通过整合多组学与网络分析方法揭示肝细胞癌潜在预后生物标志物

《International Journal of Molecular Sciences》：Uncovering Prognostic Biomarkers Underlying Hepatocellular Carcinoma Through Integrative Multi-Omics and a Network-Based Approach Arshad Husain Rahmani, Anam Beg, Tarique Sarwar and Amjad Ali Khan

　　

肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）仍是全球癌症相关死亡的主要原因之一，这凸显了对稳健分子生物标志物以改善预后和治疗策略的需求。尽管在影像学、手术及系统治疗方面取得了进展，但由于晚期诊断、高复发率和分子异质性，HCC的预后仍然较差，这强调了识别稳健预后生物标志物和治疗靶点的意义。研究人员检查了TCGA-HCC队列的mRNA测序数据，以识别肿瘤与正常组织之间的差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。应用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）来发现关键基因模块和枢纽基因（hub genes）。蛋白质-蛋白质相互作用网络（Protein–protein interaction network, PPIN）构建和模块化分析进一步筛选了候选基因。单变量总生存期（Overall Survival, OS）分析确定了五个基因（TTK、CENPA、NUF2、KIF2C和CDCA8），其表达升高与患者生存不良显著相关。通路富集分析显示出与有丝分裂检查点和动粒信号通路的强烈关联。突变谱分析显示了频繁的基因组改变，特别是在NUF2中，而免疫浸润分析则表明NUF2表达与多种免疫细胞群之间存在显著相关性。本研究采用整合转录组学和系统生物学方法识别HCC中与预后相关的枢纽基因。总之，这些发现突出了可能作为HCC预后生物标志物和潜在治疗靶点的关键基因。

该研究针对肝细胞癌（HCC）预后不佳、缺乏可靠分子标志物的问题，通过整合多组学与网络方法揭示了潜在的预后生物标志物。研究人员首先利用TCGA数据库获取HCC患者的mRNA测序数据，经过预处理后识别出差异表达基因（DEGs）。随后，研究采用非性状依赖的加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建共表达网络，识别出关键模块和枢纽基因。接着，研究人员将枢纽基因导入STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPIN），并利用MCODE算法进行模块化分析以筛选核心基因簇。为了评估临床意义，研究进行了单变量总生存期（OS）分析和Reactome通路富集分析。此外，还利用cBioPortal数据库对关键基因进行了突变谱分析，并通过TIMER工具评估了其与肿瘤免疫浸润的相关性。该研究最终得出结论，确定了五个关键的预后枢纽基因。

在主要技术方法方面，研究人员从UCSC Xena浏览器获取TCGA-HCC队列的mRNA测序数据，使用DESeq2和Limma包进行差异表达分析。通过Pigengene和WGCNA构建基因共表达网络并筛选枢纽模块。利用STRING数据库和Cytoscape软件构建并可视化PPIN，使用MCODE插件识别核心聚类。采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验评估基因的预后价值，利用Enrichr数据库进行通路富集分析，并通过cBioPortal和TIMER平台分别进行突变频率和免疫细胞浸润的相关性分析。

研究结果部分显示，在mRNA测序数据提取与差异表达分析（mRNA-Seq Data Extraction and DEA）中，研究人员分析了包含肿瘤样本和健康正常样本的TCGA-HCC数据集，识别出大量DEGs，火山图和热图直观展示了这些基因的表达分布特征。在非性状依赖WGCNA构建与枢纽模块/基因选择（Non-Trait-Based WGCN Construction and Hub Module/Genes Selection）中，通过对DEGs的层次聚类，成功构建了WGCN，并将其划分为蓝色和青色两个主要模块，这两个模块均表现出较高的模块成员资格（MM）与 intramodular connectivity（k.in）相关性，被确定为枢纽模块。在PPIN构建与模块化分析（PPIN Construction and Modular Analysis）中，将枢纽基因输入STRING构建网络，并从中识别出包含多个节点的顶级评分聚类。在单变量OS与通路富集分析（Univariate OS and Pathway Enrichment Analyses）中，KM生存曲线表明TTK、CENPA、NUF2、KIF2C和CDCA8的高表达与HCC患者较差的OS显著相关，箱线图证实了这些基因在肿瘤与正常组织间的表达差异，Sankey图则显示这些基因显著富集于未附着动粒信号放大等有丝分裂检查点通路。在预后显著DEGs的突变分析（Mutational Analysis of Prognostically Significant DEGs）中，cBioPortal分析显示这些基因在约半数患者样本中发生了改变，其中NUF2表现出相对较高的突变频率，主要以扩增和错义突变为主。在肿瘤免疫浸润分析（Tumor Immune Infiltration Analysis）中，散点图揭示了NUF2表达与肿瘤纯度以及B细胞、树突状细胞（DCs）、CD8⁺T细胞、巨噬细胞（MPs）、中性粒细胞和自然杀伤T细胞（NKT cells）等多种免疫细胞群呈显著正相关。

讨论部分指出，本研究采用了一种整合的“漏斗”策略，从广泛的转录组失调过渡到高度特异性的预后标志物。通过WGCNA捕获协调的基因调控而非孤立的表达变化，并结合PPIN分析，最终锁定了五个核心基因。这些基因主要参与有丝分裂检查点和动粒信号通路，其失调促进了染色体不稳定性，这与HCC的致病机制相符。突变分析显示NUF2具有较高的基因组改变频率，而免疫浸润结果则揭示了细胞周期基因与肿瘤微环境（TME）之间的潜在联系。综上所述，这些发现强调了有丝分裂检查点失调在疾病进展中的关键作用。

结论部分明确，通过这项整合的生物信息学分析，研究人员确定TTK、CENPA、NUF2、KIF2C和CDCA8是HCC中重要的预后枢纽基因。这些基因不仅具有预后相关性，还表现出显著的基因组和免疫学相关性，并与细胞周期和有丝分裂检查点通路密切相关。本研究的结果为HCC演变的分子途径提供了见解，并提出了需要进一步实验和临床验证的潜在生物标志物和 therapeutic targets。