DCLK3作为一种潜在肌少症生物标志物的鉴定与初步实验评估：一种多组学与机器学习方法 间隔符

《Immunobiology》：Identification and initial experimental assessment of DCLK3 as a potential sarcopenia biomarker: A multi-omics and machine learning approach

　　

摘要 肌少症是一种与年龄相关的疾病，具有高患病率和显著的临床后果，这凸显了对及时诊断和预测策略的需求。在本研究中，研究人员应用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA）来检测与肌少症相关的基因模块，随后使用机器学习进行预测建模。该方法旨在识别可靠的生物标志物，以支持早期检测和个体化治疗策略。研究人员整合了来自GEO数据库的三个肌少症相关基因表达数据集。对差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）进行了功能富集分析，以解释其参与疾病机制的情况。通过WGCNA和机器学习算法识别了关键模块和枢纽基因。通过RT-qPCR在肌少症样本中确认了候选基因的表达模式。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）帮助揭示了与DCLK3表达相关的信号通路。采用单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-Seq）来评估疾病进展过程中的转录异质性和细胞间通讯网络。分析结果揭示了472个DEGs和来自WGCNA的1325个高度相关基因。在24个重叠基因中，三种机器学习方法——LASSO、随机森林和SVM-RFE——均聚焦于DCLK3作为一个核心生物标志物。RT-qPCR证实了DCLK3在肌少症中存在显著失调。snRNA-Seq和通讯分析进一步显示DCLK3在周细胞中表达富集，其中PDGF信号通路是介导其与其他细胞串扰的主要途径。这些结果将DCLK3定位为一个引人注目的诊断标志物和治疗靶点，为肌少症的发病机制提供了新的见解。 间隔符

研究背景、问题与目的

肌少症是一种与年龄相关的退行性疾病，以进行性骨骼肌质量和功能丧失为特征，被认为是全球老龄化背景下的重大公共卫生挑战。根据亚洲肌少症工作组2019年的标准，其在60-70岁成人中的患病率范围为5%-13%，在80岁以上人群中超过50%。肌少症导致肌肉力量下降、身体功能受损以及跌倒和骨折风险升高，严重影响生活质量并加剧全球医疗负担。其机制涉及线粒体功能障碍、蛋白质合成/降解失调、自噬受损和卫星细胞失活等。尽管自2016年起已被归类为独立的疾病实体，但由于缺乏普遍接受的诊断金标准，早期社区筛查和预防受到阻碍。当前评估方式（如双能X射线吸收测定法、生物电阻抗分析等）在临床实施上缺乏共识，且成本、操作复杂性和患者依赖性构成挑战。开发用于早期诊断和精准干预的可及性分子生物标志物迫在眉睫。多组学技术的发展为揭示肌少症病理机制提供了新见解，利用加权基因共表达网络分析和机器学习等生物信息学方法进行生物标志物筛选，为精准医学提供了新策略。本研究的目的是通过整合差异表达分析、加权基因共表达网络分析和多种机器学习算法，识别与肌少症相关的枢纽基因和诊断生物标志物，为早期筛查、临床诊断和精准干预提供理论基础。

关键技术方法

本研究采用的计算分析方法主要基于公共数据库的基因表达数据。研究人员从GEO数据库获取了三个批量RNA-seq数据集（GSE111006、GSE111010、GSE111016），包含62名健康老年对照和33名肌少症患者的骨骼肌组织样本。通过sva包中的comBat_seq算法进行批次效应校正和归一化。差异表达基因使用edgeR包进行筛选（阈值：|log₂FC| > log₂(1.3) 且 p值 <0.05）。功能富集分析包括疾病本体论、基因本体论和KEGG通路分析。加权基因共表达网络使用WGCNA R包构建，软阈值功率设置为12。从DEGs与WGCNA蓝色模块高相关基因的交集中获得候选基因集，随后应用LASSO回归、支持向量机-递归特征消除和随机森林三种机器学习算法评估基因重要性，并通过交集确定枢纽基因。通过受试者工作特征曲线评估诊断性能。对枢纽基因进行单基因基因集富集分析。此外，分析了单核RNA测序数据集（GSE167186，包含5名年轻成人和8名老年人样本）以评估转录异质性和细胞通讯，使用Seurat进行数据处理和细胞分群注释，使用CellChat进行细胞间通讯分析。实验验证方面，收集了健康老年个体和接受髋部手术的肌少症患者的股外侧肌组织样本，通过RT-qPCR验证枢纽基因的表达水平。

研究结果

3.1. 差异表达基因的鉴定

研究人员对健康老年个体和肌少症患者的骨骼肌RNA测序数据进行差异表达分析，共鉴定出472个显著差异表达基因，其中包括368个上调基因和104个下调基因（筛选标准：|log₂FC| > log₂(1.3) 且 p值 <0.05）。火山图和热图显示了组间基因表达模式的显著差异。

3.2. 功能富集分析结果

对差异表达基因的功能富集分析显示，这些基因在疾病本体论中显著富集于266个疾病条目，包括先兆子痫、肠道疾病、心血管疾病和代谢性疾病等。基因本体论分析揭示了720个富集的生物过程、61个细胞组分和110个分子功能，关键生物过程包括细胞对视黄酸的反应、表皮发育、脂肪细胞分化和对创伤的反应。KEGG通路分析显示在18条信号通路中富集，其中突出的是Hippo信号通路、AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、钙信号通路和肌肉细胞骨架调节通路。

3.3. 加权基因共表达网络的构建

使用软阈值功率12构建加权基因共表达网络，满足无标度拓扑标准。通过动态树剪切将基因聚类成模块，最终得到24个共识模块。模块-表型相关性分析显示，蓝色模块与肌少症严重程度呈最强正相关（r = 0.36, P = 3 × 10^-4）。对该模块内的基因进行筛选，保留了1325个高相关基因。

3.4. 通过机器学习选择和验证诊断生物标志物

将差异表达基因与WGCNA蓝色模块的高相关基因取交集，得到24个候选基因。随后使用LASSO回归、SVM-RFE和随机森林模型评估这些基因的重要性。LASSO回归识别出7个基因，SVM-RFE选出14个基因，随机森林模型找出5个基因。三种方法结果的交集揭示了2个关键基因，表明它们作为肌少症生物标志物具有潜在的显著诊断价值。

3.5. qRT-PCR结果

在肌少症患者的骨骼肌中，鉴定出的特征基因的表达水平低于健康老年对照。受试者工作特征曲线分析表明，两个枢纽基因DCLK3和SNCB在训练集中表现出较高的诊断价值。具体而言，DCLK3的曲线下面积为0.791，SNCB的曲线下面积为0.721。RT-qPCR分析验证了DCLK3在肌少症患者中的相对转录水平与健康对照相比显著下调（p < 0.001）。而另一个关键基因SNCB由于高CT值未能检测到表达。

3.6. 单基因GSEA分析结果

以DCLK3的表达水平为变量进行单基因GSEA分析。结果显示，当DCLK3高表达时，显著富集的通路包括心肌收缩、昼夜节律和GnRH分泌，主要涉及肌肉功能调节和信号传导相关的生物学过程。相反，当DCLK3低表达时，显著富集的通路包括α-亚麻酸代谢、卵巢类固醇生成和视黄醇代谢，与代谢调节和免疫反应密切相关。

3.7. 单细胞核转录组数据中的表达水平

通过分析单核RNA测序数据，基于UMAP降维成功识别了十种主要细胞类型。统计分析显示，年轻组和老年组之间的细胞类型比例存在显著差异，老年组中肌肉卫星细胞、周细胞和血管平滑肌细胞的比例显著下降。DCLK3基因在不同细胞类型中的表达分析表明，其在周细胞中表达最高，同时在血管内皮细胞中也有较低水平的检测到。

3.8. 周细胞与其他细胞类型的通讯

使用CellChat软件包进行细胞通讯分析，重点关注周细胞在这些网络中的作用。结果表明，周细胞在细胞间通讯中扮演双重角色，既是信号的发送者也是接收者。它们向成纤维细胞和血管内皮细胞等多种细胞类型发出信号，同时也参与自分泌信号传导。配体-受体对分析揭示了特定的信号通路，周细胞与其他细胞类型之间的通讯主要由PDGFB-PDGFRB信号通路介导，其中周细胞既是关键的接收细胞也是发送细胞。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出肌少症的早期诊断和干预在人口老龄化背景下日益关键，但生物标志物研究仍处于起步阶段。本研究通过整合WGCNA和机器学习，识别了肌少症的生物标志物。差异表达分析和功能富集揭示了与肌少症机制相关的基因和通路，如PI3K-Akt、HIF-1和Hippo信号通路。WGCNA识别出与表型相关的蓝色模块，机器学习方法从中优先筛选出DCLK3，并通过受试者工作特征曲线和RT-qPCR验证了其诊断价值和表达下调。DCLK3作为一种双皮质素样激酶，可能通过调节增殖和分化影响肌肉修复，其表达下调可能损害肌肉修复过程。单基因GSEA将DCLK3低表达与肌肉、代谢和免疫通路联系起来。细胞通讯分析表明，周细胞作为微环境调节者，可能通过PDGFB-PDGFRB信号通路在细胞间串扰中发挥核心作用。研究人员提出了DCLK3-周细胞轴在肌肉再生中的潜在作用。本研究创新性地采用了多模态生物标志物发现策略，并揭示了周细胞介导的机制。然而，研究也存在一些局限性，包括缺乏大规模独立外部验证队列、RT-qPCR临床样本量较小、提出的DCLK3-周细胞-PDGF轴尚需功能研究验证，以及需要进一步的临床效用评估。

研究结论部分翻译如下：

在本研究中，研究人员采用加权基因共表达网络分析和机器学习技术，成功鉴定并初步验证了DCLK3作为肌少症的潜在生物标志物。通过进一步分析，研究人员发现DCLK3在肌少症患者中表达显著下调，提示其在骨骼肌组织修复和再生中的关键作用。受试者工作特征曲线分析表明，DCLK3在肌少症的早期诊断中显示出良好的诊断潜力，表明其在疾病诊断和监测中的潜在价值。综上所述，DCLK3有望成为肌少症的新型生物标志物，为早期诊断和干预提供了新的方向。未来的研究应进一步探讨其在肌少症中的潜在机制，并探索其在临床实践中的应用，最终为肌少症的精准治疗提供有力支持。