《Acta Biomaterialia》：Rocket propulsion-inspired two-stage nitric oxide–releasing hydrogel for phase-matched therapy of diabetic wounds
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陈拓|谢东娜|王跃|徐玉佳|焦平平|闫 jap an|陈荣谦|王萌|尚景杰|冉炳宇|冯志静|马东|李国伟|焦根龙中国山东省济南市济南大学第六附属医院骨科手术科，中央神经系统损伤与修复重点实验室，邮编523573摘要糖尿病足溃疡（DFUs）的愈合过程因细菌感染和慢性炎症的自我循环而
陈拓|谢东娜|王跃|徐玉佳|焦平平|闫 jap an|陈荣谦|王萌|尚景杰|冉炳宇|冯志静|马东|李国伟|焦根龙
中国山东省济南市济南大学第六附属医院骨科手术科，中央神经系统损伤与修复重点实验室，邮编523573
摘要
糖尿病足溃疡（DFUs）的愈合过程因细菌感染和慢性炎症的自我循环而受到严重阻碍，使得单一阶段的治疗策略效果不佳。为了解决这些复杂的病理问题，我们设计了一种基于火箭推进阶段分离原理的顺序释放一氧化氮（NO）的水凝胶。该水凝胶通过将负载NO的聚乙烯亚胺（PEI-NO）与氧化透明质酸交联形成，在初期实现大量NO的释放（第一阶段）。随后，通过剩余的PEI-NO和封装的S-亚硝酸化胆固醇脂质体（Lip-SNO）的共同作用，进入持续释放阶段（第二阶段），其释放动力学可通过PEI-NO/Lip-SNO的比例进行调节。体内实验表明，这种顺序释放模式引发了双相愈合反应：初始的NO释放能够杀菌并抑制早期炎症，而后期的持续NO释放则改善了伤口的免疫微环境，促进巨噬细胞向M2表型极化，增加血管内皮生长因子表达，促进血管生成，并加速胶原蛋白沉积和组织重塑。因此，这种两阶段顺序释放策略显著加速了DFU模型的伤口闭合，表明根据疾病阶段精确控制NO的剂量和释放曲线是治疗DFU的有效方法。
意义陈述
感染性糖尿病足溃疡是一种复杂的慢性疾病，目前的治疗方法主要依赖抗生素和局部伤口管理，但其疗效受到药物渗透性不足、耐药菌感染以及持续炎症难以缓解的制约。一氧化氮（NO）因其广谱抗菌作用、免疫调节效果以及促进血管生成和组织再生的能力，在糖尿病伤口治疗中展现出巨大潜力。然而，糖尿病伤口的愈合过程高度依赖于疾病阶段，能够根据疾病进展精确释放NO的材料系统仍缺乏研究。为此，本研究提出了一种基于火箭推进原理的阶段匹配NO释放策略，并开发了一种脂质水凝胶系统，以实现不同愈合阶段的精确调控和协同治疗。
引言
糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病患者中最常见且最具挑战性的慢性并发症之一，其特征是持续的细菌感染、慢性炎症反应和渐进性组织破坏[1]。与急性伤口不同，DFU长时间处于紊乱的病理微环境中。在此过程中，细菌感染和炎症相互加剧，抑制了血管修复和再生，显著延缓了肉芽组织形成和伤口闭合[2][3][4][5]。此外，糖尿病导致的血管生成和微循环障碍进一步限制了氧气、免疫细胞和治疗药物向伤口部位的有效输送[6]。因此，DFU的发病和进展具有明显的阶段依赖性，治疗效果很大程度上取决于干预策略与伤口进展之间的时间匹配[7]。早期需要快速控制感染和减少炎症，而后期则需要增强血管生成、免疫重塑和组织修复[8]。尽管目前的标准DFU治疗方法（包括抗菌治疗、局部伤口护理、减轻负荷和溃疡保护）已较为成熟，但其整体临床效果仍不尽如人意[9]。因此，亟需更精确且阶段匹配的治疗策略[9]。
一氧化氮（NO）是一种内源性气体信号分子，在血管调控、免疫防御和组织修复过程中起着关键作用[10,11]。NO及其衍生的活性氮物种（RNS）通过修饰蛋白质硫醇和金属酶中心实现广谱抗菌效果，同时还能诱导DNA损伤、脂质过氧化和膜破坏，从而干扰细菌的呼吸链、能量代谢和膜完整性，最终导致微生物失活[12]。NO还能干扰细菌的信号传导途径，例如通过激活磷酸二酯酶并降低细胞内环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）水平，促进生物膜分散，增强对抗耐药菌和生物膜相关感染的疗效[13]。越来越多的证据表明，当NO与其他抗菌成分结合使用时，可进一步增强多重抗菌效果，包括膜损伤、细胞内氧化应激和ATP合成抑制，从而降低耐药性的发生[14]。此外，在伤口愈合过程中，NO可改善局部微循环，抑制过度炎症反应，促进内皮细胞和 fibroblasts 的迁移和增殖以及胶原蛋白沉积，从而加速肉芽组织形成和血管生成[15,16]。然而，由于NO的半衰期极短，其在病变部位的稳定积累较为困难，其治疗效果很大程度上取决于释放时机和动力学的精确调控[17]。目前已经有多种NO释放平台，如ROS响应型L-Arg水凝胶[18]、脂质体NO系统[19]和Janus双层水凝胶[20]，这些系统显示出良好的抗菌和伤口愈合效果。但它们通常依赖于单一载体设计或外部触发机制，缺乏精确控制的顺序释放行为[18]。
脂质体（Lip）是由亲水核心和磷脂双层组成的纳米结构，因其良好的生物相容性、可降解性和低免疫原性而被广泛用于药物递送研究[21,22]。它们的脂质结构与皮肤角质层的脂质高度兼容，这使得它们在经皮药物递送中具有明显优势。先前的研究表明，将NO封装在脂质体内可显著提高其稳定性并延长释放时间，从而增强局部生物效应[23]。然而，在DFU等复杂开放性伤口环境中，由于常常伴有过度渗出，单独使用脂质体往往无法实现有效的局部保留，其物理化学稳定性易受环境因素影响，从而限制了治疗效果[24]。
将脂质体固定在水凝胶基质中构建脂质体基水凝胶系统是一种有效方法，可以同时提高局部保留和递送稳定性[25,26]。基于这一概念，我们假设动态调节NO的释放剂量和动力学，以阶段匹配的方式同时应对细菌感染、炎症失调和血管生成障碍，从而促进从感染控制到组织修复的快速转变。为了验证这一假设，我们设计了一种与疾病进展相匹配的顺序NO释放策略，并据此构建了一种基于火箭两阶段推进机制的水凝胶系统（图1）。在该系统中，负载NO的聚乙烯亚胺（PEI-NO）与氧化透明质酸（OHA）快速交联形成水凝胶基质[27]，在疾病早期提供短期高流量的NO释放，以快速抑制细菌和减少炎症。同时，S-亚硝酸化胆固醇修饰的脂质体（Lip-SNO）嵌入水凝胶网络中，在后期实现长期低流量的NO释放，持续调节伤口免疫微环境，促进巨噬细胞向M2表型极化，并通过血管内皮生长因子（VEGF）促进血管生成，从而促进组织重塑和伤口修复。通过协调调节NO的释放顺序和动力学行为，该系统有望在整个DFU病程中实现阶段匹配的干预，加速伤口愈合。
章节摘录
材料
透明质酸（Mw = 800 kDa）、聚乙烯亚胺（Mw = 600 Da）、氯甲酸胆固醇（Cho-Cl）、叔丁基亚硝酸盐和甲醇钠购自上海阿拉丁生化科技有限公司。胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）和甘露醇盐琼脂（MSA）购自广东焕凯生物科技有限公司。Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶购自Gibco Life Technologies。一氧化氮检测套件和Cell
Gel-NO/Lip-SNO的制备与表征及NO释放性能评估
本研究首先采用高载量的聚乙烯亚胺（PEI）作为主要载体实现快速NO释放（PEI-NO）。随后合成了具有持续释放特性的S-亚硝基化硫醇修饰脂质体（Lip-SNO）作为次要NO释放单元。利用PEI与醛修饰透明质酸（OHA）之间的快速交联反应，构建了一种能够顺序释放NO的水凝胶系统
结论
本研究成功构建了一种基于两阶段推进策略的NO顺序释放水凝胶系统（Gel-NO/Lip-SNO），并在感染性DFU中验证了其治疗效果。该系统通过PEI-NO与OHA的快速交联形成水凝胶基质，在伤口早期实现短期高流量的NO释放。同时，经过S-亚硝酸化胆固醇修饰的NO脂质体（Lip-SNO）
作者贡献
T.C.、D.X.和Y.W.对本工作的贡献均等。G.J.、G.L.和D.M.设计了研究方案。G.L.和D.X.撰写了手稿。T.C.、Y.W.和D.X.进行了实验并收集数据。D.X.和P.J.参与了补充实验并在修订阶段修改了手稿。Y.X.、J.Y.、R.C.、M.W.、J.S.、B.R.和Z.F.协助进行了部分测量工作。T.C.和G.J.提供了研究资金。所有作者均同意最终的稿件版本。
利益声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
CRediT作者贡献声明
陈拓：研究指导、方法学设计、资金获取、概念构思。谢东娜：原始稿撰写、实验设计、数据管理。王跃：原始稿撰写、方法学设计、数据管理。徐玉佳：实验设计。焦平平：实验设计。闫 jap an：实验设计。陈荣谦：实验设计。王萌：实验设计。尚景杰：方法学设计。冉炳宇：方法学设计。冯志静：方法学设计。马东：研究指导、资源提供、概念构思。李国伟：
