|
| 平均水动力直径（nm） | 72.3 ± 7.8 | 207.1 ± 45.6 |
| 多分散指数（PDI） | 0.528 ± 0.079 | 0.472 ± 0.131 |
| Zeta电位（mV） | +0.73 ± 0.40 | ?9.32 ± 1.26 |
| 电泳迁移率（cm2·V?1·s?1） | 5.67×10?? ± 3.13×10?? | ?7.28×10?? ± ?6.36×10?? |
| 应加电场（V·cm?1） | ?16.19 ± 0.00 | ?16.18 ± 0.17 |
| 电导率（mS·cm?1） | 0.2827 ± 0.00 | 0.5227 ± 0.9678 |

尽管水动力直径显著增加，但多分散指数（PDI）从0.528 ± 0.079降至0.472 ± 0.131，表明尺寸分布的均匀性有所改善。这一趋势表明，尽管涂层后的颗粒更大，但寡壳聚糖层通过抑制随机聚集促进了更受调控的胶体组织。扩展的寡壳聚糖链提供的空间障碍可能限制了不受控制的颗粒-颗粒接触，从而在群体层面实现了更均匀的分散状态。

在寡壳聚糖涂层后，表面电荷发生了显著的反转，表现为zeta电位的从裸露Ca(OH)?纳米颗粒的略微正值（+0.73 ± 0.40 mV）变为明显负值（?9.32 ± 1.26 mV）。这种电荷反转表明纳米颗粒-溶液界面的显著重构，并证实了表面修饰的成功。负zeta电位可能源于去质子化官能团的优先暴露、反离子吸附或寡壳聚糖层内的电荷补偿效应，导致表面电位呈现净负值。尽管绝对值低于强静电稳定的经典阈值，但表面电荷的改变和空间障碍的结合表明了电静力学稳定机制的主导作用。

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图11. Ca(OH)?纳米颗粒在寡壳聚糖涂层前（a）和涂层后（b）的TEM-SAED分析。
电泳迁移率数据证实了zeta电位的发现，显示未涂层Ca(OH)?纳米颗粒的低正迁移率（5.67×10?? ± 3.13×10?? cm2·V?1）转变为涂层后显著更高的负迁移率（?7.28×10?? ± 6.36×10?? cm2·V?1）。这种迁移率幅度的显著增加表明颗粒对施加电场的响应性增强，并证实了由修饰后的表面化学性质所控制的新电动力学机制的建立。两种系统应用的电场值（约?16.18 V·cm?1）相同，确保了观察到的差异是表面修饰本身的特征，而非实验误差。

分散体的电导率在寡壳聚糖涂层后从0.2827 ± 0.0005增加到2.827 ± 0.9678 mS·cm?1。这一数量级的增加表明分散介质中移动离子物种的浓度较高，可能来源于寡壳聚糖的质子化胺基及其相关反离子。电导率的提高可能增强了离子屏蔽作用，减少了纯静电排斥；然而，在当前系统中，扩展的寡壳聚糖链提供的空间稳定作用似乎占主导地位，使得分散体保持稳定。

综合使用紫外-可见光谱、FTIR、XRD、FESEM–EDX和PSA–DLS的分析提供了一个连贯的图像：寡壳聚糖包裹Ca(OH)?纳米颗粒，形成了一个有机-无机纳米复合材料，其中无机晶体细密分散并与聚合物形成强界面。涂层通过氢键、静电吸引和配位相互作用（胺→Ca2?）进行，产生了光学掩蔽、长程X射线衍射的抑制、形态向多面/立方体结构的转变以及元素的均匀分布。这种界面工程同时改善了胶体稳定性（空间+静电）并创建了有利于增强生物相互作用和下游功能化的功能性表面化学。针对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的抗菌活性及最低抑菌浓度（MIC）

所制备材料的抗菌功效通过肉汤微量稀释法（broth microdilation MIC assays）对典型的革兰氏阳性（S. aureus）和革兰氏阴性（P. aeruginosa）病原体进行量化（图12a，表3）。共比较了四种测试样本：杨树蜂蜜（对照组）、Ca(OH)?纳米颗粒（Ca(OH)? NPs）、寡糖壳聚糖（oligochitosan）以及涂覆了寡糖壳聚糖的Ca(OH)?纳米颗粒（Ca(OH)? NPs - Oligochitosan）。剂量-反应曲线和得出的MIC值显示出明显的、可重复的抗菌活性等级：蜂蜜 > Ca(OH)? NPs > 寡糖壳聚糖 > Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖，其中涂覆纳米复合材料的两种微生物的MIC均最低（S. aureus的MIC = 70 ± 1.12 ppm；P. aeruginosa的MIC = 55 ± 0.87 ppm）。作为对比，单独成分的MIC值显著更高（S. aureus：蜂蜜521 ± 1.17 ppm，Ca(OH)? NPs 310 ± 1.21 ppm，寡糖壳聚糖180 ± 1.23 ppm；P. aeruginosa：蜂蜜420 ± 0.97 ppm，Ca(OH)? NPs 300 ± 1.37 ppm，寡糖壳聚糖170 ± 1.19 ppm）。这些结果表明，当Ca(OH)? NPs表面修饰为寡糖壳聚糖并在其合成的有机基质中分散时，抗菌活性得到了显著增强。

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图12. 纯杨树蜂蜜、Ca(OH)? NPs、寡糖壳聚糖以及Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖纳米复合材料对S. aureus（a）和P. aeruginosa（b）的体外抗菌活性。

表3. 纯杨树蜂蜜、Ca(OH)? NPs、寡糖壳聚糖以及Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖纳米复合材料对金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性）和铜绿假单胞菌（革兰氏阴性）的最低抑菌浓度（ppm，n=3）。

样品 最低抑菌浓度（ppm）
S. aureus P. aeruginosa
阳性对照 205 ± 1.11b 195 ± 1.11b
杨树蜂蜜 521 ± 1.17d 420 ± 0.97d
Ca(OH)? NPs 310 ± 1.21c 300 ± 1.37c
寡糖壳聚糖 180 ± 1.23b 170 ± 1.19b
Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖 70 ± 1.12a 55 ± 0.87a

注：不同“字母”的标注表示有显著差异（p<0.05）。

与阳性对照相比，环丙沙星（ciprofloxacin）对S. aureus的MIC值为205 ± 1.11 ppm，对P. aeruginosa的MIC值为195 ± 1.11 ppm。值得注意的是，在测试条件下，Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖纳米复合材料的MIC值显著低于环丙沙星，表明其抗菌效能更高。这种改进可归因于Ca(OH)? NPs与寡糖壳聚糖之间的协同作用：Ca(OH)?的高碱性破坏细菌细胞壁，而寡糖壳聚糖的阳离子性质增强了膜相互作用和通透性。

几个机制因素解释了观察到的效益及涂覆纳米复合材料的优越性能。首先，Ca(OH)?的固有抗菌活性主要归因于其释放的羟基离子，在颗粒-细胞界面产生强碱性微环境（pH ≈ 12）[42]。这种局部pH升高可以导致膜蛋白变性、破坏质子梯度、使脂质双层不稳定，并损害关键酶活性，最终引发细菌死亡[43]。在纳米尺度上，Ca(OH)?由于表面积显著增加，进一步放大了这些效应，从而促进更多羟基离子的释放，并为与细菌细胞相互作用提供更多活性位点。因此，与块状材料相比，较小的颗粒能更强烈地局部碱化并更紧密地接触微生物表面，从而提高抗菌效果[44]。

其次，寡糖壳聚糖涂层提供了互补且正交的抗菌模式。在微酸性至中性条件下，寡糖壳聚糖呈多阳离子状态（一级胺部分质子化），因此通过与细菌包膜的负电荷成分（革兰氏阳性菌的肽聚糖和革兰氏阴性菌的外膜脂多糖）发生静电相互作用。这种多阳离子-阴离子相互作用增加了膜通透性，导致细胞质内容物泄漏，并有助于纳米颗粒在细胞表面附着和保留[45,46]。此外，壳聚糖及其低聚物能在细胞表面螯合必需金属离子并干扰膜结合酶，进一步抑制细菌存活[46,47]。将寡糖壳聚糖共价/配位和氢键结合到Ca(OH)?上的作用（见第3.6节）也形成了稳定的正电荷晕，促进了纳米颗粒与细菌的紧密接触，使碱性核心有效接近膜[48,49]。

第三，涂覆系统受益于无机核心与聚合物壳之间的协同作用。寡糖壳聚糖提高了胶体稳定性，防止Ca(OH)?快速聚集，保持了在生物介质中的高有效表面积。它还充当分子穿梭载体，增强了与细菌表面的附着，并可能在界面处缓慢、局部释放Ca2?和氢氧根离子，无需高剂量即可持续产生对微生物不利的微环境[50]。合成过程中掺入的残留蜂蜜生物分子（多酚、过氧化物、糖类）可能提供了额外的抗菌作用（渗透/氧化应激和酚类诱导的膜扰动），解释了复合材料的优异表现[51,52]。

这里观察到的S. aureus与P. aeruginosa之间的差异值得讨论。革兰氏阴性菌通常被认为对许多抗菌剂具有更强的抗性，因为其外膜起到了额外的通透屏障作用。然而，在本研究中，Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖对P. aeruginosa的MIC（55 ppm）略低于对S. aureus的MIC（70 ppm）。有两个合理的解释：(i) 多阳离子寡糖壳聚糖晕与P. aeruginosa的阴离子脂多糖（LPS）层特别有效结合，导致外膜严重不稳定，从而便于氢氧根和Ca2?渗透到周质和内膜目标[53]；(ii) P. aeruginosa自身中和碱性应激的机制（如质子泵、周质缓冲）可能对复合材料的联合化学（高局部pH）和物理（壳聚糖引起的膜扰动）作用不如单独使用这些因素[54,55]。MIC的差异较小，生物体的具体反应取决于菌株、生长阶段和测定条件；尽管如此，数据表明该复合材料对两种革兰氏菌均具有广泛效力。

MIC趋势与上述物理化学特性一致：较小、分散良好的颗粒，带有强寡糖壳聚糖晕（在pH 12、5%蜂蜜、0.05 M CaCl?、45分钟条件下优化）通过结合持续的界面碱性和增强的膜附着及生物活性聚合物效应，最大化了生物活性。与蜂蜜相比，复合材料的MIC降低了7.5倍；与裸露的Ca(OH)? NPs相比，抗菌效果提高了约4.5倍，表明表面工程是一种高效的策略，既能提高抗菌效力，又能潜在地降低所需剂量并限制系统碱度。

MIC实验表明，涂覆寡糖壳聚糖的Ca(OH)? NPs是高效的广谱抗菌剂，其效力显著高于其组成成分。纳米级碱度、聚合物介导的膜靶向作用以及残留蜂蜜生物活性之间的相互作用提供了多种作用机制，减少了单一靶点抗性的可能性，促进了这些复合材料在局部和环保抗菌应用中的进一步开发。

3.8. 计算机模拟分子相互作用分析

为了表征Ca(OH)?和Ca(OH)?–寡糖壳聚糖纳米复合材料的抗菌作用，进行了分子对接研究，使用了典型的革兰氏阳性（S. aureus，PDB: 1MWT）和革兰氏阴性（P. aeruginosa，PDB: 6UN1）细菌靶蛋白（图13，表4）。对接结果显示，测试配体（天然配体、未修饰的Ca(OH)? NPs和Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖）之间的结合活性和相互作用模式存在明显差异，说明了寡糖壳聚糖修饰对增强分子识别和稳定性的重要作用。

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图13. Ca(OH)? NPs与S. aureus（a）和P. aeruginosa（b）形成的二维（左）及三维（右）相互作用剖面，以及Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖与S. aureus（c）和P. aeruginosa（d）形成的相互作用剖面。

表4. 天然配体、Ca(OH)?纳米颗粒（NPs）和Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖与典型革兰氏阳性（S. aureus，PDB: 1MWT）和革兰氏阴性（P. aeruginosa，PDB: 6UN1）蛋白的结合亲和力和相对相互作用百分比。

配体 结合亲和力 相对相互作用百分比
S. aureus(1MWT) 85.67 -91.11 100
Ni(OH)? NPs -46.44 -45.26 54.20 49.67
Ni(OH)? NPs–寡糖壳聚糖 -89.62 -96.26 104.61 105.65

对于S. aureus（1MWT），未修饰的Ca(OH)? NPs的结合亲和力为-46.44 kcal/mol，仅与Glu284(A)、Leu253(A)和Leu283(A)等残基形成少数关键氢键。这些相互作用主要涉及静电吸引和弱范德华力，局限于酶结合口袋表面，表明无机纳米颗粒表面与细菌蛋白的亲水区域之间的互补性有限[56]。相比之下，Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖复合材料的结合亲和力显著增强（-89.62 kcal/mol），相对相互作用百分比也更高（104.61%）。这种增强归因于与更多残基（Ala163(A)、Leu283(A)、Gly254(A)和Arg241(A)的多个氢键和疏水相互作用，表明寡糖壳聚糖层引入了参与广泛氢键和静电接触的功能基团（–NH?，–OH）。这种密集的相互作用网络稳定了复合材料在结合位点中的结构，从而提高了对S. aureus酶目标的抑制潜力。

对于P. aeruginosa（6UN1）也观察到了类似模式。裸露的Ca(OH)?的结合亲和力为-45.26 kcal/mol，主要与Asn283(A)、Met262(A)和Ala285(A)相互作用，表明结合较弱且对蛋白质疏水核心的附着有限。但寡糖壳聚糖修饰显著提高了结合亲和力至-96.26 kcal/mol，明显优于天然配体（-91.11 kcal/mol）。Ca(OH)?–寡糖壳聚糖纳米复合材料与Met262(A)、Ile323(A)和Arg287(A)等残基形成氢键和疏水接触，形成了更稳定且能量上有利的复合体。寡糖壳聚糖在质子化氨基上的正电荷分布可能增强了与带负电荷氨基酸残基（特别是在细菌表面活性位点丰富的天冬氨酸和谷氨酸）的强静电吸引[45,46]。

在两种细菌模型中观察到的更高对接亲和力和相互作用进一步证实了MIC结果，并证明了这种产品表面修饰的有效性，无论是在物理化学还是生物活性方面。寡糖壳聚糖壳不仅提高了纳米颗粒的分散性和电荷稳定性，还创造了潜在的生物功能基团，这些基团可与细菌膜相关蛋白发生特异性相互作用。这促进了更强的附着、膜破坏和酶抑制[50]，解释了其在体外抗菌活性上的增强效果。

计算机模拟分析强调了双重作用机制：(i) 寡糖壳聚糖涂层纳米颗粒通过静电和氢键作用固定在细菌蛋白表面；(ii) 在界面处Ca2?和OH?的局部释放产生的离子扰动，协同增强了抗菌效果。对接结果与MIC数据的强相关性表明，Ca(OH)?纳米颗粒与寡糖壳聚糖的合理表面工程是一种有效方法，可用于开发具有良好广谱活性的下一代抗菌纳米复合材料。

3.9. 使用卤虫致死试验（BSLT）进行毒性评估

卤虫致死试验（BSLT）用于评估涂覆前后的Ca(OH)?纳米颗粒的毒性。未涂覆Ca(OH)? NPs（图14a）和涂覆寡糖壳聚糖的Ca(OH)? NPs（图14b）的LC??值分别为129.68 ppm和908.92 ppm。根据Meyer毒性等级，LC??值小于100 ppm的化合物被认为是高毒性的，而LC??值超过500 ppm的化合物则基本上无毒。因此，结果清楚地表明，寡糖壳聚糖的表面修饰将Ca(OH)?纳米颗粒的固有毒性从中等毒性降低到适合生物医学使用的生物相容性范围。

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图14. 卤虫致死试验（BSLT）评估Ca(OH)? NPs（a）和Ca(OH)? NPs–寡糖壳聚糖纳米复合材料（b）的细胞毒性。

多种物理化学和生物学因素导致涂覆寡糖壳聚糖后毒性降低。首先，寡糖壳聚糖层作为生物聚合物屏障，减少了Ca(OH)?核心对周围介质的直接影响。这种涂层控制了Ca2?和OH?离子的释放速率，并主要通过膜降解和氧化应激诱导作用于纳米颗粒的细胞毒性行为。通过控制离子扩散，寡糖壳聚糖壳维持了更中性的局部微环境，从而减少了Artemia salina幼虫所经历的离子冲击和渗透不平衡。其次，寡糖壳聚糖的静电稳定性和空间阻碍防止了纳米颗粒聚集和在细胞膜上的不可控吸附。寡糖壳聚糖的正电荷表面促进了与带负电荷生物膜的温和、可逆相互作用，而非不可逆的穿透，减少了膜裂解并提高了兼容性[57]。此外，寡糖壳聚糖的生物相容性和生物降解性通过充当缓冲界面吸收过量的羟基离子并将纳米颗粒均匀分散在水介质中，进一步促进了解毒作用。第三，表面修饰可能改变了纳米颗粒-生物分子的相互作用动力学。未涂覆的Ca(OH)? NPs由于其高表面反应性和碱性，可以非特异性结合并变性蛋白质或核酸，导致系统性细胞损伤。经过寡糖壳聚糖修饰后，表面覆盖了丰富的羟基和氨基，这些基团可以形成氢键而非反应性离子相互作用，从而提高了与有机大分子的兼容性[58]。这种界面化学性质的改变有效减弱了纳米粒子引起的应激途径，并限制了在生物体水平上的细胞毒性效应。BSLT 报告称，这种寡壳聚糖涂层的应用将 Ca(OH)? 纳米粒子从具有轻微毒性的物质转变为一种可持续使用的纳米复合材料，其在环境和生物学方面的风险显著降低。毒性的降低以及抗菌活性的显著增强进一步证明了寡壳聚糖作为多功能稳定剂和生物相容性表面改性的潜力。这些结果进一步凸显了 Ca(OH)?–寡壳聚糖纳米复合材料在生物医学和环境应用中的适用性，在这些应用中，效果和安全至关重要。

4. 结论
本研究证明，通过杨树蜂蜜介导的绿色合成方法随后进行寡壳聚糖涂层处理，是一种制造稳定且具有生物活性的 Ca(OH)? 纳米粒子的有效途径。与未涂层版的 Ca(OH)? 相比，Ca(OH)?–寡壳聚糖纳米复合材料的表面功能性和胶体稳定性更优，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抗菌活性显著增强。分子对接实验证实了其与细菌细胞壁和膜相关蛋白质之间的良好相互作用，验证了实验结果；而卤虫致死性测试显示，经过寡壳聚糖功能化处理后的材料生物相容性得到了改善。这种环保型的纳米平台为开发安全有效的抗菌化合物提供了可行的选择，以应对日益严重的抗菌素耐药性问题。

7. 关于写作过程中使用生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明
在准备本文的过程中，作者使用了 ChatGPT 来提高英文文本的可读性。

8. 作者贡献
Saidun Fiddaroini：参与了研究、数据分析、数据解释、可视化处理、软件应用以及初稿撰写和修订编辑工作。
Ardini Nurul Janah：参与了研究、数据可视化处理、数据解释、数据整理及验证工作。
Budi Mulyati：参与了数据分析、可视化处理、数据验证以及软件应用。
Ahmad Luthfi Fahmi：参与了数据分析、可视化处理、初稿撰写以及修订编辑工作。
Yosep Yuswanto Tri Ananda：参与了数据分析、可视化处理、软件应用以及初稿和修订编辑工作。
Andini：参与了数据分析、可视化处理、数据验证、软件应用以及初稿和修订编辑工作。
Nike Fitayatul Khusnah：参与了数据分析、可视化处理。
Moh. Farid Rahman：负责实验构思与设计、方法论制定以及整个研究过程的监督。
Akhmad Sabarudin：负责实验构思与设计、资源获取、数据分析与解释、资金筹措以及初稿撰写和修订编辑工作。

9. 数据声明
本文包含的所有数据均见正文内容。

CRediT 作者贡献声明
Saidun Fiddaroini：负责修订编辑、初稿撰写、数据可视化处理、数据分析及数据整理。
Ardini Nurul Janah：负责数据可视化处理、验证、研究及数据整理。
Budi Mulyati：负责数据可视化处理、验证、软件应用及数据分析。
Ahmad Luthfi Fahmi：负责修订编辑、初稿撰写、数据可视化处理及数据分析。
Yosep Yuswanto Tri Ananda：负责修订编辑、初稿撰写、数据可视化处理、验证及数据分析。
Andini：负责修订编辑、初稿撰写、数据可视化处理、验证及数据分析。
Nike Fitayatul Khusnah：负责数据可视化处理及数据分析。
Moh. Farid Rahman：负责实验设计、方法论制定及整体研究监督。
Akhmad Sabarudin：负责实验设计、资源整合、数据分析与解释、资金筹措、初稿撰写以及修订编辑工作。