A3UNet：一个轻量级的农田识别网络，集成本地、中距离和全球建模技术 杨志宏、芮晓平

《Remote Sensing》：A3UNet: A Lightweight Farmland Identification Network Integrating Local, Medium-Range, and Global Modeling Zhihong Yang and Xiaoping Rui

　　摘要：铬（Cr）污染会导致作物中铬的积累，从而对粮食安全和人类健康构成重大威胁。理解铬毒性的机制并开发有效的缓解策略对于确保作物健康生长至关重要。褪黑素（MT）是一种多功能调节分子，在植物应对重金属压力时起着关键作用。本研究旨在探讨外源施用MT如何减轻玉米幼苗中铬压力的毒性。研究结果表明，在铬压力条件下，MT处理显著降低了玉米根部和叶片中的铬含量，分别降低了22%和28.5%。同时，MT有效缓解了铬暴露引起的毒性效应，表现为叶片面积、叶绿素含量和光合速率显著提高，分别增加了40.3%、47.7%和64.8%。这导致玉米总干重增加了42.2%。进一步分析表明，MT调节了抗氧化系统，减少了活性氧的产生并降低了与铬毒性相关的膜脂质损伤。此外，MT上调了参与多胺合成的酶的表达和活性，同时抑制了多胺降解酶的活性，使总多胺含量增加了38%。这项研究加深了我们对褪黑素如何缓解作物中铬毒性的理解，并为其在农业生产中的可持续应用提供了理论基础。

1. 引言
重金属污染是一个全球关注的环境挑战。工业化和城市化的进程导致环境中重金属水平持续上升[1]。铬（Cr）被认为是危害最大的重金属之一。过去五十年中，全球铬的排放量超过了30,000吨，来源于自然来源和人为活动[2]。大量铬通过火山爆发等自然现象以及人类活动（如油漆使用、皮革工业操作和工业烟雾和粉尘排放）进入农业用地，导致严重的土壤污染[3,4]。研究表明，铬在植物器官中的积累会阻碍水分和矿物质养分的吸收，降低光合效率，并扰乱代谢平衡[5]。此外，作物中积累的铬可能通过食物链进入人体，引发包括肺癌和胃癌在内的多种疾病，对人类健康构成严重威胁[6]。鉴于铬污染对作物生长和人类健康的负面影响，迫切需要制定有效策略来减少作物中铬的积累并减轻其毒性效应。近年来，已经开发出多种修复技术来减轻农业生态系统中的重金属污染，包括物理化学改良、植物修复和微生物辅助方法，以及基因工程和合成生物学等新兴策略[7]。越来越多的研究致力于提高植物对重金属的内在耐受性。在这些策略中，外源调节分子是一种有前景且实用的方法，因为它们可以直接调节植物的生理反应，使植物更有效地应对重金属压力[8]。褪黑素（MT）是一种在植物和动物中广泛存在的化合物，1995年首次在植物中被发现[9,10]。作为一种多功能调节分子，MT参与许多生理过程，包括种子萌发、根系发育、光合作用、开花和叶片衰老[11]。值得注意的是，MT在增强植物对盐害、干旱和重金属暴露等多种环境压力的耐受性方面也起着关键作用[12]。最近的研究探讨了外源MT缓解植物铬毒性的潜力。例如，外源MT已被证明可以通过减少铬的吸收和毒性来显著促进受铬污染土壤中小麦的生长和产量[13]。Farouk和Al-Amri的研究[14]表明，叶面施用MT可以通过维持氧化还原平衡、促进渗透调节和保持细胞超微结构稳定性来减轻马郁兰的铬诱导衰老。此外，MT还通过调节类胡萝卜素合成来增强光合作用，从而减轻铬对植物的有害影响[15]。然而，MT缓解铬压力的具体机制仍需进一步阐明。

多胺是一类含有两个或多个胺基的脂肪族化合物，主要包括腐胺（Put）、亚精胺（Spd）和精胺（Spm）[16]。研究表明，多胺参与多种生理过程，包括细胞分裂和分化、胚胎发育、花蕾分化、叶片生长和衰老[17]。此外，植物中多胺含量的增加可以提高其对干旱、盐害、极端温度和重金属毒性的抵抗力[18]。例如，外源施用多胺可以减少铬的积累，增强抗氧化酶活性，提高光合效率，并维持激素平衡，从而提高水稻对铬毒性的耐受性[19]。此外，多胺可以通过激活抗氧化防御机制、减少细胞氧化损伤和增强膜结构稳定性来减轻铬毒性对玉米生长的抑制作用[20]。在轻度干旱条件下，多胺还被观察到可以抑制脱落酸诱导的气孔关闭，从而保持植物的光合能力[21]。植物吸收铬后，会大量产生活性氧（ROS），这些ROS会对蛋白质、核酸和脂质造成氧化损伤，破坏细胞膜的结构完整性，导致氧化还原状态失衡以及细胞内物质泄漏[22,23]。面对氧化应激，植物会启动抗氧化防御系统，包括酶类抗氧化剂（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）以及非酶类化合物（如谷胱甘肽（GSH）和抗坏血酸（AsA）[24]。然而，在重金属压力条件下，尽管植物可能增强某些抗氧化酶的活性并提高非酶类抗氧化剂的水平，但完全消除过量ROS和减轻氧化损伤仍然具有挑战性。外源调节物质的应用可以进一步刺激抗氧化防御系统，从而更有效地减少ROS造成的损伤[23,25]。玉米（Zea mays L.）是一种重要的全球粮食作物，既是生物质能源的来源，也是维持人口增长和工业发展的关键[26]。然而，土壤中的重金属污染物对玉米生产构成了严重威胁[27]。环境系统中的铬主要以两种价态存在，即三价（Cr(III)）和六价（Cr(VI)）。其中，六价铬的毒性显著更高，被国际癌症研究机构列为第1类人类致癌物[28]。因此，本研究以六价铬作为研究对象。先前的研究表明，外源MT通过激活抗氧化防御机制和促进渗透调节来增强植物对铬的耐受性[14]。此外，多胺在维持氧化还原平衡和支持植物在铬压力下的生长和发育中起着关键作用[20]。越来越多的证据表明，在盐害和低温度等非生物压力条件下，外源MT通过上调ZAT2/6/12和CsMYB44等转录因子来促进植物中多胺的积累[29,30,31]。基于这些发现，我们提出假设：MT可能通过调节多胺代谢来缓解玉米中的铬毒性。因此，本研究使用玉米作为实验材料，研究植物中铬和MT的积累情况，并检查多胺代谢、氧化还原平衡和植物生物量的变化。本研究探讨了MT如何减轻铬压力，为利用外源MT减少铬对玉米生长的不利影响提供了依据。

2. 结果
2.1 MT和Cr对玉米生长参数的影响
经过7天的铬压力处理后，玉米植株中铬的积累显著增加。外源MT显著减少了这种积累。具体来说，与仅施用铬相比，MT处理使叶片和根部的铬含量分别降低了28.5%和22%。此外，在正常和铬压力条件下，外源MT都提高了根部和叶片中的内源性MT水平，在铬压力条件下这种提高更为明显（图1A–D）。这些结果表明，外源MT有效地减少了玉米植物中铬的吸收及其向地上部分的转运。在标准生长条件下，MT供应并未显著影响玉米植物的干生物量（图1E,F）。然而，在铬压力下，玉米地上部和根部的干生物量分别减少了40.4%和42.7%。值得注意的是，MT处理显著缓解了铬压力对玉米干生物量积累的抑制作用。同时，MT处理显著增强了铬压力下玉米幼苗的叶片面积和根系活力（图1G,H）。总体而言，外源MT的应用有效减少了玉米植物中的铬积累，并减轻了铬压力对植物生长的不利影响。

2.2 MT和Cr对玉米光合作用的影响
为了研究MT缓解铬压力对玉米生长抑制作用的潜在机制，本研究检测了不同处理条件下玉米叶片中叶绿素含量、光合参数（光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、细胞间CO2浓度（Ci）和蒸腾速率（Tr）以及光系统II的最大量子效率（Fv/Fm）的变化（图2）。在最佳条件下，外源施用MT并未显著影响叶绿素含量、光合参数或Fv/Fm。相反，在铬压力下，总叶绿素含量、光合参数和Fv/Fm显著降低，表明光合功能受到严重损害。值得注意的是，外源MT显著缓解了这些光合相关参数的下降。与仅施用铬相比，MT + Cr处理使总叶绿素含量、Fv/Fm、Tr、Gs和Pn分别增加了47.7%、64.4%、62.9%、70.3%和64.8%。这些结果表明，MT有效保护了玉米叶片的光合机制免受铬的损害，从而在铬压力下维持了光合生产力。

2.3 MT和Cr对玉米内源性多胺代谢的影响
为了研究MT缓解玉米铬压力的机制是否与多胺代谢有关，分析了不同处理条件下幼苗中多胺含量的变化。在标准条件下，外源施用MT并未显著影响玉米幼苗中不同形式（包括游离态、可溶性结合态和不可溶性结合态）的Spd、Put和Spm的浓度。然而，在铬压力下，玉米中的Spd、Put和Spm水平显著增加，外源MT处理后这种增加更为明显（图3和图4）。此外，与多胺合成相关的酶活性分析也显示了类似的趋势；特别是在铬压力下，精氨酸脱羧酶（ADC）、鸟氨酸脱羧酶（ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC）的活性显著增强，外源MT进一步增强了这些酶的活性。例如，与单独使用铬（Cr）处理相比，外源性褪黑素（MT）的应用使玉米叶片中的ADC、SAMDC和ODC酶的活性分别提高了46.2%、63.3%和63.9%，而在根部则分别提高了59.7%、39.6%和74.4%（图5A–C）。相反，在铬胁迫条件下，玉米植株中降解多胺的酶二胺氧化酶（DAO）和多胺氧化酶（PAO）的活性显著升高。然而，外源性MT的引入显著抑制了这种增加。具体来说，与单独使用铬处理相比，MT + Cr处理使叶片中的PAO和DAO活性分别降低了46.2%和31.1%，而在根部则分别降低了35.5%和27.0%（图5D,E）。此外，该研究还检测了与玉米根部和叶片中多胺生物合成相关的基因表达水平，发现其趋势与多胺合成酶的活性和多胺含量一致（图6）。总之，多胺可能通过褪黑素的作用在减轻玉米对铬的毒性方面起着关键作用。

图3. 褪黑素和铬处理对玉米叶片中多胺（PAs）分数的影响，包括游离、结合和束缚的腐胺（Put, (A–C)；游离、结合和束缚的亚精胺（Spd, (D–F)；游离、结合和束缚的精胺（Spm, (G–I)；游离、结合和束缚的PAs, (J–L)）。CK：对照；MT：褪黑素；Cr：铬；Cr + MT：褪黑素 + 铬。数值为平均值 ± 标准误差（n = 4）。水平轴上的不同小写字母表示不同处理组之间的统计学显著差异（p < 0.05）。

图4. 褪黑素和铬处理对玉米根部多胺（PA）分数的影响，包括游离、结合和束缚的腐胺（Put, (A–C)；游离、结合和束缚的亚精胺（Spd, (D–F)；游离、结合和束缚的精胺（Spm, (G–I)；游离、结合和束缚的PAs, (J–L)）。CK：对照；MT：褪黑素；Cr：铬；Cr + MT：褪黑素 + 铬。数值为平均值 ± 标准误差（n = 4）。水平轴上的不同小写字母表示不同处理组之间的统计学显著差异（p < 0.05）。

图5. 褪黑素和铬处理对玉米叶片和根部精氨酸脱羧酶（ADC, (A)）、鸟氨酸脱羧酶（ODC, (B)）、S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶（SAMDC, (C)、二胺氧化酶（DAO, (D)）和多胺氧化酶（PAO, (E)活性的影响。CK：对照；MT：褪黑素；Cr：铬；Cr + MT：褪黑素 + 铬。数值为平均值 ± 标准误差（n = 4）。水平轴上的不同小写字母表示不同处理组之间的统计学显著差异（p < 0.05）。

图6. 褪黑素和铬处理对玉米叶片和根部与多胺生物合成相关基因表达的影响。CK：对照；MT：褪黑素；Cr：铬；Cr + MT：褪黑素 + 铬。刻度条表示log2（倍数变化）值。

2.4. MT和Cr对氧化应激的影响
当玉米幼苗暴露于铬（Cr）时，根部和叶片中的过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2?）水平显著增加。这些活性氧（ROS）以其氧化还原毒性而闻名，对植物细胞完整性构成威胁。后续分析表明，铬处理显著提高了丙二醛（MDA）含量和相对电导率，表明细胞受到了严重的氧化损伤。相反，外源性MT显著减轻了氧化损伤。与单独使用铬处理相比，MT的应用使叶片中的O2?和H2O2水平分别降低了27.1%和19.6%，而在根部则分别降低了36.4%和37.7%（图7C,D）。此外，MT还显著降低了MDA含量和电解质泄漏（图7A,B）。这些发现表明MT在缓解铬引起的植物毒性方面起着关键作用。

2.5. MT和Cr对抗氧化防御系统的影响
为了阐明MT在缓解铬胁迫引起的氧化还原损伤中的关键作用，我们评估了玉米幼苗中抗氧化酶的活性。结果表明，在铬胁迫条件下，外源性MT显著增强了SOD、POD和CAT的活性（图8A–C）。具体来说，与单独使用铬处理相比，MT的应用使叶片中的SOD、POD和CAT活性分别提高了57.1%、55.3%和33.9%，而在根部则分别提高了57.7%、42.5%和38.2%。与这些抗氧化酶活性的变化一致，MT处理还显著提高了受铬胁迫的玉米幼苗中非酶抗氧化剂（即AsA和GSH）的水平（图8D,E）。此外，对与抗氧化酶相关基因表达水平的分析表明，外源性MT在铬胁迫条件下显著上调了它们的表达（图9）。这些结果表明MT激活了抗氧化系统，从而增强了了对铬胁迫诱导的ROS的清除并减轻了氧化损伤。

3. 讨论
农业土壤中的铬污染对食品安全、生态系统和人类健康构成了重大风险。研究表明，一旦植物吸收了铬，其在植物组织中的积累会破坏抗氧化防御系统，影响水分和养分的吸收，降低光合作用活性，并扰乱代谢平衡，最终抑制植物生长[5,23]。本研究发现，在铬胁迫条件下，玉米中的铬浓度显著增加，导致生长受到显著抑制（图1）。先前的研究表明，外源性MT可以减轻重金属对西瓜、小麦和番茄等植物的生长抑制效应[32,33,34]。在本研究中，外源性MT显著增加了受铬胁迫的玉米植株的干物质积累，并有效缓解了铬引起的生长抑制（图1E,F）。值得注意的是，MT还显著减少了玉米幼苗叶片和根部的铬积累（图1A,B）。先前的研究已经表明，MT可以通过调节金属转运相关基因（如HMA2、IRT1和Nramp5）的表达以及促进细胞壁成分（包括纤维素、半纤维素和果胶）的积累来减少植物对重金属的吸收和转运[35,36,37]。本研究中观察到的叶片和根部铬积累的显著减少可能归因于这些机制的调节。

铬胁迫通常会损害光合作用，而光合作用是植物生物量形成的基础[38]。本研究表明，MT可以增强光合作用活性，这对于玉米抵抗铬毒性至关重要。具体来说，MT的应用在铬胁迫条件下显著增加了Pn、Ci、Gs和Tr的含量（图2）。与先前的研究一致，MT已被证明可以通过调节气孔导度和细胞间二氧化碳浓度来缓解铬胁迫引起的光合作用抑制[39]。此外，MT通过增强Rubisco的活性促进了二氧化碳的吸收，从而维持了受热胁迫的番茄叶片中的光合作用[40]。叶绿素含量和光系统II的最大量子效率是植物吸收和转化光能能力的重要指标。最近的研究表明，MT可以在盐胁迫条件下增强光合色素的浓度，从而提高水稻的光能吸收和传输效率[41]。此外，外源性MT已被证明可以在铬胁迫下恢复Chlamydomonas reinhardtii[15]和硝酸盐胁迫下的烟草[42]的光合能力，通过保持类囊体膜的完整性、稳定叶绿体的超微结构以及抑制负责叶绿素降解的酶。在本研究中，外源性MT显著提高了受铬胁迫的玉米的总叶绿素含量和Fv/Fm值，从而改善了它们的光能吸收和转化能力（图2E,F）。总之，这些发现提供了关于MT如何缓解铬诱导的光合作用抑制的宝贵见解。

多胺在调节植物生长、发育过程以及适应非生物胁迫条件方面起着重要作用。研究表明，在铬胁迫下的柑橘植物中，多胺的合成可以被上调[43]。此外，外源性多胺的应用已被证明可以通过增强抗氧化酶活性、改善光合作用装置和维持激素平衡来减轻玉米中的铬毒性[19]。在本研究中，外源性MT显著提高了受铬胁迫的玉米根部和叶片中Put、Spd和Spm的水平（图3和图4）。DAO和PAO是分解多胺的酶，会产生活性氧（H2O2）[44]。这项研究揭示，外源性MT显著降低了这两种酶的活性，从而促进了多胺的积累（图5D,E）。关于多胺缓解重金属胁迫的机制，研究表明多胺可以抑制金属离子的自我氧化，从而防止ROS的产生。此外，它们通过转录机制调节抗氧化相关基因的表达或直接激活抗氧化酶，从而增强植物清除ROS的能力[17]。总之，MT显著增强了多胺的积累，同时减少了ROS的产生，从而提高了玉米幼苗对铬胁迫的耐受性。

活性氧的产生与清除之间的平衡对植物生长、发育和抗逆性至关重要[45]。在铬胁迫下，植物会过度产生ROS，导致膜脂质过氧化和细胞损伤[23]。最近的研究表明，MT可以有效减轻铬引起的氧化损伤，显著降低ROS和丙二醛的水平[46]。在本研究中，外源性MT在铬胁迫下显著降低了O2?和H2O2的水平，并减少了膜损伤标志物MDA和电解质泄漏（图7）。在铬胁迫的油菜[47]、Chlamydomonas reinhardtii[15]和小麦[46]中也报告了类似的结果。为了对抗ROS引起的氧化损伤，植物发展出了复杂的清除系统，其中酶促和非酶促抗氧化剂都起着关键作用。在马郁兰植物中，叶面施用MT激活了抗氧化酶的活性，减少了ROS的积累，并有效缓解了铬引起的叶片损伤[14]。Awan等人[48]表明，MT的应用增强了与抗氧化酶相关的基因表达，同时减少了镉在珍珠粟中诱导的ROS的积累和毒性。本研究的结果支持了这些发现。在铬胁迫下，MT的应用显著上调了SOD、CAT和POD的表达水平（图9），这与观察到的酶活性增加一致（图8A–C）。此外，GSH和AsA是解毒ROS的关键化合物，也可能在细胞内螯合重金属[49]。本研究揭示，外源性MT提高了玉米叶片和根部GSH和AsA的浓度，从而增强了植物清除ROS的能力（图8D,E）。这些发现与先前的研究结果一致，表明外源性MT可以在铅胁迫下增加AsA和GSH的水平，从而减少过多的ROS积累并减轻氧化损伤[50]。在研究MT在减轻芥菜植物中镉毒性的作用时也报告了类似的结果[51]。这些结果共同表明，外源性地应用褪黑激素（MT）能够激活植物的抗氧化防御系统，并有助于清除过量的活性氧（ROS），从而恢复受到铬（Cr）胁迫的玉米中的氧化还原平衡。最近，Ali等人[52]阐明了过量的ROS会导致不可逆的细胞损伤，而调节适量的ROS则可以作为信号分子，促进植物的生理调整和适应反应，增强其对环境胁迫的抵抗力。例如，活性氧已知可以激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，调节下游转录因子（包括bZIP、WRKY和MYB），促进解毒酶基因的表达，并提高植物对重金属暴露的耐受性[53]。本研究证明，MT通过激活抗氧化防御系统和促进多胺积累来减轻Cr胁迫，有效减少了ROS的积累，维持了细胞内的氧化还原稳态，这对于ROS作为信号分子的正常功能至关重要。总之，本研究阐明MT主要通过协同激活抗氧化防御系统和提高多胺水平来增强玉米幼苗对Cr的耐受性。先前的研究已经表明，多胺可以通过激活抗氧化防御机制和减少细胞氧化损伤来显著减轻Cr毒性对玉米生长的抑制作用[20]。基于这些发现，我们假设MT可能通过调节多胺代谢来促进抗氧化防御系统的激活，从而减轻Cr毒性。这一假设需要通过分子生物学方法进一步探讨。

4. 材料与方法
4.1. 植物生长和实验处理
首先使用1%次氯酸溶液对Cr敏感的玉米品种“QS101”的种子进行表面消毒10分钟，然后用无菌水彻底冲洗。将处理过的种子均匀分布在湿润了蒸馏水的滤纸上，并在25°C的黑暗环境中培养三天以促进发芽。发芽后，将幼苗移植到含有1/2 Hoagland营养液（pH 5.8）的塑料容器中进行水培。随后，将玉米植株置于受控的气候室中，白天和夜间的温度分别设置为28°C和22°C，光照时间为14小时，黑暗时间为10小时，光照强度为800 μmol m?2 s?1。经过三周的生长后，根据我们之前的实验结果，用50 μM褪黑激素（MT）处理叶片。之后，在MT处理12小时后，向营养液中加入100 μM重铬酸钾（K2Cr2O7）以建立Cr胁迫条件。实验包括四种处理：对照组（无MT，无K2Cr2O7）、MT组（50 μM MT）、Cr组（100 μM K2Cr2O7）以及MT+Cr组（50 μM MT和100 μM K2Cr2O7）。每种处理条件重复10次，每个盒子里含有10株幼苗。在Cr胁迫诱导后7天，收集玉米植株的根和叶片，并在-80°C的超低温冷冻柜中存储以备后续分析。每种处理条件进行了三次独立重复实验。

4.2. 褪黑激素和铬浓度以及植物表型参数的测量
利用高效液相色谱法（参考文献[54]）测定玉米植株中的内源性褪黑激素含量。首先准确称量0.5克样品，并在液氮条件下将其研磨成细粉。然后加入5毫升甲醇进行提取。将混合物在4°C下以10,000× g离心30分钟，收集上清液后用氮气流干燥。将干燥后的残渣重新溶解在200 μL 0.1 M Na2HPO4–乙腈混合物（65:35, v/v）中，通过0.22 μm膜过滤器过滤，取5 μL样本注入C18色谱柱（Shimadzu，京都，日本）进行分离。检测波长为280 nm。样品中的褪黑激素含量是根据Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）提供的标准曲线确定的。叶片和根中的铬含量采用Hasan等人[35]的方法进行测定。称取0.2克样品，用HNO3和HClO4按5:1的比例在180°C下消化。消化后的溶液适当稀释后，使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-AES，Optima 7000 DV，PerkinElmer，Waltham, MA, USA）测量铬浓度。经过7天的处理后，收集玉米的根和茎部，将其在80°C下烘干至恒重并记录干重。使用LI-3000叶面积仪（LI-COR，Lincoln, NE, USA）测定叶面积指数。根的活力评估采用三苯基四唑氯化物（TTC）方法[55]。将0.1克根样品置于含有5 mL 0.4% TTC和5 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）的溶液中，在无光条件下孵育2小时。然后用乙酸乙酯提取提取物，并在485 nm处使用紫外分光光度计（UV-2600，Shimadzu，京都，日本）测量其吸光度。

4.3. 叶绿素含量、Fv/Fm和气体交换参数的测定
根据Guo等人[56]的方法，使用95%乙醇从叶片中提取叶绿素。使用分光光度计（LI-6800，LI-COR Biosciences，Lincoln, NE, USA）在上午10:00至11:00之间测量最新展开叶片的Pn、Ci、Gs和Tr。叶室面积为2 cm × 3 cm，光合光子通量密度设置为1000 μmol m?2 s?1，相对湿度控制在50%，CO2浓度与环境条件相同。选择用于光合作用测量的叶片所在位置的叶片，在黑暗适应20分钟后，使用PAM2500叶绿素荧光仪（Walz，Effeltrich，德国）测定光系统II的最大光化学量子产率（Fv/Fm）。

4.4. 多胺含量的测定
根据Flores和Galston[57]的方法分析玉米中不同形式的多胺，包括游离态、可溶性结合态和不可溶性结合态。将2克冷冻样品用液氮研磨成细粉，然后用5 mL 5%高氯酸提取。将混合物在冰上孵育1小时，然后在4°C下以12,000× g离心20分钟，分离上清液和沉淀物。上清液用于测定游离態和可溶性結合態多胺，沉淀物用于不可溶性結合態多胺的分析。对于游离态多胺的测定，将2 mL上清液与1 mL 2 M NaOH和10 μL苯甲酰氯混合，然后在37°C下孵育30分钟。接着加入2 mL饱和NaCl和等体积的醚，充分振荡后以4000× g离心5分钟，提取醚层并溶解在甲醇中。用氮气蒸发溶剂后，使用配备C18反相柱（nanoViper，Thermo Fisher，Waltham, MA, USA）的高效液相色谱系统（Shimadzu，京都，日本）定量测定Put、Spd和Spm的含量。

4.5. 参与多胺代谢的酶活性分析
根据Sheteiwy等人[58]的方法评估ADC、SAMDC和ODC的活性。将冷冻样品（0.5 g）研磨并与3 mL提取缓冲液（50 mM EDTA、25 mM磷酸钾、100 μM苯甲酰甲基磺酰氟、25 mM抗坏血酸（AsA）和1 mM 2-巯基乙醇）混合均质化。将混合物在4°C下以25,000× g离心20分钟，上清液在提取缓冲液中透析过夜。酶活性通过测量CO2释放量来评估。多胺降解酶（包括DAO和PAO）的活性根据Wang等人[16]的方法使用UV-2600紫外分光光度计测定。

4.6. 氧化损伤和ROS的检测
根据先前研究[59]的方案测定O2?的浓度。将0.5克样品与65 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.8）混合，然后以5000× g离心10分钟。将上清液与50 mM磷酸钾缓冲液、10 mM羟胺、7 mM萘胺和17 mM磺胺混合，在25°C下孵育30分钟。使用分光光度计在530 nm处测量吸光度，并通过NaNO2标准曲线确定O2?含量。H2O2含量的测定根据Azarin等人[60]的方法，在415 nm波长处测量吸光度。样品用含有10%三氯乙酸和0.65%硫代巴比妥酸的溶液处理，并在95°C下孵育25分钟。MDA浓度按照之前的方法[61]进行测定。电解质泄漏根据Li等人[62]的方法进行评估。将0.1克样品浸入40 mL超纯Milli-Q水中，在室温下保持2小时。使用Mettler Toledo MC-126电导率仪测量初始电导率（EC1），然后煮沸15分钟，冷却至室温后记录最终电导率（EC2）。电解质泄漏以百分比表示，计算公式为（EC1/EC2）× 100。

4.7. 抗氧化酶活性的测定
称量0.5克冷冻植物组织样品，并在预冷的提取缓冲液中均质化。该提取缓冲液包含0.2 mM EDTA、2 mM AsA、25 mM HEPES（pH 7.8）和2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮。需要注意的是，用于测定SOD活性的提取缓冲液中不含AsA。将混合物在4°C下以12,000× g离心30分钟，收集上清液用于酶活性分析。SOD活性根据Goodarzi等人[63]的方法通过检测硝基蓝四唑（NBT）还原反应进行评估，检测波长设定为560 nm。CAT活性根据Han等人[64]的方法通过监测H2O2的分解来确定。POD活性使用吡咯甲酚氧化法[65]测定。AsA和GSH的浓度根据Lei等人[66]的方法测定。

4.8. 实时qPCR检测
使用Sangon试剂盒（北京，中国）根据制造商的方案从冷冻样品中提取总RNA。通过凝胶电泳评估RNA的完整性，并使用分光光度计在260 nm处定量RNA浓度。使用QuantStudio 1实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham, MA, USA）和SYBR? Premix Ex TaqTM按照制造商提供的方案进行定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）。利用Primer-BLAST工具（NCBI，Bethesda, MD, USA）设计目标基因的引物，ZmUbi-2作为内参。每个实验条件独立重复三次。目标基因的相对表达通过2?△△Ct比较阈值循环（Ct）方法进行评估。

4.9. 数据分析
数据使用SPSS软件22.0版（IBM，Armonk, NY, USA）进行分析，图表生成使用Origin 2024软件（OriginLab，Northampton, MA, USA）。处理组间的差异在p < 0.05时被认为是显著的。

5. 结论
本研究的结果表明，Cr胁迫会导致ROS过量积累，显著降低叶片中光合色素的含量和光合作用，从而严重抑制玉米的生长和发育。作为一种多功能分子，MT通过多种途径减轻Cr对玉米生长的不利影响。具体来说，MT增强了抗氧化酶的活性，并增加了非酶类抗氧化剂的水平，有效清除过量ROS，维持氧化还原稳态，缓解Cr引起的光合作用抑制。此外，褪黑素（MT）能够上调与多胺生物合成相关的基因表达，并显著增加多胺的积累，而多胺的积累与玉米对铬（Cr）毒性的增强有密切关联（见图10）。总体而言，这项研究为褪黑素缓解铬毒性的机制提供了重要的见解，为其在农业生产中的可持续应用奠定了理论基础。未来的研究将采用转录组学和代谢组学方法，进一步阐明褪黑素调控多胺代谢以减轻铬毒性的分子机制。图10：褪黑素通过促进多胺合成和激活玉米幼苗的抗氧化防御系统来缓解铬的毒性。