《International Journal of Molecular Sciences》：CRISPR-Cpf1-Mediated Gene-Editing System Based on a Single Bidirectional Promoter
Soomin Kim,
Gyeong-Nam Kim,
Yeon-Ju Jeong,
Jeongin Cho,
Mingyo Jang,
Jinpyo Hong and
Young Hoon Sung
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近期基因治疗的进展凸显了基于CRISPR的基因编辑系统与腺相关病毒(AAV)载体结合应用的潜力。然而，AAV有限的包装容量（~4.7 kb）仍然是同时在单个载体内表达Cas效应蛋白和向导RNA(guide RNA)的一项重大挑战。为了解决这一限制，研究人员开发
近期基因治疗的进展凸显了基于CRISPR的基因编辑系统与腺相关病毒(AAV)载体结合应用的潜力。然而，AAV有限的包装容量（~4.7 kb）仍然是同时在单个载体内表达Cas效应蛋白和向导RNA(guide RNA)的一项重大挑战。为了解决这一限制，研究人员开发了一种紧凑的AAV载体，利用源自小鼠H1启动子的单一双向启动子，实现了Acidaminococcus sp. Cas12a (AsCpf1)与CRISPR RNA (crRNA)的共表达。该单一双向H1启动子支持的可诱导插入缺失(Indel)形成与双启动子系统相当，并促进了单靶点、双靶点和三靶点配置的可扩展基因组编辑。在AAV递送后，体外和体内均成功完成了基因组编辑。本研究表明，工程化的紧凑型AAV载体平台能够同时递送AsCpf1和多路复用(multiplexed) crRNA。
基因治疗领域的快速发展使得CRISPR-Cas系统成为基因组工程的核心工具，但在临床转化过程中，腺相关病毒(AAV)载体的包装容量限制始终是制约其应用的关键瓶颈。AAV载体约4.7 kb的装载上限严重限制了治疗性载体的设计，特别是对于需要同时递送大型Cas效应蛋白（如Cas9）及其向导RNA的复杂系统。尽管近年来开发了多种紧凑型CRISPR-Cas系统，但这些系统在编辑效率或靶向特异性上往往存在妥协。在此背景下，Class 2, Type V CRISPR核酸酶Cas12a (Cpf1)因其仅需单一crRNA、具有内在的RNase活性以实现自主crRNA加工以及对T-rich PAM序列的识别能力而备受关注。然而，传统的双启动子架构（分别驱动核酸酶和crRNA表达）依然超出了AAV的包装极限。因此，开发能够同时从单一调控元件驱动编码区和非编码区转录本的紧凑型启动子架构——即双向启动子策略，成为了实现高效单载体AAV递送的关键。本研究由Soomin Kim、Gyeong-Nam Kim、Yeon-Ju Jeong、Jeongin Cho、Mingyo Jang、Jinpyo Hong及Young Hoon Sung等人共同完成，旨在利用小鼠H1启动子的双向转录活性，构建一种能够同时表达Cpf1及其crRNA的紧凑型AAV平台，相关研究发表在《International Journal of Molecular Sciences》上。
为实现这一目标，研究人员采用了几项关键技术方法：首先，通过对小鼠H1启动子进行工程化改造，设计了包含不同5' GG基序、Parp2 5' UTR及Kozak序列的变体，并利用慢病毒系统在NIH3T3细胞中进行功能筛选。其次，利用优化的单向或双向H1启动子构建AAV-DJ载体，通过定量实时PCR测定病毒滴度，并在NIH3T3、HepG2细胞及原代野生型小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中进行体外转导与编辑效率评估。体内实验则通过立体定位手术将AAV注射至C57BL/6小鼠纹状体，利用免疫荧光染色和靶向深度测序验证编辑效果。此外，研究还结合了T7内切酶I (T7E1) 试验及Illumina iSeq 100系统的深度测序分析来精确量化基因组各靶点的插入缺失(Indel)频率。
研究结果显示，在“2.1. Optimization of the Bidirectional mH1 Promoter for Co-Expression of AsCpf1 and crRNA”（双向mH1启动子用于AsCpf1和crRNA共表达的优化）部分，研究人员通过对5种小鼠H1启动子变体的测试发现，包含Parp2 5' UTR的变体#5表现出最高的Indel活性。进一步对5' UTR长度的修饰表明，特定的核苷酸序列添加（如V2版本）对于维持适当的AsCpf1表达和细胞活力至关重要，最终选定了优化的启动子版本用于后续实验。
在“2.2. Confirmation of Bidirectional H1 Promoter Systems for CRISPR-Cpf1 Expression”（CRISPR-Cpf1表达的双向H1启动子系统确认）部分，通过对比传统的双启动子U6/EFS系统与单向H1启动子系统，研究发现尽管H1启动子驱动的AsCpf1蛋白表达水平略低于EFS启动子，但其诱导的Indel形成频率与双启动子系统相当，且能在Trp53、Pten和Nf1等多个基因座上稳定产生基因组编辑效果。
关于“2.3. Functionality of the Single-Vector AAV–Mediated Genome-Editing System In Vitro and In Vivo”（单载体AAV介导的基因组编辑系统在体外和体内的功能性）的研究表明，搭载H1启动子的AAV-DJ载体能在NIH3T3和HepG2细胞中有效驱动EGFP表达。在原代MEF细胞中，该系统不仅能实现对Trp53的单靶点编辑，还能同时进行Trp53/Pten的双靶点以及Trp53/Pten/Nf1的三靶点多重基因组编辑，且使用较短的SV40 poly(A)信号与较长的bGH poly(A)信号在编辑效率上无显著差异。在体内实验中，向小鼠纹状体注射AAV后21天，通过免疫组化和深度测序证实了H1启动子能有效驱动AsCpf1表达并诱导显著的Indel突变。
在讨论部分，研究人员指出，尽管AAV载体因其安全性高和转导效率高而被广泛用于体内基因编辑，但其包装容量的限制一直是递送多重CRISPR系统的主要障碍。本研究开发的基于小鼠H1启动子内在双向转录活性的CRISPR-AsCpf1平台，成功解决了这一难题，实现了从单一AAV载体进行多重基因组编辑。与先前利用人类H1启动子驱动sgRNA和Cas9表达的研究不同，本研究采用了优化的小鼠H1启动子来驱动多重Cpf1介导的编辑。虽然该系统存在持续的核酸酶表达可能带来的脱靶风险，且AsCpf1的表达水平较传统的Pol II驱动系统有所降低，导致编辑效率略有下降，但考虑到Cpf1本身具有较高的保真度，且该系统具有极高的紧凑性和灵活性，这使其特别适用于受载体大小限制的体内应用场景。此外，由于H1启动子来源于Parp2基因座的调控元件，其在不同组织或细胞中的活性差异仍需进一步评估。综上所述，该研究建立的基于H1启动子的紧凑型CRISPR-AsCpf1系统，为AAV介导的体内多重基因组编辑应用提供了重要的基础平台，未来通过启动子工程或引入额外调控元件有望进一步优化其一致性和效率。
