基于低温保存技术的欧洲梨（Pyrus communis）种质资源长期保护策略

《International Journal of Fruit Science》：Cryopreservation-Based Strategy for the Long-Term Conservation of European Pear (Pyrus communis) Germplasm

　　摘要：由于解冻后再生率低和强烈的基因型依赖性，低温保存在普通梨（Pyrus communis）种质资源中的应用受到限制。本研究旨在建立一个标准化的低温保存平台，包括解冻后再生、体外生根和温室驯化流程，适用于具有遗传多样性的欧洲梨品种。我们在11个具有不同遗传背景的普通梨品种上实施了优化的低温保存和体外生根方案。所有品种的再生率均超过了联合国粮食及农业组织/国际植物遗传资源研究所（FAO/IPGRI）规定的最低活力阈值40%，平均再生率为75.4%。除了一个品种（53.3%）外，大多数品种的体外生根效率都很高（≥79.2%）。通过简单序列重复区间（ISSR）和扩增片段长度多态性（AFLP）标记物评估了遗传稳定性，未发现低温保存和非低温保存植株之间存在可检测的多态性。在温室条件下的表型评估确认了植株的整体形态一致性，仅在早期生长阶段观察到轻微变异。这种低温保存策略为普通梨种质的长期保存和恢复提供了一种可靠且可重复的方法，同时保留了遗传完整性，并为未来的大规模繁殖和分发提供了依据，以支持育种和商业化栽培。

关键词：滴状玻璃化；遗传保真度；形态特征；再生；生根

引言：梨（Pyrus spp.）属于蔷薇科（Rosaceae），这是最重要的植物科之一，全球约有100个属和3000多种物种。该科的成员包括主要的水果作物，如梨（Pyrus）、苹果（Malus）和桃（Prunus），在温带地区广泛种植，因其营养价值和经济价值而受到重视（Potter等人，2007年；Sevindik等人，2020年）。梨属包含多个物种，大致分为欧洲组和亚洲组。普通梨（Pyrus communis）主要分布于西方国家，而日本梨（Pyrus pyrifolia (Burm.f.) Nakai）、Bretschneider梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）和乌苏里梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）则主要分布在东亚地区，包括韩国、中国和日本（Bell，1990年；Li等人，2022年）。梨种质通常通过无性繁殖并在野外基因库中保存（Yi等人，2017年）。然而，这些 kolections 易受到生物和非生物胁迫（特别是火疫病和气候相关事件）导致的遗传侵蚀。火疫病由Erwinia amylovora引起，是一种对梨和苹果（Malus domestica）具有破坏性的细菌性疾病，已从北美传播到欧洲、非洲、大洋洲和亚洲，包括韩国（Park等人，2016年；Pedroncelli和Puopolo，2024年；Van der Zwet等人，2012年）。尽管采取了检疫、抗病品种育种、化学治疗和移除受感染树木等控制措施，该病仍可导致果园迅速毁坏和重大经济损失（Zhao等人，2019年）。体外保存是田间储存的替代方案，但受到微生物污染、体细胞变异和劳动密集型维护的制约（Chen等人，2011年；Towill，1988年）。相比之下，使用体外衍生组织在液氮（-196°C）中进行长期保存的低温保存被认为是保护无性繁殖种质最可靠和最具成本效益的方法之一（Ahuja，2011年）。已经有许多方法应用于梨属物种，包括两步冷冻（Chang和Reed，2000年，2001年）、玻璃化（Tahtamouni和Shibli，1999年）、包封脱水（Hao等人，2005年；Yi等人，2017年）和滴状玻璃化（Guyader等人，2019年）。然而，与其他水果作物不同，由于再生率不稳定和基因型特异性反应，适用于广泛基因型的标准化方案仍不完善（Hofer和Flachowsky，2023年）。低温保存后梨再生过程中的一个主要瓶颈是体外生根诱导，这直接影响驯化成功率（Freire等人，2002年；Yi等人，2015年）。尽管已经测试了植物生长调节剂和添加剂的组合，如吲哚-3-丁酸（IBA）、1-萘乙酸（NAA）、6-苄基氨基嘌呤（BAP）和活性炭，但生根仍依赖于基因型，往往效果不佳（Amghar等人，2021年；Karimpour等人，2013年；Thakur等人，2008年）。因此，优化生根方案对于在田间大规模应用低温保存的植株至关重要（Gitta等人，2019年；Gonzalez等人，1991年）。评估再生植株的遗传稳定性同样重要，以确保低温保存能够保持真实的遗传特征。通常使用表型和分子分析方法，ISSR和AFLP标记物在梨属中广泛用于检测潜在的体细胞变异（Bao等人，2008年；Harding，2004年；Sevindik等人，2023年）。在之前的研究中，我们开发了一种优化的滴状玻璃化方案和高效的生根方法（Song等人，2023年，2024年）。在这里，我们将这些方法应用于11个具有遗传多样性的普通梨品种，评估其低温保存后的再生情况、温室驯化以及遗传和表型稳定性。我们的研究结果表明，低温保存结合高效生根技术为梨种质的长期安全保存提供了一种稳健且互补的方法。

材料与方法：
**植物材料与体外繁殖**：从韩国农村发展管理局（RDA）国家园艺与草药科学研究所（NIHHS）的果树研究部门获得了11个具有遗传多样性的普通梨品种（表1）。根据Yi等人（2015年）和Song等人（2022年）的方案，在Murashige和Skoog（MS）基础培养基（Murashige和Skoog，1962年；Duchefa Biochemie，荷兰哈勒姆）中添加2.0 mg L?1 N6-苄基腺嘌呤（BA；Duchefa Biochemie）、0.2 mg L?1 吲哚-3-丁酸（IBA；Duchefa Biochemie）和30 g L?1 蔗糖（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）的基础上进行体外培养。培养条件为24 ± 1°C的光照/8小时黑暗周期，光照强度为40 μmol m?2 s?1，使用冷白荧光灯，并保持高湿度（>80%）。从6周大的培养物中剪取健康的枝条（1–2 cm），在4°C下冷处理7天。随后，使用冷硬化枝条的顶端约2 mm的部分进行低温保存，而顶端约1.5 cm的部分用于生根诱导。

**低温保存**：低温保存采用Song等人（2023年）描述的滴状玻璃化方法，并进行了少量修改。从在4°C下黑暗条件下保存7天的冷硬化枝条中剪取顶端约2 mm的部分，在含有0.3 M蔗糖的MS培养基中预培养31小时，然后在含有0.7 M蔗糖的培养基中培养17小时，温度为25°C。接下来，将外植体用装载液[35%（v/v）植物玻璃化溶液3（PVS3），即17.5%甘油 + 17.5%蔗糖的液态MS]在室温（约23°C）下处理40分钟，然后在全浓度PVS3 [50%（v/v）甘油 + 50%（v/v）蔗糖]中脱水90分钟。脱水后，将外植体转移到含有0.8 M蔗糖的液态MS培养基中培养40分钟。为了恢复，将外植体转移到后培养基（PCM；含有30 g L?1蔗糖、1.0 mg L?1 BA和0.1 mg L?1 赤霉素GA3的MS）中，并每2周继代培养一次。

**体外生根诱导**：生根诱导按照Song等人（2022年，2024年）的描述进行，并进行了修改。首先在R0-IN培养基[半浓度MS，添加1 mg L?1 IBA、1 mg L?1 NAA和20 g L?1 蔗糖]中培养顶端约1.5 cm的枝条，直到在基部形成愈伤组织。然后将枝条转移至R1培养基（半浓度MS，含有30 g L?1 蔗糖，不添加植物生长调节剂）中，并在16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养。

**形态特征**：生根诱导后，所有处理组的幼苗（新鲜的体外生长对照组、冷冻前的LNC和冷冻后的LN）用流动自来水冲洗以去除残留培养基，然后转移到温室中。幼苗最初种植在32孔托盘（55 mm × 55 mm × 55 mm；Baroker，韩国首尔Bio）中，托盘内装有商用泥炭基盆栽土，并用透明聚乙烯薄膜覆盖以在黑暗条件下保持>80%的相对湿度5天。之后移除薄膜，幼苗在自然光照下生长，每天使用冷白荧光灯（40 μmol m?2 s?1）照明12小时。当植株表现出旺盛的生长时，将它们移植到Wagner盆（顶部直径256 mm × 底部直径234 mm × 高度297 mm）中，盆内同样使用盆栽土。驯化大约3-5个月后，记录形态特征，包括植株高度、根长、叶长、叶宽、叶形以及鲜重和干重（表2；图5，6）。使用PAST（Paleontological statistics）软件（版本4.17，奥斯陆大学）基于这些数据进行了主成分分析（PCA）。

**遗传保真度评估**：使用简单序列重复区间（ISSR）和扩增片段长度多态性（AFLP）标记物评估遗传保真度。从三个品种中选取新鲜的、冷冻前的LNC和冷冻后的LN幼苗进行分子分析。

**DNA提取**：从每个品种的三个随机选择的幼苗中收集年轻、完全展开的叶子。根据制造商说明，使用GenEx? Plant Kit（GeneAll Biotechnology Co., Ltd., 首尔，韩国）提取基因组DNA。使用Quant-iT? PicoGreen? dsDNA Assay Kit（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和荧光微孔板读取器（Synergy，BioTek Instruments，美国佛蒙特州Winooski）测量DNA量。

**ISSR分析**：根据之前的研究（Khorshidi等人，2017年；Sevindik等人，2023年）选择了15个ISSR引物（表3）。PCR扩增在含有1.5 ng模板DNA、0.2 μM引物和2× HS Prime Taq Premix（GeNet Bio，韩国大田）的20 μL反应混合物中进行。热循环条件如下：初始变性94°C 5分钟；35个循环，每个循环94°C 45秒、47–53°C 45秒、72°C 1分钟；最后延伸72°C 10分钟。PCR产物在1.2%（w/v）琼脂糖凝胶中分离，用溴化乙锭染色，并使用Gel Image Analysis System（BIO-PRINT，法国Vilber Lourmat）进行可视化。扩增条带在每个处理的三个重复实验中评分为存在（1）或不存在（0）。

**AFLP分析**：使用Bao等人（2008年）的方案和少量修改，采用六组引物组合（表4）进行AFLP分析。基因组DNA（15 ng）用EcoRI和MseI（New England Biolabs，美国马萨诸塞州Ipswich）消化，并在22°C下与相应的接头连接2小时。接头连接的DNA使用AMPure XP beads（Beckman Coulter，美国加利福尼亚州Brea）纯化，作为选择性扩增的模板。选择性扩增的PCR条件如下：95°C 3分钟；35个循环，每个循环95°C 30秒、56°C 30秒和72°C 30秒，最后延伸72°C 5分钟。片段分离使用Agilent Fragment Analyzer System（Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）和DNF-905–55-DNA-500 bp试剂盒，在以下条件下进行：预运行9.0 kV 30秒和分离运行9.0 kV 85分钟。数据使用Agilent ProSize Data Analysis Software v5.0.1.6进行分析。AFLP条带的评分标准为存在（1）或不存在（0），仅包括清晰、明显的单态或多态条带；模糊或不确定的条带被排除。

**聚类分析**：使用MEGA v11（Tamura等人，2021年）生成UPGMA（未加权对组方法与算术平均数）树状图，以可视化处理之间的遗传关系。进化距离使用最大复合似然法计算。进行了1000次重复的自助法（Felsenstein，1985年）分析，并在分支旁边显示相关分类单元聚集的重复树的比例。

**统计分析**：使用SAS v7.1（SAS Institute Inc., 美国北卡罗来纳州Cary）进行单因素方差分析（ANOVA），计算新鲜、LNC和LN处理的平均再生率和生根率（表示为% ± 标准误差SE）以及形态特征值（平均值 ± 标准误差SE）。在“General Leclerc”（91.7%）、“OH×F18”（88.9%）和“Jumbo la France”（86.7%）中也观察到了较高的存活率，而“Anjou 4×”（56.7%）和“Bartlett M.R.”（56.7%）的存活率较低（表5）。所有样本的存活率都超过了基因库设定的40%的成功阈值（FAO/IPGRI，Citation1994；Panis等人，Citation2020），这表明滴状玻璃化方法在遗传多样性丰富的欧洲梨树种质资源中具有稳健性和广泛的适用性。图1展示了使用滴状玻璃化方法进行冷冻保存后植物的恢复情况（Song等人，Citation2023），实验使用了11个梨树品种的顶芽。在冷冻保存后4-6周内，观察到植株在恢复培养基上重新生长。顶部行包括标记为Bartlett、Jumbo、OH×F18、Beurre diel 3×和General的培养皿。底部行包括Bere-obtjabra、Abate Fetel、Anjou 4×、Conference、OH×F230和Bartlett M.R.每个培养皿中都排列着小植株。标记为General的培养皿中有一部分被遮挡。这些植株在受控环境中明显正在生长，可能是用于研究或恢复目的。请查看该图的详细描述。

表5显示了八个Pyrus communis样本在冷冻保存后根系诱导的情况。根据Song等人（Citation2024）优化的方案，对八个Pyrus communis样本的再生长幼苗进行了根系诱导评估。所有测试样本均成功形成了根系（表6），根系诱导率从53.3%（“Beurre Diel 3×”）到100%（“Anjou 4×”和“Bartlett M.R.”）不等。总体平均根系诱导率为87.7%。“Jumbo la France”（96.7%）和“General Leclerc”（92.8%）也表现出较高的根系诱导性能，而“Beurre Diel 3×”的根系诱导率最低（53.3%）。根系在10-25天内出现，所有样本在一个月内完成了不定根的形成。快速根系诱导产生了形态健康的根系（白色、不褪色且不腐烂；图2），这有助于植株成功适应新环境。这些结果表明所采用的根系诱导方法最小化了基因型依赖性，从而实现了大规模的一致性繁殖，并在种质资源丢失时便于恢复工作。

图2展示了八种不同梨树基因型的体外根系诱导结果。这些幼苗在初始根系诱导培养基（R0-IN）中在黑暗条件下培养指定的天数后，被转移到光照条件下的培养基（R1）中。

表6显示了基于15个ISSR标记和6个AFLP引物组合的三个Pyrus communis基因型的多态性。

遗传稳定性通过ISSR和AFLP标记在三个Pyrus communis样本（“Bartlett”、“Jumbo la France”和“OH×F18”）中进行了评估。ISSR分析使用15个引物产生了200条清晰且可重复的条带（0.4-1.5 kb），平均每个引物产生13条条带。多态性条带数量从1条（UBC-811）到9条（UBC-831、-855、-834）不等，平均每个引物产生6条条带，对应的多态性率为11.1-75%（平均：45.6%）（表7）。图3A和图3B分别展示了由引物UBC-831和UBC-830生成的代表性ISSR条带模式。AFLP分析使用六个引物组合产生了37个可评分的片段（100-500 bp），其中10条为多态性条带。EcoRI-AAC/MseI-CAA组合的多态性最高，EcoRI-AAG/MseI-CAT组合的多态性最低。使用E-AAG/M-CAT引物组合为“Bartlett”（图3C）、“Jumbo la France”（图3D）和“OH×F18”（图3E）生成的代表性AFLP谱型分别展示。新鲜、长期储存（LNC）和冷冻保存（ln）样本之间未检测到多态性条带模式或峰值的差异（表8；图3）。基于ISSR（图4A）和AFLP数据（图4B）的UPGMA聚类将每个样本分为不同的簇，每个样本内的各处理间遗传相似度为100%，证实了冷冻保存未引起遗传变异。

图4展示了三种欧洲梨树（Pyrus communis）基因型的体外根系诱导结果。图中展示了成功进行体外根系诱导的幼苗的根系。这些基因型包括‘Bartlett’、‘Jumbo la France’、‘OH×F18’、‘Beurre Diel 3×’、‘General Leclerc’、‘Anjou 4×’和‘Bartlett M.R.’。形成的根系为白色、健康且无褪色现象，表明诱导和发育成功。这些图像显示了不同基因型间根系诱导的一致性。

表7基于15个ISSR标记和六个AFLP引物组合的三个Pyrus communis基因型的多态性。

讨论部分指出，由于解冻后再生和根系诱导的效率有限，以及强烈的基因型依赖性，冷冻保存在梨树遗传资源中的应用至今并不广泛（Gitta等人，Citation2019；Hofer和Flachowsky，Citation2023；Karimpour等人，Citation2013）。本研究证实了一个集成平台在梨树种质冷冻保存中的成功应用。这种方法有效地应用于11个基因多样化的欧洲梨品种，这些品种具有抗火疫病或敏感、与榅桲兼容、砧木活力以及传统价值等特征（NCGR，Citation2016），这些特征对于育种和保护工作非常重要（Folimonova等人，Citation2009；Ploetz，Citation2006）。所有品种的恢复率均超过了FAO/IPGRI（Citation1994）规定的最低阈值40%，证实了该方法在基因多样化的欧洲梨种质资源中的广泛适用性。这些结果与之前关于Pyrus属植物（Song等人，Citation2023；Yi等人，Citation2017）以及其他木本多年生植物（如Malus（Li等人，Citation2015）、Prunus（Vujovi?等人，Citation2015）和Citrus（Volk等人，Citation2016）的研究结果一致，滴液玻璃化处理在这些研究中被证明可以有效保持植物的存活能力和再生能力。不同品种之间的恢复率存在差异，这通常是冷冻保存研究中观察到的现象（De Boucaud等人，Citation2002；Vujovi?等人，Citation2015）。在我们的研究中，“Abate Fetel”的冷冻后恢复率最低（50%），而“Bartlett”的恢复率超过了90%。这种差异可能是由于不同品种之间的组织生理、耐寒性反应和膜成分的差异所致（Chang和Reed，Citation2000；Ru?i?等人，Citation2013, Citation2014）。生根是梨树再生过程中的另一个关键瓶颈（Reed，Citation1995；Thakur等人，Citation2008）。在本研究中，体外生根阶段的成功率在所有品种中均较高，表明我们的两步生根协议有效减少了基因型依赖的变异性。快速而均匀的根系形成对于提高适应效率、促进冷冻保存材料的恢复以及在大规模育种和保护计划中的应用至关重要。

遗传稳定性是种质资源保护中的一个重要因素，因为在体外培养、冷冻保护或恢复过程中可能会产生体细胞变异（Harding，Citation2004）。本研究的ISSR和AFLP分析显示，每个品种的Fresh、LNC和LN植株之间没有检测到多态性。UPGMA聚类分析证实了100%的遗传相似性，支持冷冻保存协议保持了基因组的完整性。这些结果与其他物种的研究结果一致（Bhatia等人，Citation2011；Liu和Yang，Citation2012；Zarghami等人，Citation2008），这些研究表明，在采用优化协议和限制继代培养时间的情况下，遗传变异很小或不存在（Condello等人，Citation2009）。同样，在之前的Pyrus属植物研究中，RAPD和SSR分析也未能在冷冻保存的植株与其相应供体植株之间检测到遗传差异，进一步支持了基于冷冻保存的保护策略的遗传保真性（Condello等人，Citation2009）。形态学评估表明，冷冻保存对植株在温室适应期的表型影响很小。PCA分析显示，每个品种内的Fresh、LNC和LN植株聚类紧密，表明各处理之间的整体形态变异很小。LN植株与Fresh或LNC植株之间没有明显的分离，进一步表明冷冻保存过程没有引起特定处理下的表型变化。在一些品种中检测到特定性状的显著差异（例如，“Abate Fetel”的根长和“Anjou 4×”的株高），但这些变化程度有限，且不表示广泛的形态变异。考虑到本评估是在体外生根苗适应后81-153天进行的，这些差异更可能是与根系建立和适应相关的暂时性生长变化，而不是基因型之间的永久性差异。在其他物种中也报告了类似的观察结果，即在早期阶段观察到的表型差异在后续世代中消失了（Bae等人，Citation2022）。因此，需要在温室和田间条件下进行长期评估以确认表型的稳定性。

总体而言，我们的研究结果表明，所使用的滴液玻璃化协议是一种可靠且广泛适用的方法，可以有效地冷冻保存欧洲梨种质资源，同时保持高恢复率、遗传稳定性和表型一致性。通过减少基因型依赖的变异并确保冷冻后的植物质量，该方法为无法通过种子保存的梨品种提供了实用的保护手段。重要的是，该协议在基因多样化的品种中的适用性表明它可以被推广到更广泛的Pyrus物种及相关分类单元，包括对育种有价值的野生近缘种。将这种冷冻保存方法整合到国家和国际基因库计划中，将加强长期保护策略，减少对环境和生物威胁的脆弱性，并确保未来育种和研究的独特遗传资源的可用性。未来的工作应集中在验证该方法在操作基因库条件下的有效性，将其扩展到其他Pyrus种质资源，并在田间条件下对冷冻保存的植物进行长期的表型和农艺评估。此外，这一策略可以为大规模繁殖和分配提供基础，支持育种计划和商业化栽培。

数据可用性声明：本研究中的原始贡献包含在文章中。如有进一步咨询，请联系相应的作者。