通过天然质谱技术阐明HLTF介导的DNA叉状结构重塑机制

《Journal of the American Chemical Society》：Elucidating HLTF-Mediated DNA Fork Remodeling via Native Mass Spectrometry

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复制叉逆转（RFR）是一种关键的DNA损伤耐受机制，通过重塑DNA叉结构来保护基因组稳定性。类似解旋酶的转录因子（HLTF）是RFR过程中的关键成分之一，它通过其ATP酶活性将停滞的复制叉转化为四路反向叉。尽管有大量生化证据描绘了HLTF的生物活性，但关于其如何与DNA分子在分子和功能上相互作用的信息却非常有限。在这项研究中，我们利用原位质谱（MS）技术来探测HLTF-DNA复合物的化学计量比，并阐明其与DNA叉重塑的功能关联。我们发现，HLTF以单体形式存在，对底物ATP的亲和性较低，但仍保持DNA叉结合活性。有趣的是，在DNA叉存在的情况下，单体HLTF会形成一种异源蛋白质-DNA复合物，从而增强其对ATP的亲和性，这表明DNA叉相互作用通过别构机制调节了HLTF的结构。通过使用同源和异源DNA叉，我们进一步发现了ATP诱导的HLTF二聚化现象，并证明了其在触发HLTF解旋活性及随后的DNA叉退化中的关键作用。总的来说，我们的发现为这种DNA重塑蛋白的分子机制提供了独特的见解，并突显了原位质谱在探测蛋白质-DNA复合物宏观组装方面的实用性。

引言
复制叉逆转（RFR）是一种应对复制压力并保障基因组稳定性的关键机制。在RFR过程中，来自蔗糖非发酵家族2（SNF2）的DNA叉重塑蛋白起着重要作用，它们将停滞的三路DNA连接转化为四路结构，稳定复制叉，防止双链断裂等灾难性后果。(1) 类似解旋酶的转录因子（HLTF）属于SNF2重塑蛋白中的RAD5/16亚组，通过ATP水解催化RFR。(2,3) 人类HLTF由两个保守的ATP酶结构域组成，中间有一个RING结构域，用于其ATP酶活性。此外，HLTF的N端还含有HIP116、Rad5p N末端（HIRAN）结构域，该结构域通过将ATP酶马达结构域定向至停滞的复制叉上来帮助启动复制叉重塑。(4,5) 尽管HLTF作为DNA叉重塑蛋白具有重要的生物学意义，但目前尚无其全长或HLTF-DNA复合物的高分辨率分子结构。传统的生化方法（如电泳迁移率测定法（EMSA）在揭示不同DNA底物上各结构域的功能和复制叉退化活性方面发挥了重要作用。(4?9) 然而，这些方法无法解析HLTF-DNA相互作用的关键方面，如复合物的异质性、化学计量比和结合动力学。鉴于这些相互作用的多样性，需要一种能够提供详细分子信息的方法。

原位质谱（MS）作为一种强大的技术，在非变性条件下能够快速、直接且敏感地表征生物分子相互作用。(10,11) 与传统的生化方法（尤其是EMSA）相比，原位质谱在探测蛋白质-DNA复合物时具有独特优势，包括复合物的异质性、(12?16) 结合特异性、(13,15,17?21) 以及化学计量比。(13?24) 在本研究中，我们扩展了原位质谱的应用范围，以探讨-HLTF（一种重塑蛋白）与DNA叉底物之间的相互作用。在将原位质谱应用于蛋白质-DNA复合物时，一个主要的技术挑战在于DNA的高度多阴离子性质，这有利于在负离子模式电喷雾离子化（ESI）中进行电离，而完整的蛋白质分析通常在正离子模式ESI下进行，从而造成了固有的不兼容性。最近一项关于DNA组装的研究表明，可以使用正离子模式ESI来表征DNA纳米结构；(25) 然而，正电荷可能对DNA复合物的气相结构有更强的影响。(26) 在此研究中，我们展示了使用正离子模式ESI期间的原位质谱技术，以保持DNA叉的完整结构，并阐明了蛋白质介导的DNA叉重塑过程，以HLTF与DNA叉底物的相互作用为例。

我们生成了一系列DNA底物，包括异源叉（HetF）和同源叉（HomoF），这些底物模拟了细胞中的复制叉，有助于监测HLTF的解旋和叉逆转活性。与之前主要研究简单单链或双链寡核苷酸的原位质谱研究不同，(26) 我们合成的DNA叉结构包含一个三路连接点，含有互补或非互补的新生链，有效代表了停滞复制叉中的亲本链和新生链，为探测DNA-蛋白质相互作用和叉重塑提供了强有力的模型。利用原位质谱技术，我们在气相中保持了非共价DNA叉复合物和DNA-HLTF复合物的完整性，从而能够准确评估相互作用动力学和化学计量比。我们的研究结果表明，DNA结合会引发HLTF的构象变化，显著改变其核苷酸亲和性并促进其功能性二聚化。这些发现揭示了HLTF介导的DNA重塑的关键机制，并强调了原位质谱在研究复杂DNA-蛋白质相互作用方面的实用性。

结果与讨论
HLTF对ATP的亲和性较低
为了探究HLTF介导的叉重塑的分子机制，我们首先尝试纯化全长重组HLTF。将全长HLTF表达构建体导入Expi293F细胞中，然后通过串联亲和层析和凝胶过滤法纯化该蛋白（图S1a）。在质谱分析之前，我们验证了纯化HLTF的叉重塑活性以确保其功能性。叉逆转实验使用含有82个核苷酸新生链的HomoF82底物进行（表S1和S2）。在这些实验中，HLTF催化了亲本链的解旋和子链的退火，生成了可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并观察到的亲本和新生双链DNA（图S1b）。如预期，HLTF以浓度依赖性和ATP依赖性方式促进叉逆转（图S1c和S1d）。

为了研究HLTF的分子机制，我们首先使用原位质谱技术对纯化的重组HLTF进行了表征。重组HLTF的质谱图清楚地显示其单体状态，测得质量为117,275.2 ± 1.1 Da（图1a和表S3）。有趣的是，观察到一系列质量约为78 Da的卫星信号，这提示可能存在蛋白质磷酸化现象（图S1e）。为了验证这一点，我们将重组HLTF与λ-磷酸酶（λ-PP）共同孵育，处理后的质谱图显示质量显著减少，证实了之前的报道（图S1e）。(27,28)

接下来，我们研究了HLTF的核苷酸结合特性。通过比较HLTF与ATP及其类似物的结合情况，我们发现HLTF仅与ATP有中等程度的相互作用，解离常数（Kd）为52.8 ± 12.4 μM（图1b）。(29,30) 基于单个浓度点的结合平衡，AMP-PNP的Kd估计为94.5 ± 19.8 μM（图1c）。有趣的是，ATPγS和ADP对HLTF的亲和性明显更高，Kd分别为6.7 ± 1.9 μM和2.4 ± 0.4 μM（图1d,e）。这些核苷酸结合亲和性的差异表明，γ-磷酸的几何结构或静电分布可能是影响HLTF核苷酸结合亲和性的因素。总体而言，我们的结果表明，HLTF可能在结构上处于非活性状态，对ATP的亲和性较低，这意味着激活HLTF需要额外的结构机制。

将三路同源DNA叉转化为两条退火链的体外过程是HLTF介导的叉逆转的标志（图S1b）。(1,4,6,31) 然而，目前还不清楚HLTF如何与其DNA底物精确相互作用以催化这一过程。我们使用四种合成寡核苷酸构建了一个模拟复制叉，以研究HLTF与DNA叉之间的相互作用。首先，通过使互补的30个核苷酸长的子链与60个核苷酸长的亲本链退火来创建两个突出端DNA。随后，第二次退火将两个互补的突出端DNA连接在一起，形成了HomoF30，这是一种包含30个核苷酸长的亲本链双链和两个30个核苷酸长的臂的模拟叉结构，这两个臂分别代表叉的前导链和滞后链，类似于细胞中的实际情况（表S1和S2）。先前的研究已经证明原位质谱适用于表征三链体和G-四链体等更高级别的DNA结构；然而，在DNA叉分析方面进展有限。(25,26) 为了优化DNA叉的分析条件，我们首先研究了不同挥发性缓冲液的影响。将HomoF30的缓冲液分别更换为碳酸氢铵（NH4HCO3）、醋酸铵（NH4OAc）和乙酸三乙胺（TEAA），每种缓冲液的浓度均为350 mM（图2a–d和表S3）。在正离子模式下，原位质谱显示出明显的双链亲本DNA（d60）、新生DNA（d30）产物和突出端DNA（s60-s30）信号，表明在碳酸氢铵溶液中叉结构的稳定性较低（图2a）。相比之下，在醋酸铵或TEAA条件下，叉的解体程度最小，说明这些缓冲液能够在溶液和气相转化过程中保持DNA叉的完整性（图2b,d）。

有趣的是，在相同的仪器设置下，不同的缓冲液组合产生了不同的电荷状态分布（CSDs）。从醋酸铵溶液中观察到的电荷范围为11+至13+，与基于DNA的经验方程式预测的理论主电荷状态12.0+相符（图2b和实验部分），而同等质量的蛋白质则显示出更高的电荷状态14.1+。（26）根据分子动力学模拟和离子迁移率谱分析，更紧凑的DNA结构对应于较低的CSDs。（32）在碳酸氢铵溶液中观察到的中等电荷增加（13+至16+）表明DNA处于扩展或松弛的构象（图2a）。相比之下，TEAA具有显著的电荷降低效应，产生的电荷状态介于6+至8+之间，与其先前报道的降低蛋白质电荷的特性一致（图2d）。(33,34) 有研究表明，DNA分子在ESI过程中的电荷机制与蛋白质相似，其电荷状态在溶液相中是脱钩的。为了验证这一点，我们在pH 4条件下进行了质谱分析，发现DNA叉的CSD（11+至13+）保持不变（图S2a）。HomoF30在负离子模式ESI下的分析也得到了类似的CSD（11–至13–），与正离子模式ESI结果一致（图S2b）。综合来看，我们的结果表明CSDs与DNA叉结构之间存在关联，无论ESI极性和pH环境如何。

为了进一步评估DNA叉的气相稳定性，我们引入了高能量碰撞解离（HCD）技术。通过逐步提高HCD细胞的激活电压，我们发现DNA叉结构在75 V电压下仍然保持完整（图2c）。然而，在100 V电压下，光谱质量显著下降，表明在高激活条件下DNA叉发生部分解体或片段化（图S2c）。我们的研究结果支持正离子模式ESI在探测HLTF-DNA叉相互作用中的适用性，因此选择了醋酸铵作为后续的天然MS实验溶剂，以保持DNA的结构并确保与蛋白质分析的兼容性。尽管先前的研究表明HLTF的HIRAN结构域能够识别单链DNA的3′-羟基末端并结合双链DNA（4,5,8,9,35），但全长HLTF如何与DNA叉形成复合物则了解较少。为了阐明HLTF与DNA叉之间复合物形成的机制，我们首先在无ATP的情况下研究了它们的相互作用。通过优化实验条件，包括HLTF/DNA叉混合物的摩尔比、反应时间、挥发性缓冲液的浓度、ESI的极性和离子传输等，我们成功记录了HLTF-DNA叉复合物的天然MS谱图（图3a和表S4）。除了主要的1:1 HLTF-DNA叉复合物外，我们还检测到了一个次要但分辨率较高的2:1 HLTF-DNA叉复合物。1:1和2:1复合物的CSD分别为22+至27+和32+至34+，这与蛋白质的预计主要电荷状态（1:1复合物为25.3+，2:1复合物为33.2+）相符，而非DNA的预期电荷状态（21.7+和28.4+）。考虑到蛋白质-DNA复合物的CSD会根据其性质而变化，我们推测HLTF结合后暴露的负电荷得到了有效屏蔽，从而减轻了正离子模式ESI中对DNA通常观察到的压缩效应。

图3：无ATP条件下HLTF-DNA叉复合物的天然MS分析。(a, b) 代表性质谱图显示了HLTF与HomoF30 (a) 和HetF30 (b) 形成的复合物。观测到的物种的化学计量比被归类为1:1和2:1 HLTF-DNA叉复合物。(c) 与ATP共孵育的HLTF-HetF30复合物的天然MS分析。HLTF（2.5 μM）和HetF30（5 μM）在室温下孵育20分钟后，将缓冲液更换为醋酸铵（350 mM，pH 7.0），并在MS分析前加入与HLTF等摩尔的ATP。内嵌图展示了24+电荷状态的放大视图，突出了1:1 HLTF-HetF30复合物的apo形式和ATP结合形式。每个DNA叉结合实验均进行了三次独立重复。

DNA叉新生链的序列同源性已被报道为HLTF介导的叉反转的关键组成部分（4,6）。为了研究其在HLTF-DNA叉复合物形成中的作用，我们设计了HetF30，其结构与HomoF30相同，但上前导链和滞后链之间缺乏序列互补性（表S1和S2）。天然MS分析显示HLTF仍能与HetF30形成1:1复合物，而更显著的2:1复合物也被观察到（图3b）。这些结果表明，HLTF识别停滞的复制叉并不需要DNA序列的同源性，且HetF30再现了与HomoF30观察到的类似模式。

质谱分析揭示了HLTF-DNA叉复合物中ATP的可访问性增强。HLTF与DNA叉之间的ATP独立复合物形成表明，DNA结合本身是HLTF激活的关键步骤。鉴于HLTF单体对ATP的结合亲和力较低（图1b），我们接下来检测了DNA结合是否调节了HLTF对ATP的访问能力。这一观点与先前的研究结果一致，即HLTF的ATP酶活性需要DNA底物（4）。HetF30的非互补链序列预计会阻止HLTF介导的叉反转，从而使得能够捕获HLTF-DNA复合物中的ATP结合。

为了探测HLTF-DNA叉复合物的ATP结合，我们将重组HLTF在与图3b中描述的相同条件下与HetF30共孵育，并在MS分析前立即提供ATP以避免其被HLTF水解。质谱图显示了一个明显的物种，对应于ATP结合的HLTF-DNA叉复合物。定量分析显示，当HLTF与DNA叉以等摩尔比结合时，ATP结合的HLTF相对丰度从单独HLTF的6.1%（相对于其100% apo形式）增加到46.6%，表明在DNA叉结合后ATP的访问能力显著增强。ATP结合的HLTF-DNA叉复合物的估计Kd值为7.2 ± 0.9 μM，表明ATP与HLTF-HetF30复合物的结合亲和力更高（图3C）。尽管全长HLTF的结构细节尚未可知，但对Saccharomyces cerevisiae中的Snf2马达结构域的研究表明，它具有两种构象：结合ADP时为开放态，结合ATP类似物ADP-BeFx时为闭合态（36）。DNA底物的结合使结构平衡向闭合构象偏移，从而增加ATP酶活性。我们推测HLTF可能具有类似于Snf2的调节机制，通过与DNA叉相互作用来控制其构象和活性。

生化研究表明HLTF的ATP酶活性与DNA叉重塑之间存在强烈关联（5,6）。鉴于质谱能够捕获HLTF-DNA叉复合物，我们接下来研究了其与ATP诱导的叉反转相关的化学计量调节。重组HLTF和HomoF30的混合物在MS分析前与ATP共孵育。获得的质谱图分辨出了多种蛋白质-DNA复合物的质量物种（图4a）。除了在无ATP条件下观察到的1:1 HLTF-HomoF30复合物外，还在ATP存在的情况下检测到了与双链亲本DNA（d60）或新生DNA（d30）形成的HLTF复合物，表明在DNA叉重塑过程中形成了中间复合物（图4a）。这些中间复合物与HLTF的生化活性一致，后者能够将同源DNA叉重塑为双链产物（图S1b–d）。有趣的是，在ATP孵育后检测到一个主要的质量物种，相当于由两个HLTF和一个d30组成的复合物，表明HLTF的二聚化在DNA叉重塑中起功能作用。

图4：天然MS揭示了ATP诱导的HLTF-DNA叉复合物的化学计量调节。(a) 在ATP存在下孵育HLTF和HomoF30，显示出多种复合物，分别对应于(i) 单体HLTF，(ii) HLTF–d30复合物（1:1），(iii) HLTF–d60复合物（1:1），(iv) HLTF–HomoF30复合物（1:1），(v) HLTF–d30复合物（2:1），以及(vi) HLTF–HomoF30复合物（2:1）。右侧面板展示了质量域的解卷积谱图。(b) ATP诱导HLTF与HetF30复合物的二聚化。右侧面板呈现了解卷积的质谱图。(c) 不同化学计量比下的HLTF–HetF30复合物的定量分析显示，ATP处理后HLTF的二聚化增加。数据为三次重复的平均值±标准误差。(d) 在叉反转实验中，与HLTF-DEAA突变体竞争会降低野生型HLTF的活性，表明HLTF二聚化对叉反转的重要性。数据为三次重复的平均值±标准误差。(e) 解释了ATP依赖的HLTF在叉重塑过程中的二聚化示意图。未配对t检验，**P < 0.01。

为了验证在添加ATP后HomoF30中的二聚化现象，我们进行了类似的实验，即在ATP存在下将HLTF与HetF30共孵育。我们之前已经证明HetF30在没有ATP的情况下表现出与HomoF30相似的结合模式。其异源序列阻止了HLTF执行叉反转，因此是研究HLTF-DNA叉复合物化学计量调节的理想底物。所得质谱图显示，HLTF-HetF30复合物的化学计量比与无ATP条件下的相似，没有检测到重塑产物（图4b）。然而，2:1和1:1复合物之间的强度比显著增加，表明在ATP处理后HLTF的二聚化增强（图4c）。

考虑到在HetF30底物存在下HLTF的二聚化增强以及与二聚体HLTF结合的解离HomoF30复合物的存在，我们试图测试HLTF二聚化与叉反转活性之间的功能联系。这里我们使用了ATP酶失活的HLTF-DEAA突变体，该突变体已被证明没有叉反转活性（5,6）。我们假设如果二聚化对HLTF的叉反转活性至关重要，那么野生型HLTF与ATP酶失活的DEAA突变体之间的竞争应该会显著降低活性，因为形成的功能性二聚体会减少。这一预测得到了验证：在40分钟时间点，与2.5倍过量的DEAA竞争时活性减少了约32%，而与10倍过量的DEAA竞争时几乎完全消除了HLTF的叉反转活性（图4d）。相比之下，Escherichia coli的叉反转酶RecG在体外作为单体时，即使与其ATP酶失活突变体竞争，其活性也只有轻微的影响（37）。总的来说，我们的天然MS和生化分析表明HLTF的二聚化在DNA重塑过程中起着重要作用，其形成依赖于ATP与HLTF的结合（图4e）。

叉反转的初始步骤被认为是新生DNA链从亲本链上的解开。为了验证这一假设，我们使用含有15个异源新生链核苷酸的DNA叉进行了解旋实验（HetF15）。结果显示HLTF能够解开前导链和滞后链。正如预期的那样，ATP结合和水解对HLTF的解旋活性很重要，因为缺乏ATP或其他不可水解的ATP类似物时HLTF没有表现出任何解旋活性（图5a）。注意，使用HetF30底物时没有观察到解旋活性；我们认为HLTF可能只能解开较短的DNA链。

图5：HLTF在DNA叉底物HetF15上表现出内在的解旋活性。(a) DNA解旋实验表明HLTF仅在ATP存在下才能解开HetF15的前导链和滞后链。(b, c) 在无ATP（b）和有10 μM ATP（c）条件下，1:1和2:1 HLTF–HetF15复合物的代表性质谱图。1:1和2:1复合物旁边的卫星信号对应于缺少新生链的HLTF结合的HetF15（HetF15Δs15）。反应在室温下进行20分钟，并在醋酸铵（350 mM，pH 7）中进行MS分析。实验独立重复了三次。(d) 在DNA解旋实验中，与HLTF-DEAA突变体竞争会降低野生型HLTF对前导（左）和滞后（右）链的解旋活性，表明HLTF二聚化对解旋活性的重要性。数据为三次重复的平均值±标准误差。

为了进一步研究HLTF介导的解旋活性与短DNA叉底物之间的化学计量关系，我们接下来尝试使用质谱技术探测HLTF与HetF15之间的相互作用。首先，HLTF能够在无ATP的情况下与HetF15形成复合物。结果表明，类似于HomoF30和HetF30，HLTF仍能与HetF15形成1:1和少量的2:1复合物（图5b）。其次，当加入ATP时，质谱图显示了HLTF二聚化增加的现象（图5c）。值得注意的是，检测到了额外的质量物种，对应于缺少新生链的HetF15（HetF15Δs15）与HLTF单体和二聚体形成的复合物。HLTF–HetF15Δs15复合物的强度在ATP作用下显著增强，特别是对于2:1 HLTF–DNA叉复合物。MS结果与HLTF的解旋活性一致，表明ATP和蛋白质二聚化是这一过程的关键因素。

为了进一步确认HLTF的二聚化对HLTF解旋活性的重要性，我们在解旋实验中进行了与HLTF-DEAA的竞争。结果显示，在20分钟时间点，与2.5倍过量的DEAA竞争时，前导链和滞后链的解旋活性均降低了约50%（图5d）。总体而言，这些结果表明HLTF表现出内在的DNA解旋活性，能够作为叉反转的初始步骤解开短DNA片段。需要注意的是，尽管可以检测到单体HLTF与DNA叉的结合，但这种单体叉是否能够解开双链DNA并催化叉反转仍不清楚，因此需要进一步研究。结论：在这里，我们使用原位质谱（native MS）证明了HLTF-DNA叉组装可以在气相中保持，从而阐明了HLTF介导的DNA重塑的分子机制。质谱分析显示，在无核苷酸条件下，不活跃的HLTF能够与DNA叉结合并主要形成1:1复合物。我们的结果与之前的EMSA分析一致，即全长HLTF和DNA叉可以形成多个蛋白质-DNA复合物。值得注意的是，我们发现DNA叉本身作为HLTF完全激活的别构调节器。HLTF与DNA叉的相互作用显著增加了其对ATP的结合亲和力，可能还提高了ATP酶活性。鉴于ATP酶活性对HLTF介导的叉重塑至关重要，我们得出结论RFR受到核内停滞叉存在的严格控制。此外，质谱分析意外地揭示了HLTF的二聚化行为及其对DNA叉和ATP结合的依赖性。在ATP处理下，HLTF二聚体与来自同源DNA叉的两个新生链产物的复合物的存在，以及我们使用ATP酶失活突变体作为竞争物的生化实验，进一步突显了HLTF二聚化在DNA叉重塑中的关键作用。此外，观察到低丰度的2:1不活跃HLTF-DNA叉复合物表明，HLTF对DNA叉的识别可能涉及除了HIRAN已建立的结合新生链自由端作用之外的其他机制。需要进一步研究来定义二聚体HLTF和DNA叉的结构细节，并阐明DNA叉重塑的分子过程。总之，我们提出HLTF在结合DNA叉后会发生构象变化，这增强了其ATP结合能力和蛋白质二聚化，从而促进有效的叉回归，包括DNA解旋活性。本研究展示了原位质谱作为探测DNA-蛋白质相互作用及其功能读数的强大工具。鉴于复制应答与DNA和各种蛋白质组分（如RAD51和BRCA1/2）之间的相互作用高度协调，我们的研究为未来研究这些复杂事件的分子细节奠定了基础。实验部分：野生型人类HLTF和ATP酶失活突变体Expi293F细胞的表达与纯化根据ExpiFectamine 293试剂盒（Thermo Fisher）说明书，将pcDNA-(His)6-Flag-HLTF或pcDNA-(His)6-Flag-HLTF (DEAA)表达质粒转染到细胞中。转染后48小时通过离心收集细胞。蛋白质纯化在4°C下进行。细胞使用缓冲液A（25 mM Tris–HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 500 mM KCl, 0.01% Igepal-CA-630, 0.5 mM EDTA, 10 mM ATP, 10 mM MgCl2）裂解，并加入1 mM β-mercatose乙醇和蛋白酶抑制剂（2 mM PMSF, 2 mM benzamidine以及1 μg/mL的aprotinin、chymostatin和pepstatin A），然后进行超声处理。样品在100,000g下离心1小时以分离沉淀和上清液。上清液与Ni2+-NTA琼脂糖树脂（QIAGEN）混合并在4°C下孵育3小时。树脂用添加了1 mM β-mercatose乙醇和10 mM imidazole的缓冲液A和添加了1 mM β-mercatose ethanol和20 mM imidazole的缓冲液B冲洗。蛋白质用添加了200 mM imidazole的缓冲液B洗脱。洗脱的蛋白质用anti-flag M2亲和凝胶（Sigma-Aldrich）过夜结合。结合蛋白质的树脂用缓冲液B冲洗。蛋白质用添加了3× Flag肽（100 μg/mL）的缓冲液B洗脱。然后对洗脱的蛋白质用Superose 6 Increase 10/300 GL（GE Healthcare）凝胶过滤，并使用缓冲液C（25 mM Tris–HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 300 mM KCl, 0.01% Igepal-CA-630, 1 mM β-mercatose ethanol, 0.5 mM EDTA）进一步分离。含有纯化蛋白质的组分被收集、浓缩并储存在?80°C。同样的纯化方案也应用于DEAA突变体变体。为了进行体外去磷酸化，使用lambda蛋白磷酸酶（λ-PP, New England Biolabs）去除磷酸化。纯化蛋白质（10 μM）与200单位的λ-PP和1× MnCl2（反应试剂盒中提供）在缓冲液C中孵育30分钟。DNA叉底物制备：DNA寡核苷酸和荧光标记的DNA寡核苷酸购自Genomics。合成DNA的序列见表S1。HomoF30的制备方法是将RF1 + RF1C.30和RF2 + RF2C.30分别在退火缓冲液（50 mM Tris–HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT）中加热80°C 3分钟，然后转移到65°C 30分钟，再冷却至室温过夜。两种突出的DNA片段混合后在37°C下孵育30分钟，随后在10% TBE（90 mM Tris–boric acid, pH 8.0, 2 mM EDTA）聚丙烯酰胺凝胶上分离，切割出相应大小的产物区域，并使用Amicon ultra-4浓缩器（Millipore，NMWL 10 kDa）在4°C下通过滤膜透析到TE缓冲液（10 mM Tris–HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA）中。HomoF82的制备方法是将Cy3-RF4 + RF4C.82和RF5 + Cy3-RF5C.82分别在退火缓冲液中加热80°C 3分钟，然后转移到65°C 30分钟，再冷却至室温过夜。样品的处理过程与HomoF30相同。HetF30和HetF15的制备方法是将RF1 + RF1C.30 + RF3 + RF3C.30和RF1 + RF1C.15 + RF3 + RF3C.15这四条合成DNA链分别在退火缓冲液中加热80°C 3分钟，然后转移到65°C 30分钟，再冷却至室温过夜。样品在10% TBE–PAGE凝胶上分离并使用相同程序纯化。荧光标记的HetF15的制备方法与HetF15相同，但使用荧光标记的新生链RF1 + RF1C.15-Cy3 + RF3 + RF3C.15进行退火。叉反转测定：荧光标记的DNA叉底物HomoF82（15 nM）与HLTF在缓冲液D（35 mM Tris–HCl, pH 7.5, 1 mM DTT）中孵育40分钟，其中加入了100 mM KCl、0.1 μg/μL BSA、2 mM MgCl2和2 mM核苷酸（ATP或AMP-PNP或ADP或ATPγS）。反应混合物与2.5 μL终止缓冲液（48 mM EDTA, 0.02% SDS, 0.64 mg/mL proteinase K）混合并在37°C下孵育15分钟以停止反应。加入3 μL上样染料，然后在6% TBE–PAGE凝胶上在110 V下孵育60分钟。使用Amersham Typhoon Biomolecular Imager和Cy3 570BP20 560–580 nm滤光片分析凝胶。使用Amersham ImageQuant软件量化DNA物种的信号强度。对于叉反转竞争测定，HLTF和HLTF-DEAA突变体在添加了100 mM KCl、0.1 μg/μL BSA、2 mM MgCl2和2 mM ATP的缓冲液D中预孵育5分钟。然后加入荧光标记的叉底物HomoF82（15 nM）。在每个指定时间点收集10 μL样品，并按照上述叉反转测定的步骤进行反应终止和后续操作。使用GraphPad Prism 10.6.1的非线性单相关联模型拟合平滑曲线。DNA解旋测定：荧光标记的DNA叉底物HetF15（10 nM）与HLTF在添加了50 mM KCl、0.1 μg/μL BSA、2 mM MgCl2和2 mM ATP的缓冲液D中孵育20分钟。反应混合物与2.5 μL终止缓冲液混合并在37°C下孵育15分钟以停止反应。加入3 μL上样染料，然后在10% TBE–PAGE凝胶上在110 V下孵育60分钟。使用Amersham Typhoon Biomolecular Imager和Cy3 570BP20 560–580 nm及Cy5 670BP30; 655–685 nm滤光片分析凝胶。使用Amersham ImageQuant软件量化DNA物种的信号强度。通过从无蛋白对照的信号中减去实验样品的信号来量化解旋活性。对于DNA解旋竞争测定，HLTF和HLTF-DEAA突变体在添加了50 mM KCl、0.1 μg/μL BSA、2 mM MgCl2和2 mM ATP的缓冲液D中预孵育5分钟。然后加入荧光标记的叉底物HomoF82（15 nM）和100 nM捕获DNA（RF1C.15+RF3C.15）。在每个指定时间点收集10 μL样品，并按照上述DNA解旋测定的步骤进行反应终止和后续操作。使用GraphPad Prism 10.6.1的非线性单相关联模型拟合平滑曲线。HLTF–DNA叉复合物的形成：通过将2.5 μM纯化的HLTF与5 μM DNA叉在添加了0.1 μg/μL BSA和2.5 mM MgCl2的缓冲液D中在室温下孵育20分钟来形成HLTF–DNA叉复合物。为了捕获DNA叉重塑的中间产物或最终产物，在相同条件下在孵育缓冲液中加入10 μM ATP。孵育后，根据说明书使用Zeba spin desalting column（40 K MWCO；Thermo Fisher Scientific）将样品缓冲液交换为挥发性缓冲液（350 mM ammonium acetate）。为了测试ATP对HLTF–DNA叉复合物的结合亲和力，在缓冲液交换后向样品中加入2.5 μM ATP和MgCl2，并立即进行原位质谱分析。原位质谱分析：使用改良的Q-Exactive质谱仪（UHMR，Thermo Fisher Scientific）分析HLTF与DNA叉的结合，将纯化的HLTF与合成DNA叉以1:1到1:3的摩尔比在4°C下的蛋白质缓冲液（35 mM Tris–HCl, pH 7.5, 100 mM KCl, 2 mM MgCl2）中孵育至少20分钟。蛋白质样品缓冲液交换为350 mM ammonium acetate缓冲液，加载到自制金涂层发射器上，并电喷雾进UHMR。质谱参数包括喷射电压1.2–1.4 kV；毛细管温度200°C；S-lens RF级别200；分辨率6250–12,500。为了优化高质量范围内的离子传输，在质谱仪中施加了温和的电压梯度（注射平顶杆、中间平顶杆和传输多极杆：分别为5.0, 4.0, 2.0, 和2.0 V）。为了促进脱溶和解离加合物，在源头施加了CID 0到50 V，源头捕获?50到?150 V，以及HCD碰撞能量0到50 V。RAW文件使用Thermo Xcalibur Qual Browser（版本2.0.3）和UniDec（Universal Deconvolution）软件（版本8.0.3）手动处理以进行强度量化。测量误差表示相同质量物种在不同电荷状态下的峰中心差异。复合物的主要电荷状态分别根据以下公式估计：eq 1（蛋白质）和eq 2（DNA）：(26)????=0.048×??0.52Zp=0.048×m0.52(1)????=0.041×??0.52Zd=0.041×m0.52(2) 单点法计算Kd值：为了评估各种核苷酸的结合亲和力，将纯化的HLTF或预孵育的HLTF–DNA复合物使用Zeba spin desalting column（40 kDa MWCO；Thermo Fisher Scientific）缓冲液交换为挥发性缓冲液（350 mM ammonium acetate），并通过280 nm处的UV吸光度确定蛋白质浓度。缓冲液交换后加入指定浓度的核苷酸。获取质谱，并使用UniDec量化配体结合物种Ab(PL)和未结合物种Ab(P)的相对丰度。观察到的结合比 R 是按照公式 3 计算得出的：??=????(????)????(??)=[????][??]
随后，根据总蛋白质浓度 [P]0 和配体浓度 [L]0，利用公式 4 计算了平衡解离常数 Kd：????=[??]0???[??]0/1+??
即：Kd=[L]0R?[P]0/1+R (4)