综述：利用三色单分子荧光共振能量转移技术研究大分子动力学

《Current Opinion in Structural Biology》：Three-color single-molecule fluorescence resonance energy transfer to study macromolecular dynamics

　　贾高|博元|索拉夫·蒙达尔|拉吉布·巴萨克|李泰熙
美国宾夕法尼亚州立大学化学系，大学公园，16802 PA，美国

单分子荧光共振能量转移（smFRET）是探测大分子动态的强大工具。然而，双色smFRET仅提供一维距离信息，这限制了其在复杂系统中的应用。使用三种或更多荧光团的多色smFRET可以克服这一限制，尽管由于具有合适光谱特性的染料选择有限、标记多个荧光团的挑战以及数据解释的复杂性，三种荧光团通常是实际限制。在这里，我们综述了基于三色smFRET的大分子及其复合物动态的最新研究。在本综述中，三色smFRET指的是在FRET系统中使用三种荧光团，其中两种或所有三种荧光团在给定时间点都可能参与FRET。我们的目标是突出特别适合三色smFRET的结构生物学问题，并简要介绍设计和实施此类实验的优点和挑战。

**引言**
单分子荧光共振能量转移（smFRET）是探测蛋白质、DNA、RNA及其复合物动态的强大工具[1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]。特别是，smFRET提供了一种有效的方法，可以实时跟踪它们的结构和构象变化，时间分辨率和持续时间主要由荧光团的亮度和光稳定性决定[11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]。由于荧光团性能的提高，使用smFRET在亚毫秒（sub-ms）范围内探测结构动态变得容易实现[16, 20, 21, 22]。利用一个能量供体和受体对的双色smFRET方法本质上只能进行一维测量，生成关于两个荧光团之间距离变化的信息。通常需要探测多个距离及其变化，因为多个分子之间的协调构象变化和/或结合动态是许多重要生物过程的基础。为了克服这一限制，人们努力通过使用超过两种荧光团来扩展smFRET测量的维度[23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36?, 37?, 38?, 39?, 40?, 41?, 42, 43?]。大多数研究使用三种荧光团，提供二维或三维测量，即三种荧光团之间两个或三个距离的变化。三种荧光团通常是实际限制，主要是由于具有合适光谱特性的荧光团选择有限、解释多色数据的挑战，以及用超过三种荧光团标记生物系统的困难。在本综述中，三色smFRET指的是在FRET系统中使用三种荧光团，其中两种或所有三种荧光团在给定时间点参与能量转移。

**实施三色smFRET的挑战**
实施三色smFRET主要面临两个方面挑战。首先是分别监测和分析三种荧光团的信号通常非常复杂，因为存在光谱重叠和通道间泄漏[图1a(1)[12,23,25]。已经采用了各种方法来解决这个问题。一种方法是使用一种或多种置换过的荧光团对进行控制测量，在用三色smFRET探测它们的插入动态之前，先识别和表征这些荧光团的结构[4,12,23,25]。另一种方法是使用一组光谱重叠和相对位置不会引起此类问题的荧光团[图1a(2)和(3)[40,44]。第二个挑战是用三种荧光团标记大分子或复合物通常很复杂。已经报道了多种三荧光团标记策略[43,45,46]。一旦克服了这些挑战，就可以从三色smFRET测量中获得丰富的信息。在这里，我们回顾了利用三色smFRET解决大分子及其复合物动态各种类型问题的最新研究，并讨论了这些努力中如何应对上述挑战。

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**图1. 不同类型三色smFRET设置的优势和局限性总结。**
(a) 主要有三种不同的三色FRET网络，使用市面上可获得的荧光团实现。第一种是所有三种荧光团（供体：绿色；受体#1：红色；受体#2：棕色）参与与一种或多种荧光团的能量转移。第二种是从供体通过受体#1到受体#2的级联传递，而供体和受体#2之间没有直接传递。第三种是一次只有一对FRET（供体到受体#1或供体到受体#2）。每种类型的主要优势和局限性分别列出。
(b) 主要有两种样品监测方案。第一种是表面固定化，允许宽场激发（例如，激发光的全内反射）或共聚焦激发/检测。第二种是使用聚焦的激发光束来空间分辨自由扩散的单个分子。每种类型的主要优势和局限性分别列出。

**探测多组分系统中的实时结合动态**
smFRET最强大的应用之一是以时间分辨的方式监测实时动态。使用三种荧光团扩大测量维度可以监测多个大分子之间的复杂结合动态。一个最近的例子是研究GAGA转录因子（GAF）在包含两个结合位点的DNA片段上的结合动态[41]。通过用两种不同的FRET受体差异性标记这两个靶点并监测三色smFRET信号，作者发现了GAF的靶点搜索机制，这些机制可以通过1D或3D扩散实现。在该系统中，两个靶点彼此相距较远，简化了FRET网络和数据解释[图1a(3)]。
另一个例子是监测翻译起始过程中核糖体复合物的组装[38]。在这项研究中，三个翻译起始组分被荧光标记以构建三色smFRET系统并监测它们的组装动力学。监测三种荧光团的强度有助于确定三个组分相互结合并组装成起始复合物的时间点。作者发现了新的组装动力学，这与之前接受的翻译起始机制不符。这些例子强烈支持三色smFRET测量在探测复杂大分子系统中多个组分的实时结合动态方面的能力。

**发现多组分系统中的未知中间体**
许多使用smFRET的研究报告了在构象变化或结合事件期间之前未知的结构或中间体[28,29,33,35,37,43,47]。一篇最近的论文报道了在蛋白质复合物可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）解体过程中一个之前未知的过渡状态，SNARE是真核生物中囊泡融合所需的最小蛋白质复合物[40]。为了追踪SNARE的解体动态（这对SNARE蛋白的回收很重要），作者采用了交替激光激发的双色和三色smFRET测量（ALEX）[24]。ALEX方案利用FRET供体和受体的交替激发，同时监测FRET效率和FRET受体的光漂白情况（即是否光漂白）。这种方案特别有助于区分解离事件（即由于FRET低或无FRET导致受体灭活）和受体光漂白。使用ALEX的双色smFRET，他们验证了SNARE复合物的形成及其结构状态。对于三色smFRET，他们使用了Cy3、Cy5和Cy7荧光团。这套荧光团简化了解释，因为Cy3-Cy7对不发生显著的FRET[图1A(2)]。时间和空间分辨的双色和三色smFRET测量使得发现一个之前未知的中间体成为可能。三色smFRET的结果通常会用双色测量来确认。

**同时监测结合和构象动态**
使用多种颜色可以同时监测构象变化和结合动态。大分子复合物的功能通常在另一个分子结合时被激活，这可能导致同时发生的结构转变。一个这样的例子是最近关于mRNA折叠的研究，其中tRNA起到了辅助作用[37]。为了同时监测T-box核开关的构象变化和tRNA的结合动态，作者使用了双色和三色smFRET测量。在双色smFRET测量中，FRET荧光团被内置于核开关中，以跟踪其在tRNA存在和不存在时的构象转变。引入第三种荧光团进行三色smFRET，使系统能够同时报告核开关的构象动态和tRNA的结合动态。根据测量结果，提出了一个六态动力学模型，说明tRNA的结合如何加速核开关的有效折叠途径。这项研究强调了三色smFRET在同时跟踪多组分大分子系统中构象变化和结合动态方面的能力。

**探测多组分系统的组成异质性**
多色smFRET应用的一个相对较少探索的领域是探测大分子复合物组成异质性的动态变化。在最近的一项研究中，作者使用三色smFRET测量来追踪核小体颗粒中组蛋白组成的逐渐变化[36]。首先，一组核小体中的DNA用两种FRET荧光团标记，形成双色FRET系统。另一组核小体中的组蛋白H2A-H2B用第三种荧光团标记。当这两组核小体之间的H2A-H2B交换时，会形成一个三向FRET网络，产生一组独特的三种荧光团强度。这个实验系统首次观察到核小体之间自发进行的H2A-H2B交换，这长期以来一直被假设但未直接监测。这项研究表明，通过用三种不同的荧光团标记组分，可以同时监测大分子复合物的组成变化及其结构状态。

**解释具有光谱重叠的三色smFRET数据**
可以根据三种荧光团如何形成FRET网络来构建各种三色smFRET系统（图1a）。所有三种荧光团都参与FRET的系统可以提供三种荧光团之间所有三个距离的信息[图1a(1)]。然而，在这样的系统中，原则上无法仅从三个荧光信号中解析出这三个距离。换句话说，没有一组独特的三个距离是给定三个荧光信号的解。为了解决这个问题，可以先使用两种荧光团的置换进行双色smFRET测量，以确定系统的构象状态，然后再扩展到三种颜色[23,30,37,39,40]。另一种方法是使用更简单的FRET网络。例如，构建一个从供体到第一个受体，然后从第一个受体到第二个受体的级联FRET网络，供体和第二个受体之间没有或几乎没有直接FRET[图1a(2)][40]。这样的系统通常是通过空间分隔供体和第二个受体来构建的。在级联FRET系统中，供体激发下的荧光信号只提供两个距离的信息。另一种避免复杂的三向FRET网络的方法是将三种荧光团分成两个独立的供体-受体对，如前所述[图1a(3)][41]。尽管这些方法没有完全利用三色系统的所有三个维度，但它们提供了研究用双色FRET难以研究的复杂动态的强大手段。

**使用自由扩散分子的三色smFRET**
上述大多数报道使用的都是表面固定的分子，可以长时间实时追踪其动态[图1b]。这种方法需要一种将分子固定在表面上的方法。在某些情况下，主要目的是获得构象或结合状态的相对丰度，而不是实时直接监测多个状态之间的动态变化，因此可能不需要长时间跟踪单个分子。在这种情况下，一次监测一个自由扩散的分子集合就足够了，这样就无需对目标分子进行表面固定。显而易见的缺点是，这种方法追踪多步骤/状态的变化效率非常低。一篇最近的论文使用这种策略检测了一种大型不连续双结构域蛋白质中的折叠中间体[39]。在这项研究中，作者采用了双色和三色 smFRET 方法来研究麦芽糖结合蛋白（MBP）的折叠路径。他们利用多参数荧光检测和脉冲交错激发（MFD-PIE）技术，监测了经过双色和三色 FRET 标记的 MBP 的展开和重折叠动态 [48]。同时检测荧光寿命、强度和偏振度可以提供关于标记分子结构以及荧光团周围环境的信息。脉冲交错激发技术与 ALEX 技术类似，但使用更长的激光脉冲来实现荧光寿命的测量，这种技术能够有效地探测 FRET 受体的光敏性（即是否发生光漂白），同时还能测量荧光寿命和 FRET 效率。通过 MFD-PIE 技术进行双色和三色 smFRET 分析，作者确定了 MBP 折叠路径中的各种构象状态，并据此确定了折叠过程的顺序。虽然这种实验设置无法实时追踪构象变化，但三色设置和相关性分析使得能够在不同浓度的展开试剂作用下，对扩散分子群体中的多种状态进行渐进变化进行追踪。这项研究展示了一种无需分子表面固定的 smFRET 系统，即可以通过某种方法或试剂将分子引导或同步到特定状态。

构建三色 smFRET 系统的标记方案
用三种荧光团标记大分子系统通常是一个挑战。对于由 DNA、RNA 和蛋白质等组成的系统，可以分别采用不同的策略对各个组分进行标记。DNA 和 RNA 可以通过荧光标记，或者利用能够与荧光团化学偶联的功能基团进行标记（例如，将 DNA 或 RNA 上的胺基团与 NHS-酯活化的荧光团偶联）。一种常见的蛋白质标记方法是利用半胱氨酸残基与马来酰亚胺活化荧光团之间的硫醇-马来酰亚胺偶联 [46]。另一种常用方法是引入含有荧光配体的蛋白质标签（如 SNAP-tag? 和 HaloTag?）[49]。还有一些更为复杂的标记方法，例如利用蛋白内含子介导的标记或通过非天然氨基酸插入或肽序列插入进行标记（如 ybbR 标签）[50, 51, 52]。为了开发一种更具普适性的标记方法，最近的研究结合了基因编码扩展、两种不同的点击化学技术和蛋白质标签融合 [43]。在这项研究中，作者利用两个终止密码子，通过两种正交化学方法标记了两种不同的荧光团。第三种荧光团是通过 SNAP-tag? 和荧光配体引入的。所研究的大分子复合物是人类代谢型谷氨酸受体 2（mGlu2），这是一种二聚体多结构域 G 蛋白偶联的神经受体。通过对 mGlu2 进行三色荧光标记，研究人员发现了其从开放态到闭合态转化过程中一个先前未知的中间状态。这项研究表明，一个用三种荧光团标记的蛋白质可以通过三色 smFRET 技术进行监控，从而揭示其复杂的结构动态。

总结
单分子 FRET 被广泛认为是探测大分子及其复合物动态的强大工具。它能够提供关于亚群及其动态的信息，而这些信息通过群体测量方法很难获得。在 smFRET 系统中再增加一个荧光团可以获得更丰富的信息，这是双色 smFRET 无法实现的。本文回顾的最新研究为研究人员指出了构建三色 smFRET 系统、实施测量以及解释数据所面临的局限性和挑战。三色单分子 FRET 正从一种技术要求较高的专业方法，发展成为一种强大的通用工具，可用于解析大分子系统中的多维构象动态和相关相互作用。尽管在标记和分析方面仍存在一些挑战，但不断的进展正在迅速扩大其应用范围和影响力。