《International Journal of Biological Macromolecules》：Biopolymer-engineered novel chitosan-copper-β-glucan nanocomposite: A sustainable antifungal innovation for enhanced plant immunity and crop yield
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摘要
病原真菌对传统杀菌剂耐药性的发展，加上日益严重的环境和健康问题，使得开发生态兼容的下一代抗真菌剂成为必要。本研究展示了一种通过微波辅助法合成的新型生物聚合物基金属-壳聚糖-铜-β-葡聚糖(CN-Cu-BG)三元素纳米复合材料(NC)的开发与评估。详细的纳
摘要
病原真菌对传统杀菌剂耐药性的发展，加上日益严重的环境和健康问题，使得开发生态兼容的下一代抗真菌剂成为必要。本研究展示了一种通过微波辅助法合成的新型生物聚合物基金属-壳聚糖-铜-β-葡聚糖(CN-Cu-BG)三元素纳米复合材料(NC)的开发与评估。详细的纳米材料表征证实形成了均匀球形(~41.97 nm)的NC，其整合的铜特征信号表明复合材料成功形成。这种嵌入双生物聚合物基质中的铜纳米粒子(Cu-NPs)具有增强的抗真菌功效、植物免疫反应和促增产效应。针对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii，甜菜根腐病的致病菌)和长柄尾孢(Cercospora longipes，甘蔗褐斑病的致病菌)的体外抗真菌试验表明，低至200 ppm的CN-Cu-BG NC浓度即可完全抑制菌丝生长。在甜菜上叶面喷施50 ppm的CN-Cu-BG NC，使几丁质酶和β-葡聚糖酶活性分别提高了673%和681%，并使叶绿素含量提高了72%。甜菜块根重量增加了80%，病害控制率达到74%。多变量分析确定多酚氧化酶(PPO)、β-葡聚糖酶(BG)、几丁质酶(Chi)和叶绿素(Chl)是与增强的病害控制相关的关键标志物(r = 0.84–0.94)。热图、主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)证实，50 ppm的CN-Cu-BG NC在生化、生理和产量参数上均表现出优越的性能。这些发现表明，CN-Cu-BG NC作为一种可扩展的、生态兼容的纳米生物聚合物，为化学杀菌剂提供了一种有效的替代品，它将纳米生物技术与可持续的作物保护和循环生物经济实践相结合。
一、 研究背景、问题与目的
铜是人类健康和植物营养所必需的微量营养素，对许多蛋白质和金属酶至关重要。自1885年以来，首个铜基抗菌化合物——波尔多液（硫酸铜五水合物和石灰的混合物）在农作物保护和增产方面发挥了重要作用。其通过破坏微生物细胞膜和产生活性氧(ROS)来损害细胞成分的机制已被广泛认知和应用。然而，此类化学杀菌剂的持续频繁使用引发了关于其长期可持续性的重大担忧。同时，病原真菌对化学杀菌剂耐药性的出现，以及它们潜在的健康和环境危害，已成为一个主要问题。这些因素共同推动了对创新作物保护方法的迫切需求，引领我们进入利用生物基纳米粒子(NPs)保护作物的新时代。
在农业中应用的铜纳米粒子(Cu-NPs)和氧化铜纳米粒子(CuO NPs)面临着稳定性问题，这源于高反应活性，导致迅速溶解成有毒的铜离子(Cu2+)，并在土壤中氧化和团聚。这种不稳定性在高剂量下会引起植物毒性，对土壤微生物群落产生负面影响，并在食物链中带来生物累积风险。然而，近期纳米技术的进步通过将Cu-NPs掺入/包封到聚合物基纳米复合材料(NCs)中，显著提升了其在植物病害管理中的功效和可持续性。其中，壳聚糖和β-葡聚糖基金属纳米复合材料显示出巨大前景。壳聚糖和β-葡聚糖是无毒、生物相容和可生物降解的生物聚合物，具有固有的抗菌特性。除了直接的抗菌作用，这些多糖还可作为病原体相关分子模式(PAMPs)，被植物模式识别受体(PRRs)识别，从而激活下游信号通路，增强植物对多种生物和非生物胁迫的免疫力。此外，壳聚糖和β-葡聚糖可作为高效的载体基质或智能缓释递送剂，提高金属NPs的稳定性和控制释放。将Cu-NPs整合到壳聚糖-β-葡聚糖纳米复合材料(CN-Cu-BG NC)中，可能通过结合铜的抗菌特性和生物聚合物的免疫刺激与载体功能，产生协同效应。这种方法有望提高NPs的稳定性，通过控制铜释放来降低毒性，并同时激活植物防御机制。
基于此前提，本研究假设合成CN-Cu-BG NC将增强Cu-NPs的稳定性和控制释放，同时协同改善抗菌活性和植物防御反应。尽管已有一些研究分别探讨了壳聚糖基或β-葡聚糖基金属NCs，但将这两种生物聚合物与Cu-NPs联合集成的研究仍较少探索，凸显了开发先进多功能NC系统以实现可持续作物保护和病原管理的必要性。
甘蔗和甜菜是全球糖业的基石，并且在向可持续燃料系统转型中作为生物能源作物重新获得关注。然而，其种植受到齐整小核菌(S. rolfsii)和长柄尾孢(C. longipes)等真菌病原体的严重阻碍，导致巨大的产量和经济损失。传统杀菌剂尽管一度有效，但由于病原体耐药性加剧以及对环境毒性和健康风险的日益担忧，正迅速失去效力。因此，本研究旨在开发和评估一种新型的、生态兼容的、基于生物聚合物的纳米复合材料，为这些破坏性病害提供一种高效且可持续的解决方案。本研究发表在《International Journal of Biological Macromolecules》上。
二、 主要关键技术方法概要
研究人员为开展此项研究，主要采用了以下关键技术方法：首先，采用微波辅助法合成了新型的β-葡聚糖-铜纳米复合材料(BG-Cu NC)和壳聚糖-铜-β-葡聚糖纳米复合材料(CN-Cu-BG NC)。其次，对合成的纳米材料进行了详细的物理化学表征，包括紫外-可见光谱(UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、X射线衍射(XRD)、动态光散射(DLS)、Zeta电位、透射电子显微镜(TEM)、能量色散X射线光谱(EDX)和选区电子衍射(SAED)分析。抗真菌活性通过体外平板对峙法进行评估，所用病原菌为齐整小核菌(S. rolfsii)和长柄尾孢(C. longipes)。最后，通过在甜菜植株上进行叶面喷施处理，评估了CN-Cu-BG NC对植物防御酶活性、叶绿素含量、病害控制效果及最终产量的影响，并进行了多变量统计分析（如主成分分析PCA、偏最小二乘判别分析PLS-DA）以关联生化、生理和产量参数。
三、 研究结果
UV–vis光谱：紫外-可见光谱分析显示，Cu-NPs在约578 nm处有一个尖锐的吸收峰，证实了分散良好的纳米级Cu-NPs的存在。对于CN-Cu NC，587 nm处的峰表明由于壳聚糖与铜的相互作用和NC形成，影响了铜周围的电子密度，导致光谱红移。BG-Cu NC在575 nm处的峰表明β-葡聚糖与Cu-NPs发生了相互作用。而三元素CN-Cu-BG NC在595 nm处显示出更明显的红移，这表明壳聚糖、铜和β-葡聚糖三者之间形成了更强的相互作用和更稳定的复合物。
FT-IR分析：傅里叶变换红外光谱分析用于确认功能基团及其在纳米复合材料形成过程中的相互作用。在CN-Cu-BG NC的光谱中，观察到特定官能团吸收峰的位移、加宽或强度变化，例如与O-H/N-H伸缩振动、C=O伸缩振动(酰胺I带)、N-H弯曲振动(酰胺II带)以及糖苷键相关的峰，这证实了壳聚糖、铜和β-葡聚糖之间通过配位键、氢键等相互作用成功形成了复合物。
XRD分析：X射线衍射分析用于研究材料的结晶性质。纯Cu-NPs的XRD图谱在2θ约为43.3°、50.4°和74.1°处显示出对应于面心立方铜晶体(111)、(200)和(220)晶面的特征衍射峰。在CN-Cu-BG NC的图谱中，这些铜的特征峰仍然可见但强度减弱且略微宽化，表明Cu-NPs成功嵌入到无定形的壳聚糖和β-葡聚糖生物聚合物基质中，导致结晶度降低。
DLS和Zeta电位分析：动态光散射分析表明，合成的CN-Cu-BG NC平均流体动力学尺寸约为88.2 nm，多分散指数(PDI)较低，表明粒径分布均匀。透射电镜图像进一步证实了其球形形貌和约41.97 nm的平均粒径。Zeta电位测量显示CN-Cu-BG NC的表面电荷约为+27.6 mV，较高的正电势有助于胶体稳定性，防止颗粒团聚。
TEM、EDX和SAED分析：透射电子显微镜图像显示CN-Cu-BG NC为球形且分散良好。选区电子衍射图显示出对应于铜晶体面的衍射环，证实了复合材料中Cu-NPs的结晶性质。能量色散X射线光谱分析证实了碳、氧、氮和铜元素的存在，铜信号均匀分布，表明铜纳米粒子成功地并入并均匀分散在生物聚合物基质中。
体外抗真菌活性：评估了CN-Cu-BG NC及其对照材料对甜菜根腐病菌(S. rolfsii)和甘蔗褐斑病菌(C. longipes)的抗真菌活性。结果表明，CN-Cu-BG NC表现出最强的抑制效果，在200 ppm浓度下即可完全抑制两种病原菌的菌丝生长，其效果优于单独的Cu-NPs、BG-Cu NC、CN-Cu NC以及商业化学杀菌剂（如代森锰锌）。这表明壳聚糖、铜和β-葡聚糖的协同组合极大地增强了抗真菌效力。
对甜菜生化、生理和产量参数的影响：在甜菜植株上进行叶面喷施试验，设置了不同浓度（10, 25, 50, 100 ppm）的CN-Cu-BG NC处理组以及对照组。研究得出以下结论：
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对防御相关酶活性的影响：CN-Cu-BG NC处理显著诱导了甜菜叶片中多种防御相关酶的活性，包括多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、几丁质酶(Chi)和β-葡聚糖酶(BG)。其中，50 ppm处理的效果最为显著，与对照组相比，几丁质酶和β-葡聚糖酶活性分别提升了673%和681%。
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对抗氧化剂和色素含量的影响：处理也提高了总酚(TP)和类黄酮含量，并显著增强了光合色素水平。50 ppm CN-Cu-BG NC处理使总叶绿素(Tchl)和类胡萝卜素(Car)含量分别增加了72%和53%。
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对病害控制和产量的影响：CN-Cu-BG NC处理显著降低了由S. rolfsii引起的根腐病发病率(PDI)，并提高了病害控制率(PDR)。在50 ppm处理下，病害控制率达到74%。同时，该处理显著增加了甜菜块根的重量(增产80%)和含糖量(蔗糖Suc含量提高23%)，显示出强大的促生长和增产潜力。
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多变量分析：主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)明确区分了不同处理组，并确定50 ppm CN-Cu-BG NC处理在所有评估参数上表现最优。相关性分析和热图显示，多酚氧化酶(PPO)、β-葡聚糖酶(BG)、几丁质酶(Chi)和叶绿素a (Chl a)与高病害控制率呈强正相关(r = 0.84–0.94)，表明这些参数是CN-Cu-BG NC介导的增强抗病性的关键生物标志物。
四、 讨论与结论
讨论：传统杀菌剂面临的耐药性问题和环境担忧加速了生态友好型纳米生物技术替代品的开发。本研究中的微波辅助三重杂交CN-Cu-BG NC整合了铜的抗真菌功效与壳聚糖和β-葡聚糖的免疫激发及递送功能。壳聚糖作为PAMP，激活包括苯丙素代谢、病程相关蛋白表达和系统获得性抗性(SAR)在内的防御信号通路。β-葡聚糖也是一种已知的激发子，可触发活性氧爆发、胼胝质沉积和防御基因上调。铜纳米粒子除了其固有的抗菌活性外，还可能作为“金属辅助”的敏化剂，放大由生物聚合物引发的免疫信号。这种多模式作用机制——直接抗菌、免疫启动和可能的营养补充（通过微量铜释放）——可能解释了CN-Cu-BG NC观察到的卓越性能。纳米复合材料中Cu-NPs的受控和持续释放对于平衡功效与植物安全性至关重要。高Zeta电位确保了胶体稳定性，这是其持久活性的关键。防御酶（PPO、POD、PAL、Chi、BG）的显著上调表明水杨酸和茉莉酸途径被强烈激活，建立了针对后续病原体攻击的“启动”状态。光合作用的增强（通过叶绿素和类胡萝卜素含量增加反映）与产量提高直接相关，表明处理不仅保护了植物，还改善了其整体生理健康。多变量分析进一步证实了生化、生理和农艺参数之间的强相关性，突出了CN-Cu-BG NC作用的系统性。
结论翻译：本研究揭示了壳聚糖-铜-β-葡聚糖纳米复合材料(CN-Cu-BG NC)作为一种变革性的现代作物保护工具——将强大的抗真菌功效与甜菜深刻的代谢重编程相结合。除了在仅200 ppm浓度下实现对S. rolfsii和C. longipes的完全抑制外，CN-Cu-BG NC处理在甜菜中引发了强烈的生理反应，包括防御酶（如PPO、β-葡聚糖酶、几丁质酶）的显著激增，叶绿素和类胡萝卜素含量的增强，以及最终块根重量和含糖量的显著提高。多变量分析将这些改善与高达74%的病害控制效果联系起来，突显了CN-Cu-BG NC在引发多重防御层方面的作用。通过利用壳聚糖和β-葡聚糖的免疫激发特性与Cu-NPs的抗真菌能力，这种纳米生物聚合物复合材料提供了一种可持续的替代方案，以应对日益严重的杀菌剂耐药性和环境问题。它为将纳米生物技术创新整合到作物保护中铺平了道路，为推进农业生态系统的可持续性、生产力和复原力做出了贡献。
