《International Journal of Biological Macromolecules》：A synthetic guide RNA scaffold enhanced CRISPR/Cas9 editing efficiency in plants across multiple gene targets
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Tushar K. Dutta | Soham Ray | Voodikala S. Akhil | Katakam Rupinikrishna | Utkarsh Chauhan | Anuttama Dutta | Joshitha Vijayan | Mir Asif Iq
Tushar K. Dutta | Soham Ray | Voodikala S. Akhil | Katakam Rupinikrishna | Utkarsh Chauhan | Anuttama Dutta | Joshitha Vijayan | Mir Asif Iquebal | Viswanathan Chinnusamy
印度农业研究学院（ICAR）线虫学系，新德里，110012，印度
摘要
CRISPR/Cas9介导的基因组编辑是一种非常强大且用途广泛的工具，可以加速作物改良。在植物体内，CRISPR/Cas9系统的编辑效率因天然CRISPR RNA与Cas9蛋白之间的结合亲和力不同而存在很大差异。尽管已有研究表明，对引导RNA（gRNA）骨架进行系统性和大规模的工程改造可以显著提高CRISPR/Cas9的效果，但在植物系统中的这类研究仍然相对有限。本研究通过引入一个稳定的茎环结构（tetra loop）和转录终止位点的突变，改进了常用的gRNA骨架设计，从而提高了RNA的折叠效率、Cas9的结合亲和力以及编辑效果。实验结果显示，这种改进后的骨架在拟南芥、水稻和番茄的19个不同目标位点上都能提升CRISPR/Cas9的编辑效率。此外，这种合成骨架还兼容多重基因组编辑架构，包括多顺反子tRNA-gRNA（PTG）表达系统，能够高效地同时靶向多个基因组位点。这些发现对于精准植物育种、功能基因组学和农业生物技术具有广泛的应用价值，有助于在不同植物物种和转化平台中实现可靠的基因修饰。
引言
CRISPR/Cas9基因组编辑技术的出现，为作物改良提供了高效且精确的基因修饰工具，彻底改变了这一领域。该技术利用单个引导RNA（sgRNA）中的20个核苷酸间隔序列来引导Cas9内切酶在特定基因组位点进行双链断裂（DSB）操作。这种靶向编辑显著加快了引入抗病性、非生物胁迫耐受性、产量提升等优良性状的育种过程[1]、[2]。在一些国家，包括印度，某些CRISPR/Cas9诱导的编辑——特别是不包含外源DNA的定向核酸酶-1（SDN-1）改造——越来越被归类为非转基因或不在传统转基因生物（GMO）监管范围内；这种监管立场通过简化监管和减少争议，提高了其接受度和商业化潜力[3]、[4]。
然而，植物基因组编辑的一个主要限制在于其固有的复杂性，通常需要多基因或多重编辑才能实现所需的性状。在植物中实现多重CRISPR/Cas9基因组编辑的方法包括：堆叠多个单顺反子sgRNA载体（每个载体由各自的Pol III启动子驱动），或者从单个启动子表达多顺反子sgRNA阵列，并在转录后将其分解为单独的引导RNA[5]、[6]。多顺反子设计采用了不同的RNA处理机制：(1) Csy4可切割位点加上共表达的Csy4，虽然效率较高但会增加外源蛋白的添加[7]、[8]；(2) 自切割核酶，可以避免额外蛋白质的引入，但突变频率通常较低[7]、[9]；(3) 内源性tRNA处理（即多顺反子tRNA-gRNA或PTG阵列），利用细胞内的RNase P/Z高效释放多个sgRNA，且无需外源因子，已成为植物多重编辑的有效策略[7]、[11]。基于PTG的多重编辑在植物中很受欢迎，因为它结合了紧凑的sgRNA载体和高编辑效率，且随着sgRNA数量的增加，构建和扩展更加容易[11]、[12]。此外，tRNA序列作为内在的Pol III增强子，能被普遍存在的内源性RNase P/Z处理，从而产生高水平的sgRNA转录本，无需外源蛋白或严格的5′-核苷酸限制，进一步促进了其在多种作物中的应用[11]、[13]。
尽管取得了这些创新，但一个持续存在的关键问题仍然是植物系统中编辑效率的变异性和往往不佳的表现[14]、[15]。这种低效率主要是由于常用的sgRNA骨架结构（以下简称天然骨架）折叠不当，尤其是tetra loop（茎环RAR）区域，它对gRNA与Cas9蛋白的结合至关重要。错误折叠的sgRNA会降低与Cas9的结合亲和力，影响功能性核糖核蛋白复合物的形成，进而影响DNA切割[16]、[17]、[18]。此外，当sgRNA骨架中的AAAU序列被DNA模板 interpret为典型的TTTT转录终止信号时，Pol III启动子介导的gRNA转录可能会过早终止，从而减少全长sgRNA的产生和基因组编辑效率[19]。
研究人员在改进CRISPR/Cas9技术方面取得了显著进展，尤其是通过优化gRNA骨架来提高Cas9的结合效率和DNA切割效果[20]。在哺乳动物系统中，许多研究专注于gRNA茎环（特别是tetra loop）的结构改造，以稳定其二级结构，从而提高其与Cas9的结合亲和力并提升基因组编辑效率。这些优化后的骨架减少了转录过早终止和错误折叠，确保了Cas9-gRNA复合物的正确形成，这是精确DNA切割的关键[21]、[22]、[23]。然而，大多数基础研究集中在哺乳动物系统上，将sgRNA骨架优化原理应用于植物的研究仍然较少[24]。迄今为止在植物中进行的一些研究往往未能充分考虑植物特异性RNA转录和折叠的复杂性，尤其是受植物特定RNA聚合酶III启动子的影响[14]、[15]。
在本研究中，通过引入一种86个核苷酸长的合成引导RNA骨架，增强了CRISPR/Cas9在植物中的编辑效率。这种新的86-nt gRNA骨架具有稳定的tetra loop结构、10个核苷酸的茎环延伸以及消除过早终止基序的突变，显著提高了gRNA-Cas9复合物的稳定性和效率。在拟南芥、番茄和水稻的19个基因目标上验证后，其编辑效率是传统设计的两倍，并且在单子叶和双子叶植物中都能可靠地发挥作用。此外，它还兼容基于PTG的多重编辑系统，经过编辑的植物表现出更强的抗线虫感染能力，体现了该骨架的实际应用潜力。
节选
引导RNA骨架变体的全面优化与工程改造
结构分析表明，折叠后的sgRNA tetra loop区域主要与Cas9的识别（REC）叶盘相互作用，作为初始对接界面，在其他茎环区域与核酸酶（NUC）叶盘结合之前稳定gRNA:Cas9复合物。通过优化这一主要结合步骤，合成骨架改善了复合物形成的整体动力学和热力学特性，这对后续的DNA切割至关重要。
讨论
尽管在优化CRISPR/Cas9组件方面取得了显著进展，但在植物基因组编辑领域仍存在一些未解决的问题。尽管RNA转录机制和细胞环境存在差异[21]、[22]、[23]，但在哺乳动物系统中证明有效的sgRNA骨架优化并未充分应用于植物系统。目前使用的许多合成gRNA骨架都来源于哺乳动物研究。
gRNA骨架工程
通过AlphaFold3服务器的结构建模和蛋白质-RNA对接以及ChimeraX分析，研究了gRNA和Cas9的组装稳定性。使用RNAfold网络服务器评估了gRNA:Cas9组装的热力学特性。通过对天然gRNA骨架进行定向突变，生成了多种gRNA骨架变体。PCR反应按照标准协议使用高保真度DNA聚合酶进行。引物详情见表S1。
CRediT作者贡献声明
Tushar K. Dutta：撰写——原始草稿；监督；项目管理；方法学设计；实验设计；资金协调；数据分析；概念构思。Soham Ray：撰写——审阅与编辑；实验设计；概念构思。Voodikala S. Akhil：方法学设计；实验设计。Katakam Rupinikrishna：方法学设计；实验设计。Utkarsh Chauhan：方法学设计；实验设计。Anuttama Dutta：方法学设计；实验设计。Joshitha Vijayan：资源支持。Mir Asif Iquebal：软件开发。
致谢/资金来源
我们感谢ICAR EFC项目“利用基因组编辑工具增强气候适应性和确保食品安全”（项目编号：12-197-K）对本研究的支持。同时感谢ICAR-IARI的Phytotron设施为我们提供了培育转基因植物的空间。我们也衷心感谢加州大学戴维斯分校的Shahid Siddique博士和Bardo Castro博士为本研究提供了宝贵的指导，帮助我们选择了合适的基因靶点。
作者声明没有潜在的利益冲突。与此文章相关的印度专利已提交（申请编号：202611000034）。
