利用多维光谱数据融合和代谢组学技术，对不同生长阶段的云南 Paris polyphylla var. yunnanensis 进行鉴定与评价

《Industrial Crops and Products》：Identification and evaluation of Paris polyphylla var. yunnanensis of different growing stages using a multi-dimensional spectroscopy data fusion and metabolomics

　　杨光辉|兰花华|王元忠
陕西中医资源产业化协同创新中心，秦药特色资源研发国家重点实验室（栽培），陕西创新药物研究中心，陕西中医药大学药学院，中国咸阳712046

**摘要**
市场上不同生长年限的Paris polyphylla var. yunnanensis（PPY）质量参差不齐，严重影响了其药效。为了识别和评估不同年份的PPY，本研究结合了多维度光谱技术和代谢组学方法。首先，使用MIR、NIR和数据融合技术创建了多维度光谱图像。然后，应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、支持向量机（SVM）和深度学习ResNet模型对PPY进行分类。最后，通过对糖类和黄酮类化合物的代谢组学分析来评估和筛选不同生长年份的标志物。结果表明，在PLS-DA和SVM中，预处理后的光谱表现优于原始光谱，且多种预处理技术的结合效果优于单一方法。NIR和MIR光谱的数据融合在PLS-DA和SVM模型的训练和测试中均达到了100%的准确率。此外，未经预处理的2DCOS和3DCOS同步光谱结合ResNet也实现了对不同生长年份PPY的高精度分类。在代谢组学分析中，筛选出11个标志物（包括5种糖类和6种黄酮类化合物），这些标志物的含量在不同生长年份之间存在差异。本研究为中药的快速鉴定和评估提供了参考。

**1. 引言**
Paris polyphylla var. yunnanensis（PPY）是一种多年生植物，属于百合科，其根茎为药用部分。药理研究表明，PPY具有多种生物活性，包括抗肿瘤、止血、驱虫和抗菌作用。其主要化学成分包括甾体皂苷、黄酮类化合物、多糖和三萜皂苷等（Ding等人，2021年）。含有PPY的传统中药包括云南白药、功旭宁胶囊和济德胜蛇药。由于工业需求增加，PPY资源逐渐减少。市场上销售的PPY来自不同生长年限的植物，导致质量不稳定，从而影响其药效。不同生长年份的PPY中活性成分的浓度也有所不同（Yang等人，2017年）。然而，由于PPY外观相似且大小差异较小，准确识别不同年份的PPY具有一定的挑战性。尽管PPY含有多种活性化合物，但关于不同生长年份代谢物标志物的研究仍有限。

目前，识别中药和天然产物的主要方法包括化学反应法、光谱法、色谱法和DNA条形码技术（Li等人，2026年；Feng等人，2025年；Yang等人，2021年）。红外光谱、紫外-可见光谱、拉曼光谱和核磁共振光谱等光谱技术被认为是中药鉴定的重要工具，具有操作简便、分析快速和非破坏性的优点（He等人，2026年）。这些方法可以捕捉活性化合物的全面化学结构信息，符合中药的多组分和多靶点特性。其中，红外光谱（IR）在制药、农业和食品工业中应用最为广泛（Li等人，2024年；Wang等人，2025年）。IR根据波数分为近红外（NIR，13300–4000?cm–1）、中红外（MIR，4000–400?cm–1）和远红外（400–10?cm–1）三个区域，其中NIR和MIR区域在天然产物鉴定中应用最广泛。例如，利用ATR-FTIR光谱结合深度学习建立了快速鉴定人参伪品的 方法（Liang等人，2025年）。Yang等人结合化学计量学方法快速鉴定了高丽灵芝的变种（Yang等人，2023年）。通过融合NIR和MIR数据可以获取更全面的化学信息，提高样品评估效果。李等人应用NIR和MIR光谱的多信息数据融合技术研究了 Wolfiporia cocos 的地理溯源性，并发现数据融合优于单光谱模型（Li等人，2022a）。一维光谱常用于表征结构明确的样品，而对于化学成分复杂的中药，多维度光谱分析能够提供更详细的化学结构信息和更准确的鉴定结果（Li等人，2025c）。Noda于1994年提出了二维相关光谱（2DCOS）技术（Noda，1993年），随后三维相关光谱（3DCOS）也被用于表征复杂化学成分和样品鉴定。例如，Han等人使用2DCOS NIR和MIR光谱研究了Dendrobium Offinale的地理来源（Han等人，2025年）。Liu等人结合3DCOS MIR光谱和深度学习模型建立了高丽灵芝及其物种的快速鉴定方法（Liu等人，2025年）。然而，关于多维度光谱数据融合及其在中药中的应用的研究仍较为有限。

随着人工智能的发展，机器学习技术可用于数据分析和治疗植物资源的评估（Zhang和Wang，2023年）。传统的无监督学习方法如主成分分析、t-SNE和聚类分析，以及有监督学习方法如偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、支持向量机（SVM）和随机森林被广泛使用。与无监督方法相比，有监督方法在鉴定任务中通常表现更好（Yang和Wang，2026年）。PLS-DA是一种线性判别工具，用于研究变量和因变量之间的关系，将观测样本分配到预定义的类别中，实现降维和分类双重目标（Asri等人，2022年）。例如，NIR结合PLS-DA可用于鉴定Wolfiporia cocos的地理来源和不同部位（Li等人，2022b）。SVM用于寻找最佳超平面以区分不同类别的样本。Wu等人使用FT-MIR和UV-Vis结合SVM研究了PPY样本的地理溯源性（Wu等人，2018年）。深度学习模型（如人工神经网络和残差卷积神经网络（ResNet）在分析大规模样本数据方面特别有效，能够在自动提取特征信息方面发挥优势（Debus等人，2021年）。ResNet模型结合2DCOS NIR光谱和光谱融合，在Dendrobium Officinale的产地鉴定中实现了100%的准确率（Han等人，2025年）。

药用植物的代谢物被认为是其治疗效果的关键化学基础。PPY具有多组分、多靶点和多效应特性，主要活性成分包括甾体皂苷、黄酮类化合物和多糖（Ding等人，2021年）。PPY提取物在SMMC-7721人肝癌细胞中表现出抗癌作用（Sun等人，2011年），并具有抗肠道病毒71和柯萨奇病毒的作用（Wang等人，2011年）。PPY中的甾体皂苷还被用作控制Dactylogyrus虫害的天然药剂（Wang等人，2010年）。高效液相色谱（HPLC）、液相色谱-质谱（LC-MS）和气相色谱-质谱（GC-MS）等技术常用于测定各种代谢物。Li等人使用HPLC-DAD同时测定了PPY中的9种活性成分（Li等人，2025a），并利用LC-MS分析了不同气候区的PPY黄酮类化合物（Zhong等人，2025年）。然而，关于不同生长年份PPY中黄酮类化合物和多糖等代谢物的含量和变化情况的研究仍有限。

本研究旨在结合多维度光谱技术和机器学习方法，识别和评估不同生长年份的PPY。首先，创建了同步、异步和集成图像以进行多维度MIR和NIR数据融合光谱。然后，基于多维度数据融合光谱，比较了传统机器学习有监督方法（如PLS-DA、SVM）和深度学习（ResNet模型）的性能。此外，还对不同生长年份的黄酮类化合物和多糖进行了代谢组学分析。通过GC-MS（选择离子监测，SIM）定量了24种多糖，通过LC-MS（多反应监测，MRM）分析了43种黄酮类化合物。将代谢组学数据与PLS-DA结合，用于识别不同生长年份PPY的关键标志物。

**2. 材料与方法**
**2.1. 样品和试剂**
从云南省两个地区的PPY样本中获得了186个样本，分别为玉溪市红塔区（N24°25′59″，E102°26′26″，海拔2100米）和洪河县元阳县（N22°0′37″，E103°1′14″，海拔1628米）。所有样本均经过云南农业大学药用植物研究所的鉴定和保存，包括3年、4年、5年、6年、7年和8年生长的植株，每组分别有32个、32个、32个、30个和30个样本。不同生长年份PPY的植物形态图见图1。每个类别的样本分为训练集（70%）和测试集（30%），用于PLS-DA和SVM模型。另外，10%的测试样本作为外部验证，以评估ResNet模型的准确性。样本制备过程中，收集了不同生长年份的新鲜PPY样本并清洗后处理：分离主根，用陶瓷刀切片，50°C下晾干，通过60目筛子研磨后备用。

参考标准中的甾体皂苷由成都Purefy Technology Development Co. Ltd提供，黄酮类化合物从MedChemExpress购买，纯度均≥98%。乙腈、甲醇和磷酸（HPLC级）购自Kermel Co. Ltd，甲酸（HPLC级）由Sigma-Aldrich提供。超纯水由Milli-Q系统（Millipore，美国）制备。

**2.2. 光谱数据采集**
**2.2.1. NIR和MIR光谱采集与数据融合**
本研究使用Thermo Fisher Scientific公司的NIR光谱仪采集不同年份PPY样本的光谱。使用前仪器进行了30分钟的校准。光谱扫描范围为10000–4000?cm–1，扫描次数为64次，分辨率设为4?cm–1。三次扫描得到的平均光谱用于分析。每隔半小时进行一次背景测试，以消除仪器或环境干扰。所有分析在室温（25?±?2°C）和60% ± 2%湿度条件下进行。

MIR光谱使用Frontier Perkin Elmer公司的FT-MIR光谱仪和ATR附件采集，光谱扫描范围为4000–400?cm–1，分辨率为8?cm–1，共进行64次累积扫描，每次样本扫描3次。获取平均光谱以供进一步分析。采集空白光谱以排除水和二氧化碳的干扰。

低级别数据融合（也称为多仪器化学源融合）是一种简单有效的建模分析方法。本研究通过结合NIR和MIR光谱的原始数据，进行归一化处理，形成覆盖10000–400?cm–1波数范围内的矩阵，用于光谱预处理和PLS-DA及SVM模型开发。此外，合并的数据集用于生成ResNet建模的多维COS（相关光谱）图像。

**2.2.2. 多维度图像采集**
使用SIMCA-P+ 14.1+软件从原始NIR和MIR光谱生成数据集，然后导入Matlab R2021a。在Matlab中使用算法进行一维相关光谱处理，每种类别生成186幅图像。这些图像分为120幅训练图像、39幅测试图像和27幅预测图像。同样，基于Noda的理论（Eq. 1）（Noda，1993年），使用Matlab R2023a中的2DCOS算法生成了同步、异步和集成图像（2DCOS、3DCOS图像）。在此背景下，S表示动态光谱，v表示光谱变量，t表示外部扰动。

（1）Sv=sv1×sv2…svtm（Eq. 2）和Ψ(v1, v2)（Eq. 3）分别表示v1和v2的同步和异步2DCOS强度。积分2DCOS Ι(v1, v2)（Eq. 4）是通过乘法得到同步和异步2DCOS值的结果。N表示Hilbert-Noda变换，记为Njk（Eq. 5）
（2）Φ(v1,v2)=1/m×Sv1T×Sv2
（3）Ψ(v1,v2)=1/m×Sv1T×N×Sv2
（4）Ι(v1,v2)=Φ(v1,v2)×Ψ(v1,v2)/[1/m×Sv1T×Sv2×N×Sv2]
（5）Njk=0,j=k1π(k?j)，j≠k

生成3DCOS的原理和方法与2DCOS相同。通过Matlab R2021a生成了不同生长年份的PPY的同步、异步和集成3DCOS图像，随后用于进一步的鉴定研究。2.2.3. 光谱数据准备数据预处理是化学计量数据分析中的关键步骤，主要目的是消除无关干扰，同时尽可能保留目标变量。选择适当的预处理方法或组合对分析结果有显著影响，这与目标数据和模型密切相关（Engel等人，2013年）。本研究比较了四种独立的数据预处理方法，即乘法散射校正（MSC）、标准正态变异（SNV）、一阶导数（FD）和二阶导数（SD）。MSC在数据建模之前去除数据矩阵中的伪影或不良散射效应（Rinnan等人，2009年）。SNV是一种散射校正方法，与MSC类似，用于处理散射和噪声。FD和SD用于避免基线漂移并放大小光谱差异，后者的效果比前者更显著（Chen等人，2008年）。结合多种预处理方法可以有效处理单一方法无法解决的多重干扰或增强信号。因此，比较了四种组合预处理方法：MSC-FD、MSC-SD、SNV-SD和SNV-FD，这些方法为模型提供了最佳性能。2.3. 鉴定模型的建立2.3.1. 传统机器学习（PLS-DA、SVM）两种传统机器学习算法PLS-DA和SVM被应用于识别不同生长年份的PPY。作为监督分类技术，PLS-DA将各种变量和复杂特征转换为关键组分，从而实现准确分类（Lee和Jemain，2019年）。使用原始和预处理后的光谱矩阵作为“X”，不同生长年份类别作为“Y”，在SIMCA-P+ 14.1+中构建偏最小二乘回归以优化鉴定模型。采用了七折交叉验证以确保模型性能良好。在PLS-DA模型中，R2X（X矩阵的解释方差）、R2Y（Y矩阵的解释方差）和Q2（模型的预测能力）的值越接近1，表示模型鲁棒性越高。模型的拟合精度通过估计的均方根误差（RMSEE）、训练集的交叉验证均方根误差（RMSECV）和测试集的预测均方根误差（RMSEP）等参数来评估，较小的值表示模型性能更好。过拟合是PLS-DA中的一个关键问题，使用了200次迭代置换测试来评估模型是否过拟合。SVM的目标是找到分隔不同类别样本的最优超平面（Li等人，2017年）。在本研究中，径向基函数被用作SVM分类的核函数。包括惩罚参数C和核函数参数g在内的参数在训练过程中进行了优化。为了找到最优参数，使用了网格搜索算法从2-10到210的范围内初步搜索参数。基于初步结果，进一步调整参数以确保获得最优参数。在对数空间中对C和g进行了七折交叉验证，以找到最佳参数组合并防止过拟合。根据交叉验证中的最高准确率选择了C和g的最优值。2.3.2. 深度学习（ResNet）ResNet是一种深度学习模型，通常应用于图像分类任务和计算机视觉（Han等人，2025年）。与传统神经网络相比，ResNet引入了残差学习的概念，有助于解决梯度消失/爆炸问题并提高模型性能（Wu等人，2019年）。本研究根据之前的工作（Dong等人，2021年）建立了ResNet模型。该模型使用了未经预处理的多维（1DCOS、2DCOS和3DCOS）光谱NIR和MIR数据进行构建。为了最小化过拟合并优化模型性能，设置了以下参数：学习率为0.01，权重衰减系数为0.0001，图像大小为64×64，训练周期为40，批量大小为16。2.3.3. 模型评估为了评估机器学习模型的性能，通过混淆矩阵的结果计算了几个关键评估指标。这些指标包括准确率（Acc）、精确度（Pre）、召回率和F1分数，用于评估模型的预测能力。这些参数的值越接近1，表明模型性能越优秀。这些指标的公式分别在方程式6-9中给出。(6)Acc=TP+TN/(TP+TN+FP+FN)(7)Pre=TP/(TP+FP)(8)Recall=TP/(TP+FN)(9)F1score=2×precision×recall/(precision+recall)其中TP表示真阳性，FP表示假阳性，TN表示真阴性，FN表示假阴性。2.4. 代谢组学分析2.4.1. 糖类分析本研究使用HPLC-UV分析了不同生长年份的PPY中的24种糖类。将0.02克粉末样品用0.5毫升甲醇：异丙醇：水（3:3:2，v/v/v）混合液提取，并进行40分钟超声处理。提取液冷却后，在4°C下以12,000 rpm离心15分钟。向其中加入20微升内标溶液（1000微克/毫升），再加入50微升上清液，然后混合并在氮气流下蒸发。残留物用15毫克/毫升的甲氧胺盐酸盐溶液在吡啶中衍生化。衍生化过程包括在37°C下将样品与100微升衍生化溶液混合2小时。然后加入100微升BSTFA，混合物在37°C下维持30分钟。混合物通过0.22微米微滤膜过滤后，稀释至适当浓度并通过GC-MS进行分析。所有参考标准品由CNW（上海安佩尔）、IsoReag（上海）和TCI（上海）提供。将标准品溶液配置为2毫克/毫升的浓度，并储存在-20°C。然后用水甲醇将其稀释六倍。制备了从低到高的不同浓度标准品溶液，并通过GC-MS进行分析。基于外标和内标的关系，通过在x轴上绘制浓度比，在y轴上绘制峰面积来建立标准曲线。GC-MS分析使用配备了5977B质谱仪的Agilent 8890气相色谱仪进行。样品在DB-5MS柱（30米×0.25毫米内径，0.25微米，J&W Scientific，美国）上进行分离。载气使用氦气，流速为1毫升/分钟。注射模式为5:1的分流比，注射体积设置为1微升。离子源（230°C）和传输线温度（280°C）分别设定。梯度程序如下：在160°C保持1分钟，然后以6°C/分钟的速度升至200°C，以10°C/分钟的速度升至270°C，以5°C/分钟的速度升至300°C，再以20°C/分钟的速度升至320°C，并在该温度下保持5.5分钟。所有样品均在选择性离子监测（SIM）模式下进行分析。2.4.2. 黄酮类分析通过LC-MS/MS的MRM模式量化了不同生长年份的PPY中的24种黄酮类化合物。提取液将0.2克样品与500微升70%甲醇混合。为了便于定量分析，向提取液中加入10微升内标（4000纳米摩尔/升），然后进行超声处理。混合物在4000 rpm下离心10分钟。上清液通过0.22微米膜过滤器过滤后，再进行LC-MS/MS分析。标准溶液（10毫米摩尔/升）在70%甲醇中配制，并逐步稀释用于标准曲线分析。样品提取液使用UPLC-MS/MS系统进行分析。它们在Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1×100毫米，1.8微米）上进行分离， oven温度为40°C。流动相由0.05%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，流速为0.35毫升/分钟。注射体积设置为2微升。洗脱程序如下：0-1分钟，10%-20% B；1-9分钟，20%-70% B；9-12.5分钟，70%-95% B；12.5-13.5分钟，95% B。UPLC-MS/MS分析使用配备ESI源的三重四极杆质谱仪（QQQ）进行。质谱条件通过Analyst 1.6.3软件操作。操作参数包括：离子喷雾电压分别为-4500伏（负极）和5500伏（正极）；离子源温度为550°C； Curtain气体和加热器气体均为55 psi。单个化合物的MRM跃迁的参数，包括去聚势（DP）和碰撞能量（CE），进行了优化。3. 结果与讨论3.1. 光谱解释MIR光谱包括官能团和指纹区域，用于表征化合物分子中的键振动吸收。官能团区域（波数4000-1500厘米^-1）主要用于识别分子官能团，而指纹区域（波数1500-400厘米^-1）有助于确认化合物的身份。图2A显示了不同生长年份的PPY的平均MIR光谱，发现了15个共同的吸收峰。官能团区域包括五个显著峰：3290、2928、2861、1745、1653和1546厘米^-1。3290厘米^-1处的峰可能归因于O-H基团的伸缩振动，表明PPY中可能存在黄酮类、皂苷和蜕皮激素等化合物（Han和Wang，2024年）。2928厘米^-1处的吸收带与化合物中的亚甲基C-H键不对称伸缩振动有关（Zhao等人，2014年）。此外，1745厘米^-1处的峰可能是由于黄酮类中的羰基伸缩（Skenderidis等人，2019年）。1653厘米^-1可能是黄酮类、甾体皂苷和氨基酸中的CO基团。1546厘米^-1的峰与黄酮类中的苯环骨架振动有关（Han和Wang，2024年）。指纹区域包含八个共同峰：1459、1412、1339、1246、1154、1075、1005、932和764厘米^-1。1459、1412和1339厘米^-1的峰可能与CH2的C-H不对称弯曲振动有关（Pei等人，2020年）。1246厘米^-1的峰是由于糖类中的C-O伸缩振动。1154、1075和1005厘米^-1的峰与糖类中的C-C和C-O伸缩及C-OH弯曲振动有关（Pei等人，2020年）。此外，932厘米^-1的峰对应于糖类中的糖骨架振动，而764厘米^-1的峰与甾体皂苷中的糖环C-C伸缩振动有关（Yan，2013年）。对PPY的原始光谱进行了不同的预处理技术，如图S1所示。FD增强了差异光谱吸收峰的信号，特别增强了指纹区域的峰。与FD相比，SD更有效地消除了基线漂移，使色谱峰差异更加明显。MSC和SNV减少了噪声干扰，有助于比较差异吸收峰。组合预处理方法在消除光谱噪声、增强不同吸收峰的强度以及改善样品鉴定方面最为有效。官能团区域（4000-1800厘米^-1）的峰位置和强度差异相对较小，表明不同生长年份的PPY之间化合物类型的变化最小。相比之下，指纹区域的吸收峰强度存在显著差异，表明不同生长年份的PPY活性成分存在差异。下载：下载高分辨率图像（255KB）下载：下载全尺寸图像图2. 不同生长年份的PPY的平均MIR（A）和NIR（B）光谱。不同生长年份的PPY的平均NIR光谱如图2B所示，展示了八个共同的吸收峰：8346、6841、6327、5883、5621、5177、4747和4308厘米^-1。8346厘米^-1处的峰对应于C-H伸缩的第二泛音（Yan，2013年）。6841厘米^-1处的峰代表多糖、黄酮类和有机酸中O-H伸缩振动的第一泛音吸收。6327厘米^-1处的吸收是由于糖类和苷中的C-H和O-H伸缩振动。5621厘米^-1处的峰归因于CH2的C-H伸缩的第一泛音（Pei等人，2020年）。5177厘米^-1处的峰对应于多糖、黄酮类和氨基酸中氢键伸缩的第二泛音（Yan，2013年）。4747厘米^-1处的峰可能是碳氢化合物的C-O伸缩（Yan，2013年）。此外，4400-4300厘米^-1范围内的峰对应于C-H伸缩的第二泛音（Pei等人，2020年）。对光谱应用的各种预处理技术如图S2所示。FD方法有效消除了基线干扰并增强了吸收峰。与FD相比，SD方法提高了峰分辨率，有助于识别肩峰和重叠峰。MSC和SNV均平滑了基线并减少了噪声干扰，而组合光谱预处理方法进一步提高了数据质量，从而改善了鉴定效果。3.2. 多维光谱图像分析如图3A-C和图S3所示，从原始光谱生成了不同生长年份的PPY的多维COS MIR光谱图像。波动数范围为1700–550 cm–1，包含了丰富的化学信息，被用于创建和分析多维COS光谱。图3A展示了不同生长年份的1DCOS光谱图像，显示出在932 cm–1处有一个明显的峰值，尽管其强度在不同年份间有显著变化。在图3B中，2DCOS同步光谱图像显示出在950 cm–1处有一个明显的自峰值，这归因于糖类骨架的振动。在1300 cm–1和1700 cm–1观察到的交叉峰是由于PPY中的黄酮类化合物引起的。这些结果表明，不同年份的PPY样本中糖类含量存在相当大的变化。图S3-A显示了2DCOS异步光谱图像，与同步光谱类似，在950 cm–1处也有一个明显的自峰值。然而，异步光谱显示出了许多复杂的交叉峰，使得识别变得更加复杂。图S3-B展示了2DCOS积分光谱，在不同生长年份中，950 cm–1处的自峰值有所变化，而交叉峰也有显著差异。总体而言，与异步和积分光谱相比，2DCOS同步光谱在不同年份间的变化较小，这有利于开发可靠的识别模型。图3C展示了不同生长年份的PPY的3DCOS同步光谱图像，在950 cm–1和1350 cm–1处有两个变化的自峰值。图S3-C和S3-D中的3D异步和积分光谱显示出了多个自峰值和负交叉峰，表明光谱模式更加复杂。下载：下载高分辨率图像（692KB）下载：下载全尺寸图像

图3. 不同年份的PPY的1DCOS（A：MIR，D：NIR，G：NIR-MIR）、同步2DCOS（B：MIR，E：NIR，H：NIR-MIR）和同步3DCOS（C：MIR，F：NIR，I：NIR-MIR）光谱图像。图3D-F和图S4展示了不同生长年份的PPY的多维COS NIR光谱图像。图3D显示了1DCOS光谱图像，主要峰值分别在6800 cm–1、4700 cm–1和4300 cm–1处。如图3E所示，2DCOS同步光谱显示出在6800 cm–1处有一个自峰值，该峰值在不同年份间有所变化，与多糖和黄酮类化合物相关。图S4-A和B中的2DCOS异步和积分光谱显示的交叉峰较少，且光谱模式更为复杂。图3E显示了3DCOS同步光谱，在4300 cm–1处发现了一个明显的自峰值。3D异步和积分光谱在不同生长年份间显示出多个复杂的峰值，包括负峰值。最后，图3G-I和图S5展示了不同生长年份的多维COS NIR-MIR光谱图像的数据融合结果。与单光谱分析相比，多光谱数据融合提供了更全面的信息，特征峰值是单光谱组合的结果。值得注意的是，NIR光谱的强度高于MIR光谱。数据融合后，特别是在2DCOS和3DCOS光谱中，观察到了额外的NIR光谱峰值，从而提高了整体光谱数据的质量。

3.3. 不同生长阶段的PPY识别
3.3.1. 使用通过7折交叉验证的监督模型PLS-DAPLS-DA来识别不同生长阶段的PPY。原始光谱和预处理光谱的建模结果总结在表1中。在200次排列测试中，左侧的Q2和R2值的蓝色和绿色点低于右侧的点，表明模型没有过拟合。如图S6-8所示，结合各种预处理方法的PLS-DA模型在识别不同生长阶段的PPY方面是有效的。最初，PLS-DA处理原始光谱的效果较差，R2Y（0.148）和Q2（0.0501）值较低，RMSEE（0.28）、RMSECV（0.30）和RMSEP（0.29）值也较高。训练集和测试集的准确率分别为38.33%和36.36%。当应用单光谱预处理后，模型性能显著提高，训练集和测试集的准确率均有所增加。在预处理方法中，SD方法表现最佳，R2Y（0.825）和Q2（0.484）值较高，RMSEE（0.19）、RMSECV（0.26）和RMSEP（0.23）值较低。训练集和测试集的准确率分别提高到了94.17%和87.88%。为了进一步提高性能，测试了多种预处理组合，与单一预处理方法相比，模型性能显著提升。特别是MSC-SD组合获得了最高的R2X（0.733）和R2Y（0.682）值，RMSEE（0.11）、RMSECV（0.25）和RMSEP（0.24）值也较低。训练集和测试集的准确率分别达到了100%和92.42%。此外，准确率、精确度、召回率和F1分数分别为0.96、0.89、0.89和0.89。这些结果与之前的研究一致，例如Deng等人的工作（2025年）表明，组合预处理可以增强Boletus bainiugan的来源可追溯性。对于MIR光谱学，200次排列测试确认使用不同预处理方法的模型没有过拟合。结合SD预处理的PLS-DA模型在识别不同生长阶段的PPY方面表现最佳。R2X、R2Y和Q2值分别为0.715、0.931和0.718，RMSEE、RMSECV和RMSEP值最小。训练集和测试集的准确率分别为100%和92.42%。与MIR光谱学相比，NIR光谱学显示出更高的准确率、精确度、召回率和F1分数。在低级别数据融合中，NIR-MIR光谱与MSC-SD和SNV-SD的组合优于单光谱技术。特别是SNV-SD在建立PLS-DA模型方面表现最佳，R2X（0.728）、R2Y（0.946）和Q2（0.703）值较高，RMSEE（0.10）、RMSECV（0.25）和RMSEP（0.25）值较低。训练集和测试集的准确率均为100%。此外，准确率、精确度、召回率和F1分数分别为0.96、0.89、0.89和0.89。

表1. 基于不同预处理方法的NIR-MIR光谱数据融合的PLS-DA建模结果。

光谱 | 预处理 | R2X | R2Y | Q2 | RMSEE | RMSE | RMSEP | 训练准确率（%） | 测试准确率（%） | 准确率 | 召回率 | F1分数
------|-------|------|------|-------|-------|--------|-----------|-----------|-----------|-----------|-----------
NIR原始 | 40.99 | 40.148 | 0.0501 | 0.28 | 0.30 | 0.29 | 38.33% | 36.36 | 0.63 | 0.38 | 0.38 |
FD | 20.66 | 90.11 | 20.061 | 20.30 | 0.32 | 0.28 | 37.50% | 31.82 | 0.77 | 0.32 | 0.32 |
SD | 160.81 | 10.825 | 0.484 | 0.19 | 0.26 | 0.23 | 94.17% | 87.88 | 0.96 | 0.88 | 0.88 |
MSC | 40.95 | 0.13 | 0.015 | 70.31 | 0.30 | 40% | 36.36 | 0.78 | 0.34 | 0.36 |
SNV | 80.99 | 60.22 | 40.036 | 80.27 | 0.30 | 0.24 | 55.83% | 50.00% | 0.83 | 0.50 |
MSC-FD | 20.35 | 90.20 | 0.145 | 0.28 | 0.31 | 0.29 | 45.83% | 42.42% | 0.77 | 0.32 | 0.32 |
MSC-SD | 150.73 | 0.936 | 0.682 | 0.11 | 0.25 | 0.24 | 100% | 92.42 | 0.96 | 0.89 | 0.89 |
SNV-FD | 20.36 | 10.19 | 90.143 | 0.28 | 0.31 | 0.29 | 45.00% | 42% | 0.77 | 0.30 | 0.30 |
SNV-SD | 150.73 | 0.936 | 0.683 | 0.11 | 0.25 | 0.24 | 100.00% | 92% | 0.96 | 0.89 | 0.89 |
MIR原始 | 30.94 | 40.16 | 10.11 | 0.32 | 0.33 | 0.32 | 37.50% | 46.97% | 0.82 | 0.47 | 0.47 |
FD | 130.81 | 70.83 | 0.474 | 0.19 | 0.32 | 0.27 | 98.33% | 87.88 | 0.96 | 0.88 |
SD | 140.71 | 50.95 | 0.13 | 0.015 | 70.31 | 0.30 | 40% | 36.36 | 0.78 | 0.34 |
SNV | 80.99 | 60.22 | 40.036 | 80.27 | 0.30 | 0.24 | 55.83% | 50.00% | 0.83 | 0.50 |
MSC-FD | 20.35 | 90.20 | 0.145 | 0.28 | 0.31 | 0.29 | 45.83% | 42.42% | 0.77 | 0.32 | 0.32 |
MSC-SD | 150.73 | 0.936 | 0.682 | 0.11 | 0.25 | 0.24 | 100% | 92.42 | 0.96 | 0.89 | 0.89 |
SNV-FD | 20.36 | 10.19 | 90.143 | 0.28 | 0.31 | 0.29 | 45.00% | 42% | 0.77 | 0.30 | 0.30 |
SNV-SD | 150.73 | 0.936 | 0.683 | 0.11 | 0.25 | 0.24 | 100.00% | 92% | 0.96 | 0.89 | 0.89 |
MIR原始 | 30.94 | 40.16 | 10.11 | 0.32 | 0.33 | 0.32 | 37.50% | 46.97% | 0.82 | 0.47 | 0.47 |
FD | 130.81 | 70.83 | 0.474 | 0.19 | 0.32 | 0.27 | 98.33% | 87.88 | 0.96 | 0.88 |
SD | 140.71 | 50.95 | 0.13 | 0.015 | 70.31 | 0.30 | 40% | 36.36 | 0.78 | 0.34 |
SNV | 80.99 | 60.22 | 40.036 | 80.27 | 0.30 | 0.24 | 55.83% | 50.00% | 0.83 | 0.50 |
MC | FD | 20.35 | 90.20 | 0.145 | 0.28 | 0.31 | 45.83% | 42.42% | 0.77 | 0.32 | 0.32 |
SNV-SD | 150.73 | 0.936 | 0.682 | 0.11 | 0.25 | 0.24 | 100% | 92.42 | 0.96 | 0.89 | 0.89 |

3.3.3. 通过7折交叉验证的PLS-DAPLS-DA监督模型用于识别不同生长阶段的PPY。表1总结了原始光谱和预处理光谱的建模结果。在200次排列测试中，左侧的蓝色和绿色点（Q2和R2值）低于右侧，表明模型没有过拟合。如图S6-8所示，结合各种制备方法的PLS-DA模型在识别不同生长阶段的PPY方面是有效的。最初，PLS-DA处理原始光谱时表现不佳，R2Y（0.148）和Q2（0.0501）值较低，RMSEE（0.28）、RMSECV（0.30）和RMSEP（0.29）值也较高。训练集和测试集的准确率分别为38.33%和36.36%。当应用单光谱预处理后，模型性能显著提高，训练集和测试集的准确率均有所增加。在预处理方法中，SD方法表现最佳，R2Y（0.825）和Q2（0.484）值较高，RMSEE（0.19）、RMSECV（0.26）和RMSEP（0.23）值较低。训练集和测试集的准确率分别提高到了94.17%和87.88%。进一步改进后，通过测试了多种预处理组合，模型的性能明显优于单一预处理方法。特别是MSC-SD组合获得了最高的R2X（0.733）和R2Y（0.682）值，RMSEE（0.11）、RMSECV（0.25）和RMSEP（0.24）值也较低。训练集和测试集的准确率分别达到了100%和92.42%。此外，准确率、精确度、召回率和F1分数分别为0.96、0.89、0.89和0.89。这些结果与之前的研究一致，例如Deng等人的工作（2025年），表明组合预处理可以增强Boletus bainiugan的来源可追溯性。对于MIR光谱学，200次排列测试确认使用不同预处理方法的模型没有过拟合。结合SD预处理的PLS-DA模型在识别不同生长阶段的PPY方面表现最佳。R2X、R2Y和Q2值分别为0.715、0.931和0.718，RMSEE、RMSECV和RMSEP值最小。训练集和测试集的准确率分别为100%和92.42%。与MIR光谱学相比，NIR光谱学显示出更高的准确率、精确度、召回率和F1分数。在低级别数据融合中，NIR-MIR光谱与MSC-SD和SNV-SD的组合优于单光谱技术。特别是SNV-SD在建立PLS-DA模型方面表现最佳，R2X（0.728）、R2Y（0.946）和Q2（0.703）值较高，RMSEE（0.10）、RMSECV（0.25）和RMSEP（0.25）值较低。训练集和测试集的准确率均为100%。此外，准确率、精确度、召回率和F1分数分别为0.96、0.89、0.89和0.89。

3.3.3.1. PLS-DAPLS-DA是一种通过7折交叉验证的监督模型，用于识别不同生长阶段的PPY。表1总结了原始光谱和预处理光谱的建模结果。在200次排列对于传统的机器学习模型（PLS-DA和SVM），使用预处理光谱进行分类的性能优于使用原始光谱。此外，多种预处理方法的组合比单一预处理方法表现得更好。在同一模型中对不同数据集应用不同的预处理方法会导致不同的分类结果。例如，使用SD处理的NIR光谱和使用MSC-SD处理的MIR光谱获得了相对更好的结果。此外，不同的模型需要不同的预处理才能达到最佳性能。例如，在NIR和MIR的数据融合中，PLS-DA与MSC-SD结合使用表现更好，而SVM则在使用SD预处理时表现更好。这些结果与研究表明，用于鉴定Gastrodia elata B1物种的最佳预处理方法是多样的（Li等人，2025c）。如图6所示，当将PLS-DA和SVM与深度学习（ResNet）进行比较时，结合深度学习的多维光谱数据无需预处理仍能实现高分类准确性。先前的研究也表明，未经预处理的多维FT-MIR和NIR光谱与深度学习结合使用，可以实现更高的分类准确性（Yang和Wang，2026）。值得注意的是，2DCOS和3DCOS同步光谱可以应用于不同的数据集以实现准确分类。这表明深度学习与多维光谱的结合可以可靠地用于鉴定目的。

3.4. 代谢组学分析
3.4.1. 糖类分析
使用质谱仪的SIM模式检测了不同年份PPY中的多糖，以减少基质干扰并提高灵敏度。24种多糖化合物的检测离子列在表S1中。多糖标准品的分析建立了标准曲线、相关系数、浓度范围、检测限（LOD）和定量限（LOQ），如表S1所示。结果表明所有测定方法均符合要求。每年六个样本的PPY样品被分析了24种多糖的含量。测量结果形成了一个数据矩阵，该矩阵被导入SIMCA-P+ 14.1+进行PLS-DA分析。代谢组学数据使用PLS-DA进行分析，并生成了每个组的得分图以说明各组之间的差异。如图7A所示，基于多糖代谢物的PLS-DA结果表明，不同年份的PPY可以区分开来。所有样本点都落在95%置信区间内，前两个主成分的累积贡献率为83.2%，表明二维得分图有效地代表了大多数化合物的化学信息。评估模型参数的预测参数R2X、R2Y和Q2分别为0.95、0.97和0.965，表明模型是稳定和可靠的。

3.4.2. 黄酮类分析
使用MRM模式分析了不同生长年份PPY中的黄酮类化合物。43种黄酮类化合物的质谱参数针对Q1和Q3进行了优化，详细信息见表S2。大多数化合物在负离子模式下表现更好。对于黄酮苷类，母离子（Q1）会发生脱糖作用产生Q3碎片离子。确定黄酮类成分标准曲线、相关系数、浓度范围、LOD和LOQ的方法在表S2中概述，结果符合分析要求。黄酮类数据矩阵使用PLS-DA进行分析，结果如图8所示。二维得分图显示所有样本均落在95%置信区间内。R2X、R2Y和Q2分别为0.917、0.98和0.971，表明模型表现良好。前两个主成分的累积贡献率为81.2%，代表了样品中的大部分化学信息。不同生长年份的PPY成功分为六组。进行了VIP分析以识别对不同生长年份有贡献的黄酮类成分。表S2中的结果显示，20个成分的VIP值大于1，其中六个化合物对分类有显著贡献（图8B）。其中包括五种多糖（海藻糖）和四种单糖（肌醇、木糖醇、D-甘露糖-6-磷酸钠盐和D-阿拉伯糖醇），被认为是区分不同生长年份PPY的显著贡献者。这些代谢物被定量分析以评估它们在不同年份的分布差异。

这些化合物表现出多样的生物活性。苯基乙烯 acetophenone通过LPS刺激的BV2小胶质细胞和小鼠表现出抗炎作用（Kim等人，2024）。它还能诱导耐辐射的人类乳腺癌细胞凋亡（Park等人，2017）。Naringin二氢查尔酮已被证明可以改善阿尔茨海默病中的认知缺陷和神经病理（Yang等人，2018）。Hyperoside具有抗炎作用（Ku等人，2015），而kaempferol、hesperetin和taxifolin以其抗动脉粥样硬化、抗氧化和神经保护特性而闻名（Cho等人，2006；Topal等人，2016；Tu等人，2007）。图8C显示了这六种生物活性化合物在不同生长年份PPY中的含量变化。海藻糖的含量最高（超过0.8 mg/g），而木糖醇的含量最低（低于0.02 mg/g）。肌醇、D-甘露糖-6-磷酸钠盐和木糖醇的含量随着生长年份的增加而波动。肌醇在第六年达到最大含量，D-甘露糖-6-磷酸钠盐在第五年达到峰值，木糖醇在第三年含量最高。D-阿拉伯糖醇的含量在第三年到第四年增加，然后在第五年后减少。Metabolite B在第三年到第七年变化很小，但在第八年迅速增加。

本研究采用多维NIR和MIR光谱数据融合结合机器学习来鉴定不同生长年份的PPY。首先生成了多维COS NIR和MIR光谱图像，并使用了多种预处理技术对NIR、MIR和NIR-MIR数据融合光谱进行处理，以使用传统机器学习方法（PLS-DA和SVM）开发模型。结果表明，预处理显著增强了模型性能，多种预处理组合产生的结果优于单一方法。此外，数据融合的性能优于单独技术。结合深度学习的多维光谱数据无需预处理，具有更高的分类准确性。应用于不同数据集的2DCOS和3DCOS同步光谱实现了准确分类。最后，使用PLS-DA结合PPY中的糖类和黄酮类的代谢组学数据来评估不同生长年份的PPY。五种糖类（海藻糖、肌醇、D-甘露糖-6-磷酸钠盐、木糖醇和D-阿拉伯糖醇）和六种黄酮类（苯基乙烯 acetophenone、naringin二氢查尔酮、hyperoside、kaempferol和taxifolin）被确定为区分不同年份PPY的标志物。定量分析显示这些标志物在不同生长年份的含量存在显著变化。这种方法提供了一种快速、准确和全面的方法来鉴定和评估不同生长年份的PPY，为草药、食品和其他天然产品的质量控制提供了宝贵见解。

这项工作得到了国家自然科学基金（82204615）的资助。