开发并验证了一种改进型的高效资源利用型高效液相色谱（HPLC）- 蒸发光散射检测器（ELSD）方法，用于测定药物制剂中的菊粉含量

《Results in Chemistry》：Development and validation of an enhanced resource efficient high performance liquid chromatography (HPLC)- evaporative light scattering detector (ELSD) method for determination of inulin in pharmaceutical formulations

　　帕里克希特·达斯（Parikshit Das）|丹斯瓦朗·戈亚里（Danswrang Goyary）|穆罕默德·卡马鲁兹·扎曼（Md. Kamaruz Zaman）|普罗诺贝什·查托帕德亚伊（Pronobesh Chattopadhyay）|皮亚·阿迪卡里（Piya Adhikari）|苏布拉马尼扬姆·波洛帕利（Subramanyam Polopalli）|莫希特·库马尔（Mohit Kumar）|赛杜尔·拉赫曼（Saidur Rahaman）|扬臣·多玛·布蒂亚（Yangchen Doma Bhutia）|桑杰夫·卡玛卡尔（Sanjeev Karmakar）

印度阿萨姆邦特兹普尔（Tezpur）国防研究实验室（Defense Research Laboratory, DRDO）制药技术部门，邮编784001

**摘要**
根据ICH Q2（R2）指南，开发并验证了一种简单、快速且可靠的高效液相色谱（HPLC）方法，该方法结合了蒸发光散射检测器（ELSD），用于从药物制剂中检测菊粉。现有方法不仅耗时较长，而且需要在检测前将化合物水解为单糖。本文提出的方法无需进行复杂的样品制备，实现了即时检测。色谱分离使用C18反相柱（4.6 × 100 mm，3.5 μm），以水/甲醇（80:20）作为流动相进行。菊粉在大约2.4–2.6分钟的保留时间下被洗脱，无需预处理。该方法在10–80 μg/mL的浓度范围内表现出良好的线性，相关系数（R2）为0.998。检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为10.41 μg/mL和31.57 μg/mL。通过多种指标进一步验证了该方法的有效性和环保性，结果表明该方法具有资源高效和可持续的特点。该方法已成功应用于纤维素酸酯片剂中菊粉的检测，特别是在体外释放研究后。该技术省去了复杂的样品制备和水解步骤，实现了菊粉的直接检测。总体而言，所开发的HPLC-ELSD方法适用于常规质量控制或药物剂型中菊粉及其衍生物的分析，具有简单、易用、可靠、可持续和成本效益高的优点。

**1. 引言**
菊粉是一种具有宝贵益生元价值的多功能化合物，属于难以消化的碳水化合物（称为“果聚糖”）。它存在于3000多种植物中，包括大丽花、菊苣、耶路撒冷菊等[1]。菊粉呈白色粉末状，味道中性。几代以来，它一直是人们日常饮食的重要组成部分，提供营养益处并具有显著的功能效益[2]。由于β(2–1)糖苷键的存在，菊粉在胃肠道上部不会被酶分解[1]，但在结肠中会被 resident microbiota（主要是乳酸菌和双歧杆菌）发酵[3]。它还有利于消化系统中细菌的增殖，被认为是为糖尿病患者制定低热量饮食的合适成分，有助于调节血糖水平[4]。菊粉具有胶体性质，在高浓度下会形成凝胶状物质，这使得制备均匀溶液变得困难[5]。由于其胶体特性，菊粉会在较高浓度下固化成凝胶，从而影响溶液的均匀性[5]。这种多糖在肠道健康中发挥多方面作用，通过促进肠道有益菌的生长、增加粪便稠度、防止过量进食、改善能量代谢以及提供富含纤维的益生元[6][7]。大多数文献指出菊粉可溶于水，但实际发现它在冷水中溶解度很低，需要较高温度才能完全溶解[8]。此外，随着菊粉分子量的增加，其溶解度会降低[8]。菊粉不溶于大多数有机溶剂（如乙醇、丙酮和异丙醇），这使得菊粉的样品制备变得困难[9]。由于食品工业中对菊粉类果聚糖的需求不断增加，因此需要可靠的技术来定量检测食物制品中的掺假情况。需要注意的是，由于缺乏蛋白质和核酸，菊粉在紫外（UV）范围内没有吸收峰[10][11]。使用传统光谱方法测定菊粉含量时需要先将其水解为果糖和葡萄糖[12][13][14]。然而，在分析过程中将这些碳水化合物聚合物和寡聚物完全转化为单糖非常困难[12][13][14]。色谱法在测定菊粉时容易出现无关化合物和杂质的干扰，导致定量误差，这些误差可能与复杂化合物的形成、延长保留时间、副产物生成、酸水解、交叉反应以及不准确性有关[15][16]。此外，使用高压离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）、高效液相色谱-光散射检测（HPLC-LCD）和高效液相色谱-折射率检测（HPLC-RID）等液相色谱技术进行定量时，也必须先进行酶水解[15][16]。与ELSD检测器产生的稳定且可重复的基线不同，RID检测器容易受到温度波动的影响[15]。HPAEC-PAD需要高碱性的流动相组成和金基电极，这增加了操作复杂性和维护成本。同时，还需要精确控制碳酸盐污染和电极清洁，这些因素限制了其在实验室中的常规应用[15]。因此，我们开发了一种简单、高效且可靠的菊粉测定方法，采用HPLC与蒸发光散射检测器（ELSD），无需水解和提取步骤。这种方法通过简洁的样品制备过程实现快速分析，与其他需要复杂处理和提取步骤的方法相比具有优势。与利用分析物光学特性的其他检测器不同，ELSD根据物质散射光的能力来识别颗粒[17][18]。ELSD特别适用于分析不含发色团和内在荧光的非挥发性物质，如脂质、碳水化合物和聚合物[17][18]。此外，ELSD能够检测低检出限范围内的多种分子量碳水化合物，并且可以在梯度模式下操作[19]。通过反复试验和调整，最终获得最佳方法，实现了更高的分辨率、更短的保留时间和更高的灵敏度[15]。进一步验证了该分析方法的可靠性，因为方法验证是确认该方法适用于预期应用的关键步骤[15]。该方法已用于检测纤维素酸酯片剂体外释放研究中的活性成分。

**2. 材料与方法**
2.1. 材料
菊粉购自美国圣路易斯Sigma Aldrich公司（地址：3050 Spruce Street, St. Louis, USA）。HPLC级甲醇购自印度孟买Pirojshanagar的Merck Life Science Pvt. Ltd.。HPMC、MCC、滑石粉和硬脂酸镁购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma Aldrich公司。HPLC级水购自印度孟买Powai的Thermo Fisher Scientific Pvt. Ltd.。
2.2. 流动相的选择
通过初步筛选，选择甲醇和水组成的流动相系统。水浓度调整在60%至80%之间，流速优化范围为0.5 mL/min至1.2 mL/min。选择流动相比例和流速以确保最小保留时间（RT）、足够的分辨率和小于2.2的不对称性。
2.3. 色谱系统及条件
菊粉分析使用Agilent 1260 Infinity II Prime LC Series高效液相色谱系统（Agilent Technologies，德国Waldbronn，由Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.拥有）进行，该系统配备灵活的G7104C四元泵、带温度控制模块的G7129C进样器、G7116A多柱恒温箱以及连续供应载气氮气的蒸发光散射检测器（1260 Infinity II ELSD G4260B）。分析使用的色谱柱为Eclipse plus C18，规格为4.6 × 100 mm，3.5 μm（Agilent, USA），流动相为水/甲醇（80:20）。柱温设定为80°C，流速为0.5 mL/min，进样量为10 μL。整个分析过程的时间设置为6分钟。检测器参数如下：蒸发温度80°C，雾化器温度80°C，气体流量为1.20标准升/分钟（SLM），光电倍增管（PMT）增益为3.0。表S1（补充材料）列出了菊粉分析的HPLC-ELSD系统参数。
2.4. 标准溶液的制备
通过称取约10 mg标准菊粉并溶于约80°C的热水中（10 mL），制备1000 μg/mL的标准溶液。使用涡旋震荡器（Spinix vortex shaker，Tarsons products limited，印度加尔各答）充分混合后，通过系列稀释制备不同浓度（100, 200, 400, 600, 800 μg/mL）的标准溶液。
2.5. 纤维素酸酯片剂的制备
使用纤维素酸和乙酸酐合成的样品，以及其他辅料（如羟丙基甲基纤维素（HPMC）聚合物、微晶纤维素（MCC）作为粘合剂和润滑剂、滑石粉及硬脂酸镁）制备片剂。将InAc（500 mg）和其他成分分别过60目筛网后混合，再加入研钵中。使用8站片剂压片机（VB Tech Automation，印度古吉拉特邦艾哈迈达巴德）将混合物压制成片剂。
2.6. 纤维素酸酯片剂的体外释放研究
将纤维素酸酯片剂溶解在含有0.1 N HCl的溶解介质（700 mL）中2小时，随后在pH 6.8的磷酸盐缓冲液中再溶解8小时，使用USP装置-I（篮式）在37 ± 0.5°C和75 rpm条件下进行体外释放研究。按规定时间间隔抽取样品并更换新鲜介质，采用所建立的检测方法测定InAc浓度。所有数据均重复三次。收集样品后用流动相稀释，加热并涡旋溶解后转移到自动进样器小瓶中进行分析。
2.7. 分析方法的验证
分析方法的验证按照国际协调会议ICH Q2（R2）指南进行，包括线性、专一性、稳健性、系统适用性、准确性和精度的验证[20]。
2.7.1. 线性
通过绘制多级校准曲线来验证方法的线性，这些曲线涵盖了10至1000 μg/mL范围内的十个不同浓度的溶液峰面积。校准曲线通过最小二乘回归分析建立浓度-响应关系，数据使用Microsoft Office Excel 2007处理。
2.7.2. 精密度
精密度是指从同一样品多次采样得到的结果一致性的程度，通过重复性（日内）和中间精密度（日间）进行评估。使用20、60和100 μg/mL的浓度进行评估，分别对应校准曲线的低、中和高范围。
2.7.2.1. 重复性
在实验研究范围内选择三种不同浓度的菊粉标准品（20、60和100 μg/mL），每种浓度重复三次，结果以平均值、标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD%）表示。
2.7.2.2. 中间精密度
将上述三种标准浓度分别连续三天各注射三次，结果以平均值、标准偏差（SD）和相对标准偏差（RSD%）表示。
2.7.3. 准确性
分析方法的准确性是指分析结果与真实值的匹配程度。与精确度分析相同，使用相同的三种浓度（20、60和100 μg/mL）进行三次注射。准确性通过比较检测浓度与初始添加浓度来评估，结果以RSD%和回收率%表示。
2.7.4. 专一性
进行专一性测试，以评估该方法选择性测量目标物质的能力，并检测制剂中其他成分的可能干扰。在此研究中，同时注入空白片剂、安慰剂片剂及添加的杂质，以检查其他辅料对菊粉光谱的影响。为了评估所开发方法对参数有意修改的依赖性，进行了鲁棒性测试。该测试通过修改两个分析参数（如流速（±2）和流动相组成（±2）来进行，并评估了该方法对这些改变的适应能力。流速分别为0.3 mL/min和0.7 mL/min，而流动相组成分别为78:22（水：甲醇）和82:18（水：甲醇）。比较了重复性和分析因素变化得出的检测结果和峰性能特征。

2.7.6 灵敏度
灵敏度是通过确定检测限（LOD）和定量限（LOQ）来计算的。LOD是指可以检测到的分析物的最低浓度，而LOQ是指能够以足够准确性和精确度测量的最低浓度。LOD是基于校准曲线的标准偏差和斜率使用公式（1）计算得出的。
(1) LOD = 3.3 × σ / S
同样，LOQ是使用公式（2）计算得出的。
(2) LOQ = 10 × σ / S
其中，S是校准曲线的斜率，σ是响应的标准偏差。

2.7.7 系统适用性
通过注射100 μg/mL浓度的大黄素标准溶液六次来评估系统适用性参数。还确定了色谱参数，如拖尾因子、分辨率（R）、保留时间（RT）、峰面积和理论板数（N）。这是为了在方法的优化条件下评估仪器的性能。

2.8 方法应用
所开发的方法用于评估在流动相中提取后含有活性成分和其他辅料的菊粉醋酸酯片的释放曲线。提取后收集的馏分被注入HPLC中，以量化在特定时间后释放的InAc（完整酯）的量。同样的方法也可以用于测定已知即使存在微量水平的大黄素浓度。

2.9 分析方法的绿色评估
使用国家环境方法指数（NEMI）、分析绿色度量标准（AGREE）、绿色分析程序指数（GAPI）和环境、实用性及性能指数[21]等工具对分析方法的绿色度进行了评估。这些方法基于绿色分析化学（GAC）原理评估了废物产生、溶剂毒性、能源使用、样品制备以及对环境的整体影响[21]。NEMI象限图用于测试该方法是否使用持久性、生物累积性和毒性（PBT）物质、腐蚀性试剂、废物产生和危险化学品。如果符合标准，则一个象限会被标记为绿色，否则保持空白。如果过程中使用的化学品不属于PBT物质，则第一个象限可以被标记为绿色。如果分析过程中使用的溶剂不在F、K、P和U危险废物列表中，则第二个象限可以被标记为绿色。如果废水的pH值在安全范围内（即2–12），以避免对环境的腐蚀作用，则第三个象限可以被标记为绿色。如果每次分析产生的废物不超过50克，则第四个象限可以被标记为绿色[22]。GAPI工具提供了对分析过程所有阶段的全面评估，包括样品制备、溶剂选择、仪器参数和废物管理。GAPI考虑了分析方法的各个方面，包括提取、运输、储存以及该方法是否可用于定性和定量[23]。AGREE度量标准由12条绿色分析化学原则组成，用于获得所开发方法的定量绿色度评分（0–1）。接近1的分数表示更好的环境性能。AGREE象限图中每个部分的宽度表示分配给每个原则的权重[24]。环境、实用性和性能指数（EPPI）基于4个关键组成部分评估分析方法的生态可持续性：样品制备（S）、仪器（I）、试剂使用（R）和废物产生（W）。85–100的分数表示理想的环境友好型方法，具有最小的环境影响。85–70的分数表示不需要修改的生态可持续方法，70–55的分数表示需要某些修改的适度环境影响。性能和实用性指数（PPI）评分用于评估该方法在不同实验室环境中的有效性和实用性。该评分涵盖了方法的本质、QbD的实施、验证参数、方法灵敏度、试剂可用性以及每次分析的成本、仪器的可访问性、维护要求、样品重复使用性和通量等关键要素。这些因素共同决定了该方法是否适合常规和大规模应用，表明了其整体效率、成本效益和灵活性。根据总体评分，方法被分为：“优秀实用性”（75–100）、“可接受”（50–74）和“不可行”（<50）。EI和PPI两个指数提供了一个完整的框架，结果以带有颜色代码的相邻两半的饼图形式显示，以反映环境影响和实用性[25]。总体而言，这些测试提供了所开发的HPLC方法的可持续性和环境影响的全面概述。

3. 结果与讨论
3.1 样品溶解过程的优化
在文献搜索过程中，注意到有关在生物样品中鉴定大黄素的证据很多；然而，关于在药物配方或剂型中测量大黄素的研究很少。这是有道理的，因为关于大黄素及其酯类在医药和中草药用途方面的研究并不多。目前正在进行创新研究，旨在利用大黄素作为潜在的治疗选择，针对代谢和健康领域。大黄素在大多数有机溶剂中的溶解度有限，包括甲醇、乙醇和异丙醇[11]。此外，在室温下它也不容易溶于水[26]。随着聚合度（DP）或分子量的增加，大黄素在水中的溶解度会降低[8][27]。因此，获得一种易于溶解大黄素的溶剂颇具挑战性。然而，发现其溶解度随温度的升高而增加。因此，将菊苣中的大黄素粉末在80°C的水中溶解，以获得均匀、均匀的溶液。本研究的主要目标是建立一种简单、快速、易于操作且可靠的HPLC技术，使用C18柱和等度洗脱模式来估计我们开发的药物配方中的大黄素及其酯类衍生物，并进行体外测试。

3.2 参数选择和方法开发
最初使用甲醇和水的50:50组合流动相进行化合物洗脱，以获得满足必要峰参数的最佳峰。首先考虑使用HILIC（亲水性相互作用液相色谱）柱进行分析。但由于洗脱效果不佳，选择了C18柱以改善分离效果。由于出现大量噪声和峰饱和模式，进一步稀释样品以获得清晰且无噪声的最佳峰。尽管多次尝试失败，但仍努力减少运行时间并修改流动相组成，以获得可重复的色谱图，注射体积为10 μl。此外，我们的目标是设计一种无需任何样品预处理的方法。因此，逐步修改流动相比例，最终达到80:20（水：甲醇），从而获得了最佳的化合物检测效果。代表性的色谱图如图2所示。优化后的参数产生了质量良好的色谱图，具有良好的分辨率、最小的拖尾和特定的保留时间。峰的轻微拖尾可能是由于流动相的pH值影响峰形所致。此外，由于大黄素的长链长度（聚合度），它可能与柱子发生一些疏水相互作用，从而导致拖尾。

3.3 方法验证
3.3.1 校准曲线
发现ELSD响应与大黄素浓度呈非线性关系。因此，建立了一个二阶二次校准曲线来定量配方中的大黄素。注射了五种浓度范围从200到1000 μg/mL的大黄素标准溶液，生成了二阶二次校准曲线，R平方值为0.998（图3）。R平方值为0.998表明响应与二阶多项式模型的拟合度良好。

3.3.2 线性
为了评估线性，准备了两组校准曲线。一组浓度范围从100到1000 μg/mL（六种大黄素标准溶液，分别对应100、200、400、600、800和1000 μg/mL），另一组浓度范围从10到80 μg/mL（六种大黄素标准溶液，分别对应10、20、40、60和80 μg/mL）。每种浓度注射三次，测定它们的响应（峰面积）以确定线性范围。在第一组中发现ELSD响应是非线性的，这可能是由于较大的粒径分布和检测器饱和[27][28][29]。因此，可以用多项式方程y = 0.013 × 2 + 18.33 × x + 115.3来表示，其中y表示峰面积，x表示分析物浓度。R2值为0.998。然而，在较低浓度范围内，ELSD响应几乎是线性的。这可以解释为在较低浓度下，分析物不会使ELSD检测器饱和，从而导致最小的聚集[28][29][30]。因此，该方法在10–80 μ/mL范围内具有良好的线性窗口。带有标准方程的校准曲线分别见图S1和图S2（补充材料）。

3.3.3 精确度
分析方法的精确度在两个水平上进行：(i) 重复性和 (ii) 中间精确度。代表性的色谱图见图S3（补充材料）。

3.3.3.1 重复性
使用同一天内的三种不同浓度的大黄素标准溶液进行了三次重复性分析，% RSD值在0.615–3.442%之间，符合标准指南[31]中提到的可接受范围。所得值如下表所示。
表1. 在同一天内三种不同浓度的大黄素的重复性分析。
名义浓度 测量浓度 准确度 回收率（%） 精确度RSD（%）
20 99 0.94 17.4 87.2 0.61
60 175 84 52.8 1.03
100 345 2.0 91.0 3.4

3.3.2 中间精确度
在三天内对三种不同浓度的大黄素标准溶液进行了三次重复性分析，% RSD值在1.086–4.277%之间，符合FDA制定的生物分析方法验证标准[31]。所得值如下表所示。
表2. 在三天内三种不同浓度的大黄素的中间精确度。
名义浓度 测量浓度 准确度 回收率（%） 精确度RSD（%）
20 98 7.6 17.3 86.7 1.08
60 36 6.4 58.5 97.6 2.4
100 340 85 89.5 1.3

3.3.4 准确度
无论是日内还是日间分析，都在20%浓度水平下显示出约（86–87）%的回收率，在60%浓度水平下为（88–97）%，在100%浓度水平下为（89–91）%。所有注射样品（n = 3，每个浓度水平3次）的总体回收率为目标浓度的86%至97%，表明该方法能够从药物配方中检测大黄素。在最低浓度范围（20 μg/mL）下回收率略低，可能归因于ELSD检测器的固有特性，即颗粒尺寸减小导致信号强度下降，从而低估了分析物。然而，随着浓度的增加，回收率有所提高，表明这是系统误差而非随机误差。这种行为与基于ELSD的分析一致，其中观察到非线性响应。数据分别见表1和表2。

3.3.5 特异性
为了进行特异性分析，测试了空白样品、安慰剂样品以及添加了相关杂质的菊粉样品，以检测分析物的保留时间（RT）是否有变化。观察到大黄素的RT（2.44 ± 0.019）不受样品中辅料或其他杂质的影响。在空白样品色谱图（图S4a）中，在大黄素的保留时间没有检测到峰，确认没有系统相关的干扰。含有所有辅料但不含大黄素的安慰剂色谱图（图S4b）显示了多个峰，但没有一个峰与大黄素的RT重合。在最后一个色谱图中，菊粉与其他相关杂质混合后（见图S4 c），观察到一个明显的峰，其保留时间为2.447分钟，该峰清晰可辨且没有信号重叠。这表明菊粉的保留时间在不同样品基质中保持一致，并且不受内源性物质或潜在干扰物质的影响。因此，该方法可用于从药物制剂中特异性和可靠地鉴定菊粉。代表性的色谱图显示在图S4中（补充材料）。

3.3.6 稳定性
稳定性分析显示，流速变化±2 mL/min对菊粉的测定没有显著影响。此外，方法精度也没有因流速变化而显著改变（%RSD分别为0.67和0.76）。然而，当流速分别为0.3 mL/min和0.7 mL/min时，保留时间有所不同，导致洗脱时间分别为4.058 ± 0.00058分钟和1.789 ± 0.034分钟。另外，流动相组成变化±2%也不会影响菊粉的测定，保留时间仍在2.468至2.477分钟范围内，%RSD分别为0.06（22%甲醇浓度）和4.89（18%甲醇浓度）。最后，柱温变化±2°C也没有影响保留时间和峰面积，表明方法具有良好的重复性。下表3显示了所开发方法的稳定性分析结果。稳定性分析的色谱图显示在图S5中（补充材料）。

表3. 色谱方法的稳定性分析

流速变化（0.3 mL/min）
100 4.05 4.05 60 96.00 0.67 1.99 4.05 4.05
流速变化（0.7 mL/min）
100 1.76 1.78 40 77.83 0.76 2.01 1.77 1.82
流动相组成变化（水: 甲醇 - 78:22）
100 2.46 2.46 69 21.74 0.06 2.24 2.42 2.52
流动相组成变化（水: 甲醇 - 82:18）
100 2.47 2.47 57 76.48 4.89 2.46 2.46 2.49
柱温变化（82°C）
100 2.18 62.17 12.24 82.19 28 81.77 3.35 2.76

3.3.7 敏感性
该方法通过LOD（最低检测限）和LOQ（最低定量限）测定进行了敏感性验证。由于用于测定菊粉的方法处于非线性范围内，因此不能使用所得二次方程的SD和斜率来估算LOD和LOQ。因此，在10至80 μg/mL的较低浓度范围内准备了标准曲线，响应几乎是线性的，R2值为0.986（补充材料：图S2）。使用校准曲线，测得LOD和LOQ分别为10.41 μg/mL和31.57 μg/mL [32] [33] [34]。表S4（补充材料）显示了LOD和LOQ的敏感性数据。

3.3.8 系统适用性
通过注射五个浓度为100 μg/mL的样品来评估所开发方法的系统适用性，并计算了其参数，如拖尾因子、分辨率、理论板计数（TPC）和峰面积的%RSD以及保留时间。拖尾因子为2.332 ± 0.223，表明分析过程中峰出现了轻微的拖尾现象。这可能是由于流动相的pH问题或菊粉与柱中残留的硅醇基团的相互作用导致的轻微不对称 [35] [36]。分辨率约为1.9，表明峰之间分离良好。理论板计数（TPC）超过2000，表明柱子效率较高 [20] [37]。色谱方法的系统适用性参数显示在表4中。

表4. 色谱方法的系统适用性

浓度 RT 平均RT 平均面积 %RSD 拖尾因子
流速变化（0.3 mL/min） 100 4.05 4.05 60 96.00 0.67 1.99 4.05 4.05
流速变化（0.7 mL/min） 100 1.76 1.78 40 77.83 0.76 2.01 1.77 1.82
流动相组成变化（水: 甲醇 - 78:22） 100 2.46 2.46 69 21.74 0.06 2.24 2.42 2.52
流动相组成变化（水: 甲醇 - 82:18） 100 2.47 2.47 57 76.48 4.89 2.46 2.46 2.49
柱温变化（82°C） 100 2.18 62.17 12.24 82.19 28 81.77 3.35 2.76

3.5 方法应用
所建立的方法被用于测定菊粉醋酸酯片的体外释放曲线。在特定时间间隔收集的多个样本及其浓度显示在表5中。由于没有可用的认证InAc参考标准，因此使用菊粉作为替代标准进行定量。这是由于这两种多糖骨架的结构相似性；然而，这可能会因菊粉与其乙酰化形式之间的微小差异而引入轻微的定量偏差。此外，由于ELSD是一种基于质量的检测器，它能够无需显著修改即可检测非挥发性分析物，这与开发快速、简便的分析方法的目标一致，无需额外的衍生化步骤。包括空白样品和安慰剂样品在内的特异性研究进一步确认，在InAc的保留窗口内未检测到干扰峰。因此，该方法可以用于定量完整的InAc。该方法能够确定8小时内释放的菊粉酯的数量。体外释放研究表明，在胃相（0.1 N HCl）中释放了约18.18%的菊粉酯，在缓冲相中释放了高达89.18%的菊粉酯。因此，该方法可以有效地用于确定药物制剂中菊粉及其代谢物的含量。不同时间间隔的菊粉释放曲线图显示在图S6中（补充材料）。

表5. 菊粉醋酸酯片的体外释放数据

时间（小时） RT（分钟） 浓度（μg/mL） %CDR
0 2.69 21 8.73 5.10 0.5
2 2.68 19 1.09 9.56 1.5
2 2.68 17 8.17 13.72 22.69 19 1.13 18.18
3 2.70 47 9.94 29.38 42.75
4 12.50 41.34 5
5 2.69 50 5.00 53.12 6
6 2.69 49 2.38 64.61 7
7 2.69 53 5.64 77.11 8
8 2.69 51 7.48 89.18
*CDR = 累计药物释放百分比，RT = 保留时间

3.5 分析方法的绿色评估
3.5.1 国家环境方法指数（NEMI）
所提出的HPLC-ELSD方法使用水甲醇（80:20 v/v）作为流动相，pH范围为5–7，流速为0.5 mL/min。因此，产生的总废物少于50克，并且对环境没有腐蚀作用。此外，所有化学品均不属于持久性、生物累积性和毒性物质（PBT）。然而，甲醇被列为U类废物（U154）。因此，四个象限中有三个为绿色，表示该方法对环境的影响非常小（见图4（a）。

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图4. 方法的绿色评估：(a) NEMI图标；(b) 使用右侧参考颜色刻度进行的AGREE分析，以及左侧的评估结果；(c) GAPI图标，包含五个五角星，用于评估分析方法每个步骤的环境影响，其中绿色表示低影响，黄色表示中等影响，红色表示高影响。（有关此图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

3.5.2 分析绿色度量（AGREE）
所提出的HPLC-ELSD方法获得了0.55的AGREE分数（见图4（b）。该方法涉及离线取样（原则1），需要10 mg的菊粉样品（原则2），分析设备是离线的（原则3），程序步骤少于3个（原则4），采用手动和微型化分析（原则5），未使用衍生化剂（原则6），整个分析过程中产生了约30 mL的分析废物（原则7），每次运行可以确定单一分析物，样品通量为10个样品/小时（原则8），LC是最能耗高的技术，每次分析的功耗估计为0.5 kWh（原则9）。由于使用了甲醇，因此试剂不是来自生物基来源（原则10）。分析需要0.6 mL的有毒溶剂（原则11），并且甲醇具有高度易燃性和氧化性（原则12）。

3.5.3 绿色分析程序指数（GAPI）
GAPI图标表明，所开发的方法具有很高的绿色度，环境影响较低，有7个绿色字段和7个黄色字段，以及一个红色字段，表示分析后没有废物处理。因此，该方法可以被认为是资源高效的，具有 predominantly绿色的步骤和有限的溶剂消耗（图4c）。

3.5.4 环境、实用性和性能指数（EPPI）
EPPI分数是使用在线可用网站（https://reemobaydo.github.io/EI-PPI-Project/）确定的。结果以饼图形式展示在图5中，EI和PPI指标的分数分别为88.8和73.0。总体EPPI分数为80.9，表明该方法符合标准的绿色评估标准，具有可接受的实用性。完整的EPPI报告及各组成部分图表和解释总结可从表S5和表S6（补充材料）中获得。

4. 结论
本研究的结果表明，多糖菊粉可以在不进行水解或提取步骤的情况下快速确定和定量，从而减少了总体时间、努力和样品需求。此外，所建立的方法可以用于确定药物制剂或聚合物基质中菊粉及其酯的浓度，并获得满意的结果。基于ELSD的技术通过验证研究显示出极佳的可靠性，得到了具体且准确的结果。优化后的方法被认为是稳健可靠的，表明轻微的改变不会影响其检测能力。所有验证研究均符合ICH指南进行。最后，通过NEMI、AGREE、GAPI和EPPI等多种评估工具对所开发方法的环境影响进行了评估，发现与现有方法相比，该方法具有简化的流程和更高的资源效率，更具可持续性。

作者贡献声明
Parikshit Das：写作 - 审阅与编辑、撰写原始草案、验证、方法学、研究、数据管理、概念化。
Danswrang Goyary：监督、资源提供、项目管理、研究、数据管理、概念化。
Md. Kamaruz Zaman：监督、资源提供、方法学、数据管理、概念化。
Pronobesh Chattopadhyay：监督、资源提供、项目管理、数据管理。
Piya Adhikari：验证、方法学、形式分析。
Subramanyam Polopalli：可视化、形式分析。
Mohit Kumar：可视化、方法学。
Saidur Rahaman：可视化、形式分析、数据管理。
Yangchen Doma Bhutia：验证、形式分析、数据管理。
Sanjeev Karmakar：方法学、形式分析、数据管理。

本研究未从公共、商业或非营利机构获得任何特定的资助。