Cotton GhLAGE3介导的GhMML3转录在接收细胞周期退出信号后激活纤维形成过程

《Industrial Crops and Products》：Cotton GhLAGE3-mediated GhMML3 transcription activates fiber initiation upon reception of cell cycle exit signals

　　陈 耕|明竹嘉|张 儒瑞|吴思琪|廖 梅子|赵 学进|李 亚杰|游 卫祥|张 成城|何塞·拉蒙·博特拉|韩 铃|蒋 婧
中国河南省开封市河南大学生命科学学院棉花生物育种与综合利用国家重点实验室，邮编475004

**摘要**
棉花（Gossypium hirsutum L.）的纤维起始过程通常决定了纤维产量，但其具体机制仍不清楚。MYB-MIXTA类转录因子GhMML3在接收到细胞周期退出信号后，通过某种未知机制成为纤维起始的调控主因子。Y1H筛选发现GhLAGE3（一种核定位的PCC1结构域蛋白）是GhMML3启动子的结合蛋白。研究表明，GhLAGE3与GhMML3启动子的结合能够显著诱导GhMML3的表达，且GhLAGE3的表达在纤维细胞分化关键的-3至-3天期间在胚珠外珠被中得到强烈调控。此外，GhLAGE3表达可被细胞周期停滞剂诱导，但会被细胞周期加速剂抑制。CRISPR-Cas9敲除实验显示，GhLAGE3缺陷株的GhMML3表达显著降低，导致纤维密度和绒毛比例下降，但在整体生长表型、种子大小、种子指数或纤维长度方面与野生型对照无显著差异。我们的发现表明，PCC1类蛋白GhLAGE3能够将细胞周期退出信号传递给GhMML3，从而调控纤维起始过程，为高产棉花育种提供了新的思路。

**1. 引言**
棉花是天然纺织纤维的重要来源，约占全球纤维用途的25%。纤维起始发生在开花前后，决定了纤维的产量和质量。棉花细胞纤维的初期发育是一个复杂的过程，包括胚珠外表皮细胞的命运决定、前纤维细胞的细胞周期退出以及纤维细胞的初始发育（Kim和Triplett，2001；Ando等人，2021；Qin等人，2022；Zhao等人，2024b）。越来越多的证据表明，MYB-MIXTA类转录因子GhMML3（类似GhMYB25）是纤维起始的主要调控因子（Tian和Zhang，2019）。GhMML3在开花前3天至开花后3天期间在胚珠表皮细胞中表达（Chen等人，2025；Qin等人，2022；Walford等人，2011；Wu等人，2006）。ghmml3敲除株表现出无纤维的表型（Chen等人，2025；Qin等人，2022；Walford等人，2011；Zhao等人，2024a），这使其成为纤维细胞分化的核心调控因子。尽管GhMML3的重要性已被充分证实，但其表达调控机制仍不完全清楚。

在真核生物中，细胞分化的前提是退出有丝分裂周期，因为只有后有丝分裂细胞才具备特定方向的分化能力（Boudolf等人，2004；Dewitte等人，2003；De Veylder等人，2002）。在棉花胚珠表皮细胞中，细胞周期停滞发生在将分化为前纤维细胞的表皮细胞簇中（Ando等人，2021）。由于纤维细胞分化始于-3天（Graves和Stewart，1988；Zhao等人，2024b），而胚珠表皮细胞大约在-0.5天开始突出，因此命运决定可能早在-1天甚至更早就已发生（Qin等人，2022）。因此，表皮细胞退出细胞周期和命运决定可能发生在-3至-1天之间，但这一发育过程中的关键信号调控因子仍然知之甚少。

细胞周期进展的机制已被广泛研究。极化生长染色质相关调控因子1（PCC1）可以作为转录因子或转录复合物的亚基来调控与细胞周期相关的基因表达（Kisseleva-Romanova等人，2006）。PCC1及其类似蛋白被认为在真核生物中具有保守性（Beenstock和Sicheri，2021；Kisseleva-Romanova等人，2006）。在酿酒酵母中，PCC1通过与周期依赖性激酶复合物相互作用来调节G1/S期转换（Kisseleva-Romanova等人，2006）。鉴于细胞周期退出在纤维起始中的重要作用以及PCC1在细胞周期调控中的保守功能，我们推测PCC1类蛋白在棉花中可能将细胞周期退出信号传递给GhMML3，从而调控纤维起始。本研究揭示了调控棉花纤维发育的调控网络。

**2. 材料与方法**
**2.1. 植物材料及生长条件**
本研究以Gossypium hirsutum (L.) ‘TM-1’（Texas Marker-1）作为野生型，以‘JIN668’（Li等人，2019；Jin等人，2006）作为受体品种。棉花植株在中国河南省开封市的河南大学生物实验田中按照标准田间管理方法种植。实验设计为完全区组设计，每个处理包含三个生物学重复。烟草（Nicotiana benthamiana L.）植株在环境可控的温室中培养，光照周期为16小时/黑暗8小时。

**2.2. 质粒构建与转化**
为了生成Ghlage3突变株，设计了针对GhLAGE3 (GH_A09G2000/GH_D09G1947)基因的特异性单导向RNA（sgRNA），序列为5’-GTGGGAATTCAGCTGTGATTTGG-3’，用于CRISPR-Cas9载体构建。GhLAGE3基因片段通过同源重组方法使用ClonExpress Multis One Step Cloning Kit（Vazyme，南京）克隆到CRISPR-Cas9载体中。重组载体通过测序验证后，引入农杆菌GV3101菌株。棉花遗传转化由Towin Biotechnology（武汉）按照先前描述的方法进行（Jin等人，2006；Wang等人，2018）。突变株通过高通量突变追踪（Hi-TOM）方法鉴定（Liu等人，2019）。

**2.3. 病毒诱导基因沉默（VIGS）**
使用SGN-VIGS平台设计了GhLAGE3（15–294 bp）或GhAP2（GH_A10G0916）（1036–1315 bp）的280 bp编码区（CDS），分别克隆到pCLCrVA载体中，随后将其引入GV3101菌株。GV3101菌株（携带pCLCrVA-GhLAGE3）悬浮液与携带pCLCrVB辅助载体的菌株悬浮液（10 mM MES；10 mM MgCl2；200 μM Acetosyringone；pH 5.6）等体积混合（Gu等人，2014），注入14天大的TM-1幼苗的第一个子叶。系统沉默效果通过qRT-PCR检测确认。

**2.4. RNA提取与qRT-PCR分析**
从不同组织（包括胚珠外珠被、胚珠及其他组织）中提取总RNA。收集的组织立即放入液氮中快速冷冻并研磨成细粉。RNA提取采用TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Kit（北京）按照制造商的实验步骤进行。总RNA通过NanoDrop和琼脂糖凝胶电泳进行分析，并使用Reverse Transcription System（Vazyme，南京）逆转录为第一链cDNA。qRT-PCR在Roche LightCycler 480实时PCR系统（Roche，瑞士巴塞尔）上进行，以cDNA为模板。反应混合物包含ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）、正向和反向引物以及cDNA模板。GhUBQ7（GenBank登录号DQ116441）作为内参基因用于标准化基因表达水平。相对基因表达水平采用2^-ΔCT方法计算（Geng等人，2023；Livak和Schmittgen，2001）。每个样本至少有三个独立的生物学重复，每个生物学重复包含三个技术重复。

**2.5. 系统发育树构建**
从NCBI数据库中检索了来自不同植物的LAGE3同源物，包括Physcomitrium patens（Hedw.）、Triticum aestivum（L.）、Oryza sativa（L.）、Zea mays（L.）和Arabidopsis thaliana（L.）。从CottonMD数据库中检索了来自棉花物种的GhLAGE3同源物，包括Gossypium herbaceum（L.）、Gossypium arboreum（L.）、Gossypium hirsutum（L.）、Gossypium barbadense（L.）、Gossypium darwinii（Wettst.）、Gossypium mustelinum（Miers.）、Gossypium tomentosum（Nutt.）和Gossypium raimondii（Ulbr.）。系统发育树使用TimeTree网站（http://timetree.org/）构建。

**2.6. GUS活性组织化学检测**
为了构建重组质粒GhLAGE3pro::GUS，将GhLAGE3的-2000 bp启动子克隆到pCAMBIA1309::GUS载体中。将重组质粒引入GV3101菌株，并通过花浸法转化到拟南芥中（Clough和Bent，1998）。转基因拟南芥在添加50 ng/mL hygromycin的Murashige和Skoog培养基中筛选。GUS染色时，21天大的转基因幼苗在70%乙醇中固定并脱水（Jefferson等人，1987），然后在立体显微镜（Nikon，日本东京）下观察。

**2.7. 体外胚珠培养**
在-3天时从花蕾中采集棉花胚珠。收集的胚珠依次用75%（v/v）乙醇和0.1%（w/v）HgCl2表面消毒，然后用无菌蒸馏水彻底清洗。胚珠小心剥离并培养在BT培养基（Beasley和Ting，1973）上，并按文中所述添加5 ng/mL表皮生长因子（EGF；Sigma，美国）或20 μM Roscovitine（Sigma，美国）。体外培养在无菌、黑暗条件下进行，温度为28 ± 1 ℃。

**2.8. 酵母单杂交（Y1H）**
为了构建诱饵质粒pAbAi-GhMML3pro，将GhMML3的启动子（-167至-1268 bp）克隆到pAbAi载体中。通过添加60 ng/mL aureobasidin A（AbA）抑制pAbAi-GhMML3pro的自我激活。使用-3至-3天的TM-1胚珠外珠被构建Y1H文库。Y1H筛选按照Matchmaker Gold酵母单杂交文库筛选系统的制造商说明进行（Clontech，美国）。为了验证筛选出的候选蛋白，将GhLAGE3的CDS分别克隆到pGADT7载体中生成猎物质粒，并转化到携带pAbAi-GhMML3pro的Y1H Gold酵母细胞中。转化后的酵母细胞在添加60 ng/mL AbA的SD/-Leu培养基上培养，平板密封后在30 ℃下培养3–5天。

**2.9. 扫描电子显微镜（SEM）**
使用扫描电子显微镜（SEM；FEI Quanta 250，美国南卡罗来纳州罗克希尔）观察-2000 bp启动子下的胚珠表皮纤维起始情况，加速电压为20 kV。为确保不同胚珠上纤维起始率的可比性，从捕获的图像中截取了胚珠表皮的一致位置（中间区域）和面积（8.7 × 10^4 μm^2）。使用ImageJ软件从截取的图像中计算纤维初始密度（每mm^2）。实验至少包含三个独立的生物学重复，每个重复包含30个胚珠。

**2.10. 细胞内定位**
为了获得GFP标记的GhLAGE3，将GhLAGE3的CDS克隆到S1300–35S::GFP载体中。为了获得mCherry标记的GhH2A作为核标记物，将GhH2A的CDS克隆到S1300–35S::mCherry载体中。在烟草叶片中进行瞬时表达实验。荧光信号使用Nikon A1 HD25共聚焦激光扫描显微镜检测，GFP的激发波长为488 nm，mCherry的激发波长为561 nm。图像分析使用NIS-Elements Viewer软件进行。

**2.11. 双 Luciferase（LUC）报告基因实验**
为了构建报告基因，将GhMML3的-2000 bp启动子插入pGreenⅡ0800::LUC载体中。为了构建效应因子，将GhLAGE3的CDS克隆到pGreenⅡ62-SK载体中。报告基因和效应因子构建体分别导入GV3101（携带pSoup-p19）菌株中。GV3101菌株悬浮液（OD600 = 0.8）与携带pCLCrVB辅助载体的菌株悬浮液等体积混合后灌入烟草叶片。在黑暗条件下培养16小时后，将叶片置于25 °C、16小时光照/8小时黑暗的条件下。随后向叶片喷洒1 mM luciferin，并使用LB985多化学发光成像系统（Berthold Technologies，德国）检测LUC信号。使用Renilla luciferase作为内参蛋白以标准化转染效率并减少实验变异性。

**2.12. 电泳迁移率谱（EMSA）**
为了获得His标记的GhLAGE3，将GhLAGE3的CDS克隆到pET-28a载体中，并引入BL21菌株。该菌株在16 °C下用0.2 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside培养20小时以产生GhLAGE3-His融合蛋白，然后用Ni Sepharose FF纯化。生物素标记的DNA探针由Tsingke Biotechnology Co., Ltd（北京）合成，未标记的探针作为竞争对照。EMSA使用Thermo Fisher Scientific公司的化学发光EMSA试剂盒进行。

**2.13. 统计分析**
所有实验至少包含三个独立的生物学重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较检验（p < 0.01）确定，或者通过双因素ANOVA及Tukey检验来评估两个因素之间的相互作用（p < 0.05）。

**3. 结果**
**3.1. GhLAGE3与GhMML3启动子的结合**
为了研究纤维细胞周期退出与GhMML3之间的细胞信号传导机制，我们使用GhMML3启动子作为诱饵进行了Y1H筛选。利用-3至-3天胚珠外珠被构建的酵母cDNA文库进行筛选，共得到461个阳性结果。生物信息学分析显示共有15个候选基因（见表1）。在阳性序列中，GhLAGE3_A09和GhLAGE3_D09的hit数量最多（见表1）。值得注意的是，这两种蛋白质都含有PCC1结构域，该结构域已知参与细胞周期调控和细胞形态发生（Kisseleva-Romanova等人，2006年）。表1. 识别与GhMML3启动子结合的蛋白质。使用GhMML3启动子作为诱饵进行Y1H筛选得到的阳性结果列表。频率表示在筛选中被克隆的次数。通过Y1H筛选的候选蛋白质列表。

接下来，我们研究了GhLAGE3在细胞周期退出过程中的表达模式。从棉花品种TM-1中收集了-3 DPA期的胚珠，并在体外培养。用表皮生长因子（EGF）处理这些培养的胚珠，EGF是一种促进细胞周期进展的肽类物质，结果发现GhLAGE3的表达从-3 DPA期开始下降（图1C），并且与对照培养相比，纤维细胞密度减少了57.7%（图1A和B）。相反，应用Roscovitine（一种依赖于周期素的激酶抑制剂，用于阻止细胞周期）后，GhLAGE3的表达从-3 DPA期增加到-2 DPA期（图1C），但对纤维的形成没有显著影响（图1A和B）。这些结果表明，细胞周期退出与GhLAGE3的表达呈负相关。

为了更深入地了解GhLAGE3在纤维形成中的作用，我们研究了其在-3至-10 DPA期间在胚珠外层表皮中的表达模式。RNA-seq转录组分析显示，在此期间两种GhLAGE3同源基因的表达持续下降，这与GhMML3的表达模式一致（图1D）。在烟草叶片中瞬时表达GhLAGE3-GFP（与GFP融合蛋白）显示，其荧光信号主要位于细胞核中（图1E）。同时，转基因拟南芥细胞系在GhLAGE3_A09或GhLAGE3_D09启动子的控制下，特异性染色局限于拟南芥的毛状体中（图S1），这表明GhLAGE3可能在毛状体发育中起作用。

为了提供GhLAGE3参与纤维形成的遗传证据，我们使用CRISPR-Cas9系统在JIN668背景下创建了ghlage3突变体。产生了两个独立突变体Ghlage3(L1)和Ghlage3(L2)，它们的GhLAGE3第一个外显子发生了移码突变（图2A）。qRT-PCR表达研究表明，在-3至-3 DPA期间，两种突变体的GhLAGE3表达水平几乎检测不到（图2C），可能是由于细胞沉默机制针对异常RNA所致。重要的是，在-3至-3 DPA期间，GhMML3的表达水平显著低于JIN668对照组（图2D），这表明GhLAGE3促进了-3至-3 DPA期胚珠外层表皮中GhMML3的表达。

多重实验方法证实了GhLAGE3与GhMML3启动子的物理结合及其对GhMML3表达的激活作用。生物信息学分析确定了GhMML3启动子中的三个潜在GhLAGE3结合位点（CGCCC、AGCCA、AGCCT）。AlphaFold3预测显示GhLAGE3（GhLAGE3_A09和GhLAGE3_D09）有很高的概率结合到AGCCT位点上。Y1H检测显示GhLAGE3与GhMML3启动子有强结合性。电泳迁移率测定（EMSA）证实GhLAGE3可以与GhMML3启动子结合。双荧光素酶实验显示，共表达GhLAGE3（62SK-35S::GhLAGE3）和驱动荧光素酶基因（GhMML3pro::LUC）时，与不含GhLAGE3（62SK）的对照组相比有明显的光信号增强（图3G和H）。综合这些结果，表明GhLAGE3直接结合到GhMML3启动子上以激活其转录。

LAGE3在多个棉花品种中的功能研究表明，所有LAGE3同源基因都含有保守的PCC1结构域和翼状螺旋DNA结合结构域。AlphaFold3预测显示这两种蛋白质的结构相同。免疫印迹实验显示它们的蛋白水平没有显著差异，这表明它们在纤维细胞周期退出过程中具有冗余功能。此外，VIGS介导的GhLAGE3沉默导致pCLCrVA-GhLAGE3突变体中GhMML3的表达、纤维密度和纤维百分比降低，这与CRISPR Ghlage3突变体的观察结果类似。同时，沉默在Y1H筛选中也发现的GhAP2转录因子并未对棉花胚珠外层表皮或纤维形成产生显著影响。与此同时，VIGS和CRISPR-Cas9介导的GhLAGE3敲除导致了GhMML3表达的降低（见图2C和图S3C），并伴随纤维生成的受损（见图2B、E以及图S3A、D），从而确立了一个调控途径：GhLAGE3参与控制GhMML3的表达，进而驱动纤维细胞的分化。对11种植物基因组中的LAGE3基因家族的分析表明，LAGE3基因分布广泛，并在整个进化过程中保留了PCC1结构域（见图4A、B和图S9）。在野生二倍体棉花和栽培四倍体棉花中，LAGE3基因都位于9号染色体上，具有相似的基因和蛋白质结构（见图4B、C和图S5）。这些数据表明，LAGE3作为一种保守的关键分子，在棉花中传递细胞周期退出信号以诱导细胞分化。GhLAGE3表现出组织特异性和时间特异性表达，在纤维生成开始时（排卵后-3至-3天）在子房外珠被中高表达（见图1D、F和G），这为纤维细胞的命运决定奠定了基础。在拟南芥异源系统中的启动子活性研究表明，该蛋白在毛状体中的表达暗示其在表皮细胞分化中具有保守功能（见图S1），而Ghlage3敲除突变体对营养生长或种子性状没有影响（见图S2），这突显了其作为纤维生成调控因子的特异性。

4.2. GhLAGE3将细胞周期退出信号传递给GhMML3以启动纤维生成
细胞周期退出是所有真核生物中细胞分化的一个保守前提条件（Boudolf等人，2004年；Dewitte等人，2003年；De Veylder等人，2002年）。在棉花中，细胞周期停滞 specifically 发生在那些注定要成为纤维细胞的子房表皮细胞中，而这种停滞对于纤维生成至关重要（Ando等人，2021年）。PCC1同源物是一类保守的细胞周期调控因子，它们控制G1/S期的转换，并在真核生物的终末分化过程中促进细胞周期停滞（Beenstock和Sicheri，2021年；Kisseleva-Romanova等人，2006年）。我们的数据显示，GhLAGE3的表达与细胞周期进程紧密相关。我们发现，EGF促进的细胞周期进程会抑制GhLAGE3的表达，从而抑制纤维生成；而Roscovitine诱导的细胞周期停滞则会增强GhLAGE3的表达（见图1A、B和C）。这些结果表明，作为PCC1家族成员的GhLAGE3能够响应细胞周期退出信号，并将其传递以激活GhMML3的表达，确保纤维生成仅发生在有丝分裂后的细胞中，避免细胞增殖和分化过程之间的冲突。GhLAGE3可以作为提高棉花产量的精确靶点。与具有广泛作用的调控因子不同，Ghlage3敲除突变体仅在纤维生成方面表现出缺陷，包括纤维初始密度和 lint 百分比的降低（见图2），但对植物生长、种子大小或纤维长度没有不良影响（见图S2）。这些结果表明，精确调控GhLAGE3的表达可以在不影响其他农艺性状的条件下提高纤维产量。基于这些发现，我们提出了一个关于GhLAGE3在棉花纤维生成中功能的工作模型（见图5）。在子房发育过程中，潜在的纤维细胞通过未知机制退出细胞周期，从而触发GhLAGE3的表达。GhLAGE3通过其保守的DNA结合结构域与GhMML3的启动子结合，激活GhMML3的转录，促进纤维生成，最终驱动子房表皮细胞分化为纤维前体细胞。该模型将GhLAGE3确定为一种关键调控因子，它将细胞周期退出信号传递给依赖GhMML3的纤维生成过程。

4.3. 未来研究方向
这项研究在阐明棉花纤维生成的生物学机制方面做出了重要但有限的贡献。仍有许多未知因素需要确定，例如在关键的排卵后-3至-3天期间，控制GhLAGE3在子房外珠被中表达的具体机制或信号。阐明细胞周期退出和GhLAGE3表达调控的详细机制对于提升棉花纤维质量至关重要。此外，GhLAGE3-GhMML3模块的下游靶点仍然不清楚。还需要确定我们在TM-1和JIN668棉花基因型中的发现是否可推广到其他棉花物种。

5. 结论
总之，本研究揭示了含有PCC1结构域的GhLAGE3转录因子如何将细胞周期退出信号传递给GhMML3以启动纤维生成的机制。这些发现揭示了一条新的调控途径，将细胞周期进程与纤维生成联系起来，为高产棉花育种提供了一个有前景的目标。

**资助**
该项目得到了中国国家自然科学基金（项目编号31970735、31271510，资助人Jing Jiang）和河南省自然科学基金（项目编号252300423027，资助人Shuan Han）的支持。

**作者贡献声明**
Chengcheng Zhang：验证、实验研究。
Weixiang You：验证、实验研究。
Jing Jiang：撰写、审阅与编辑、项目指导、方法论制定、资金申请、概念构思。
Shuan Han：撰写、审阅与编辑、数据可视化、项目指导、方法论制定、资金申请、概念构思。
Chen Geng：撰写初稿、数据可视化、验证、实验研究、数据分析。
José Ramón Botella：撰写、审阅与编辑。
Yurui Zhang：数据可视化、验证、实验研究、数据分析。
Mingzhu Jia：撰写初稿、验证、实验研究。
Meize Liao：验证、实验研究。
Siqi Wu：数据可视化、验证、实验研究、数据分析。
Yajie Li：验证、实验研究、数据分析。
Xuejin Zhao：验证、实验研究。