针对鸡毒支原体的特异性检测：一种用于评估疫苗效力和监测感染的双荧光定量PCR（qPCR）方法

《Poultry Science》：Strain-Specific Detection of Mycoplasma gallisepticum: A Duplex qPCR Assay for Vaccine Efficacy and Infection Surveillance

　　彭城范|子青刘|毅徐|梦娇郭|成成张|宗义波|彦涛吴|晓荣张
江苏省动物传染病和人畜共患病预防协同创新中心，扬州大学兽医学院，中国扬州225009

**摘要**
鸡毒支原体（MG）是家禽的主要病原体，对全球家禽产业造成了巨大的经济损失。目前，使用减毒活疫苗进行接种是控制鸡毒支原体感染的核心策略。在中国，官方批准用于家禽的MG疫苗株包括F-36、TS-11和6/85。接种疫苗后，需要有效的方法来评估疫苗株的定植情况，并区分野生型感染和疫苗株感染。为了解决这一未满足的需求，我们开发了一套基于MGB探针的快速、特异性的双链定量PCR（qPCR）方法。该方法可以区分野生型MG和目前使用的三种主要疫苗株，用户可以根据实际生产中采用的疫苗株选择相应的特异性双链组合。首先，我们比较了野生型MG和疫苗株的全基因组序列，并成功识别出菌株特异性的多态性位点。接下来，我们设计并优化了针对这些多态性位点的特异性引物和MGB探针。利用这些开发的引物-探针组合，我们建立了三种独立的双链qPCR检测方法，每种方法都可以同时检测一种特定的疫苗株和野生型MG。验证实验确认，这三种方法都具有高特异性、敏感性和重复性。当应用于从临床鸡咽拭子样本中提取的DNA时，该方法能够成功区分野生型MG感染和疫苗株暴露。总之，这种新型检测方法为MG监测、MG根除计划和疫苗效力监测提供了有价值的技术工具。

**引言**
鸡毒支原体（MG）感染可导致鸡慢性呼吸道疾病（CRD）和火鸡传染性鼻窦炎（Chen等人，2026年）。MG感染的临床症状包括呼吸啰音、咳嗽、鼻分泌物和结膜炎，火鸡常会发展成眶下窦炎（Levisohn和Kleven，2000年）。即使接受抗生素治疗，MG感染也被认为是永久性的（慢性）。与其他病原体（包括滑液支原体（MS）、新城疫病毒（NDV）、传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）和大肠杆菌）的并发感染可能导致更严重的气囊炎和加重的呼吸道症状（Bradbury，1984年；Kleven等人，1978年）。MG是威胁全球家禽产业的最具影响力的病原体之一，其感染在全球范围内都有报道。世界动物卫生组织（WOAH）已将MG列入其官方报告动物疾病名单。MG可以在家禽群体中通过垂直和水平传播。在种鸡群中，MG感染会增加淘汰率，降低产蛋量和孵化率，从而导致每年巨大的经济损失，同时也对国际家禽贸易产生负面影响。在许多建立了完善的控制和根除计划的国家，商业种鸡群保持无MG感染状态，而从无MG的种鸡场采购的肉鸡群也同样保持MG阴性（MSD兽医手册，2025年）。此外，血清流行率调查显示，相当比例的商业蛋鸡群也是MG阴性的；例如，在荷兰，商业蛋鸡群的MG血清流行率在17年内从6.3%下降到1.9%（ter Veen等人，2021年）。然而，在MG仍然流行的国家或地区，以及未能维持MG阴性状态的鸡群中，减毒活疫苗是控制家禽群MG感染最有效的方法之一。目前全球最广泛使用的三种商业许可的减毒活MG疫苗是F株、TS-11株和6/85株。接种疫苗后，活疫苗株会附着并定植在家禽的呼吸道中，主要诱导黏膜免疫。除了诱导黏膜和细胞介导的免疫外，减毒活MG疫苗还可以通过竞争排斥作用提供保护，即疫苗株定植在呼吸道中并竞争附着受体和营养物质，从而防止野生型的建立（Levisohn和Kleven，1981年；Turner和Kleven，1998年）。在家鸡场持续应用减毒活疫苗可以逐渐取代循环中的野生型菌株，最终实现农场内野生型MG的根除（Kleven等人，1990年；Turner和Kleven，1998年）。尽管减毒活疫苗效果显著，但它们引入了一个关键挑战：减毒活疫苗的接种会改变宿主抗体水平，使得通过传统的血清学方法无法区分疫苗株和野生型菌株感染。为了解决这个问题，已经开发了针对野生型和疫苗株之间遗传差异的分子检测方法以实现准确区分（Hong等人，2005年；Sulyok等人，2019年；Xin等人，2026年）。迄今为止，已经获得了多种MG野外分离株和所有三种商业疫苗株（F、TS-11和6/85）的全基因组序列，并确定了几个用于区分检测的野生型和疫苗株之间的特定遗传差异。传统的区分方法包括随机扩增多态性DNA（RAPD）、任意引物PCR（AP-PCR）和扩增片段长度多态性（AFLP）。然而，这些方法通常需要先分离病原体，耗时较长，不适合大规模临床检测。为了克服这些限制，已经建立了更方便和更快速的分子方法，包括高分辨率熔解（HRM）分析、错配扩增突变检测（MAMAs）和实时定量PCR（qPCR）（Callison等人，2006年；Raviv和Kleven，2009年）。

本研究开发了一套双链荧光定量PCR（双链qPCR）方法，可以区分MG野生型菌株和疫苗株，并实现每种目标菌株的特异性检测。我们分析了MG野生型菌株和疫苗株的全基因组序列，筛选出菌株特异性的多态性位点，并整合了先前文献中报道的差异位点。基于这些确定的特异性位点，我们设计了多组特异性引物和Minor Groove Binder（MGB）探针，最终筛选出四组最佳引物-探针组合。每组引物-探针组合可以分别特异性检测野生型菌株或三种疫苗株中的其中一种。通过将野生型特异性引物-探针组合与三种疫苗株特异性引物-探针组合分别配对，我们成功建立了三种双链qPCR检测方法，每种方法都可以同时检测两个目标。当将这些建立的检测方法应用于临床样本检测时，它们能够根据农场使用的疫苗类型成功区分野生型野外菌株和疫苗株。

**材料与方法**
**鸡毒支原体菌株**
Rlow菌株（登录号CVCC1651）从中国兽医微生物培养与管理中心（CVCC）获得。减毒活MG疫苗株（F-36、TS-11和6/85）由合作养鸡场（制造商：F-36，青岛亿倍生物工程有限公司；TS-11，Australian BioResources Pty Ltd，Vaxsafe? MG；6/85，MSD Animal Health，MYCOVAC L?）提供。
本研究中包含的所有MG菌株的基因组序列（及其登录号列于表1）均从NCBI GenBank数据库中检索获得。

**表1. NCBI中的MG分离株和疫苗株**
| 菌株 | 登录号 |
|------|------|
| Rlow | AE015450 |
| F-36 | CP173072 |
| TS-11 | CP044225 |
| 6/85 | CP044224 |
| S6 | CP006916 |
| Rhigh | CP001872 |
| NCTC10115 |
| LS99 | 1952 |
| mx-4 | CP044226 |
| NY01_2001.047-5-1P |
| CP003509 | NC08_2008.031-4-3P |
| CP003513 | CA06_2006.052-5-2P |
| CP003512 | NC06_2006.080-5-2P |
| CP003511 | WI01_2001.043-13-2P |
| CP003510 | NC96_1596-4-2P |
| CP003508 | NC95_13295-2-2P |
| CP003507 | VA94_7994-1-7P |
| CP003506 | Ap3AS |
| CP044624 | f99 |
| 实验室菌株 | CP028146 |
| PG31 | WildCP143981 | G4 |
| WildCP143992 | 2266 |
| WildCP158274 | KUVMG001 |
| WildCP0706 | 222713 |
| WildCP158634 | G6 |
| WildCP143991 | Primer and Probe Design |

**全基因组比对**
使用DNASTAR MegAlign软件（DNASTAR公司，美国威斯康星州麦迪逊）进行全基因组比对，以识别野生型菌株和所有疫苗株之间的多态性位点。基于识别的菌株特异性多态性位点，我们为野生型菌株和每种疫苗株设计了特异性引物和MGB探针，其序列分别列于表2和表3中。所有引物和探针的特异性通过BLAST比对NCBI数据库进行了验证。所有寡核苷酸均由Genscript公司（中国南京）合成。

**表2. MG野生型和疫苗的特异性位点**
| 菌株 | 基因靶标 | 复数 | 来源 |
|------|------|------|------|
| Wild | CrmA | 单个 | 本研究 |
| F | CrmA | 单个 | 本研究 |
| TS-11 | CRISPR | 单个 | Kang等人，2023年 |
| 6/85 | Gap | 单个 | Sulyok等人，2019年 |

**表3. 设计的引物和探针**
| 引物/探针 | 序列（5’→3’） |
| MG-W-Uni-FC | TCTGGTGCGCCTA | A |
| MG-W-Uni-RT | ATTCTTTGGGAGCGGTTGGT | G |
| MG-W-Uni-PF | AACTGCTCCTAAG-M | G |
| MG-F36-FG | ATCACAAATTGGATTAGCTAGAACATCT | G |
| MG-F36-RG | TCTTTGGGATTAGCTATTGATGAGAACTGATCAC | G |
| MG-F36-PV | CAGTAACCCCTCGTGAT-M | G |
| MG-TS11-FT | TGGTTTTGTGGTTTGTTAAT | G |
| MG-TS11-RA | ACTCTTTACGACATCAATAGCM | G |
| MG-TS11-PV | CAGTTCCGTTTTCAAA-M | G |
| MG-6/85-F | CACGAAAGTGCATTAAGTATTGGT | G |
| MG-6/85-RG | TTTTTGGTGTTTCCTGGAGCTTC | G |
| MG-6/85-PV | CAGTTCCGTTTTCAAA-M | G |

**特异性评估**
5 mL的MG培养物（Rlow菌株、F-36菌株、TS-11菌株和6/85菌株，详细培养条件见补充文件4）分别以12,000 × g离心10分钟。使用Bacterial Genomic DNA Kit（CWBIO，中国台州）按照制造商的说明从每种培养物中提取基因组DNA。使用从Rlow菌株和三种疫苗株中提取的DNA作为模板，评估每种引物-探针组合的特异性。每种20 μL的反应混合物的组成如下：10 μL 2 × qPCR探针预混液（Vazyme，中国南京），每种正向和反向引物400 nM，每种探针200 nM，2 μL DNA模板，以及无核酸酶的水调整最终体积至20 μL。扩增反应在Bioer 9600 PLUS系统（Bioer Technology，中国杭州）上进行，热循环程序如下：初始变性95°C 5分钟，然后40个循环：95°C变性10秒，60°C退火/延伸30秒。在每个循环的60°C步骤中收集荧光信号。

**标准曲线建立、重复性和敏感性评估**
使用表3中列出的引物扩增Rlow、F-36、TS-11和6/85菌株的DNA。扩增产物通过凝胶纯化并连接到pEASY-T3克隆载体（TransGen Biotech，中国北京），然后转化到TransI-T1感受态细胞（TransGen Biotech，中国北京）。每种重组质粒的拷贝数根据质粒浓度、大小和阿伏伽德罗常数计算（详见补充文件S5）。每种重组质粒制备成十倍系列稀释液，范围从1 × 10^1到1 × 10^8拷贝/μL，用于上述反应条件下的qPCR扩增。扩增后，仪器内置软件自动生成标准曲线并计算核心参数，包括扩增效率、曲线斜率和R2。为了评估检测内和检测间的重复性，我们使用三种浓度的质粒稀释液：1 × 10^5、1 × 10^6和1 × 10^7拷贝/μL。每种浓度在检测内和检测间重复三次。最后，根据所有重复样本的Cq值计算变异系数（CV）：CV(%) = (Cq值的标准偏差 / 平均值Cq值) × 100%。

**用于区分野生型和三种主要MG疫苗株的双链实时PCR检测**
在这种检测方法中，MG野生型菌株探针和疫苗株探针被标记了不同的荧光团（表3）。通过结合针对野生型和疫苗MG菌株的引物和探针，我们建立了一种双链荧光定量PCR方法，可以同时检测野生型MG和疫苗MG菌株。经过初步筛选后，确定了建立的双链qPCR的最佳反应条件（补充材料，S1）。最佳20 μL反应系统包括：10 μL 2 × qPCR探针预混液（Vazyme，中国南京），每种野生型特异性正向/反向引物和疫苗株特异性正向/反向引物各400 nM，每种野生型特异性探针和疫苗株特异性探针各200 nM，2 μL系列稀释的模板（1 × 10^1到1 × 10^7拷贝/μL，如上所述），以及无核酸酶的水调整最终体积。热循环程序与上述协议一致。荧光信号在FAM通道和VIC通道中收集以实现双链检测。反应完成后，仪器软件自动生成标准曲线并计算相关参数，包括扩增效率、斜率和R2。

**使用临床样本的评估**
从中国山东省、江苏省、河北省和宁夏回族自治区的蛋鸡群和种鸡群中收集了总共660份口咽拭子样本。其中，200份来自接种F-36菌株的鸡群，180份来自接种TS-11菌株的鸡群，120份来自接种6/85菌株的鸡群。此外，还从未接种疫苗的鸡群中收集了160份临床样本作为阴性对照。样本在接种前或接种后8周内（产蛋前）收集，以评估接种前的野生型状态和早期疫苗株定植情况。使用热裂解方法从拭子样本中提取基因组DNA。简要来说，收集的样本离心以沉淀细胞碎片，弃去上清液，将得到的沉淀物重新悬浮在无核酸酶的水中。悬浮液煮沸10分钟，然后进行第二次离心，收集最终的上清液（含有纯化的DNA）用于后续的qPCR分析。提取的DNA用作本研究中开发的双链qPCR检测的模板，扩增在上一节描述的反应条件下进行。

**结果**
我们首先识别了MG野生型菌株和疫苗株之间的菌株特异性多态性位点，并根据这些序列设计和优化了相应的引物和MGB探针（表2、表3）。经过实验验证，我们确认野生型MG和F-36疫苗株都使用CrmA基因作为检测目标，但针对该基因内的不同株特异性多态位点。此外，我们确定CRISPR为TS-11疫苗株的株特异性标记物，而GapA为6/85疫苗株的株特异性标记物（图1）。BLAST分析验证了所选引物和探针的特异性，并确认筛选的目标基因具有MG物种特异性。

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图1. MG菌株的序列比对及株特异性引物和探针的设计。(A) 野生型；(B) TS-11；(C) F-36；(D) 6/85。对于每个菌株，多态位点以及正向引物、反向引物和MGB探针的位置均已标出。

qPCR的特异性
野生型特异性和疫苗株特异性探针均表现出高特异性。只有当使用相应目标菌株的DNA作为模板时，所有引物组合才会产生扩增曲线；而使用非目标菌株的DNA作为模板时，则未检测到扩增（图2）。进一步地，当使用其他常见禽类呼吸道病原体（包括MS、NDV、IBV和ILTV）的DNA作为模板时，也未观察到特异性扩增曲线。这一结果进一步证实了所建立检测方法的良好特异性（补充文件S2）。

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图2. 四种单plex qPCR检测野生型和疫苗株的特异性。使用Rlow（野生型）、F-36、TS-11和6/85菌株的DNA作为模板。每种检测方法仅对其目标菌株的DNA产生扩增曲线。(A) 野生型特异性检测；(B) F-36特异性检测；(C) TS-11特异性检测；(D) 6/85特异性检测。

标准曲线、重复性和灵敏度
所建立方法的检测限为10拷贝/μL，适用于野生型MG菌株和三种疫苗株。每种菌株的标准曲线均已生成，代表性扩增曲线见补充图S1。线性回归方程（补充图S2）、扩增效率和R2值总结在表4中。重复性评估显示，在 intra-assay 和 inter-assay 分析中，所有质粒浓度组的Cq值的变异系数（CV）均低于0.3%（表5）。

表4. 每种菌株的标准曲线参数（单plex qPCR）。

菌株 | 方程 | 扩增效率 | R2
--- | --- | --- | ---
野生型 | y = -3.27x + 39.28 | 102.06% | 1.000
F-36 | y = -3.32x + 39.61 | 100.05% | 0.999
TS-11 | y = -3.45x + 39.69 | 5.02% | 0.999
6/85 | y = -3.21x + 38.18 | 105.01% | 0.999

表5. MG野生菌株和疫苗株检测方法的重复性。

模板 | 质粒浓度（拷贝/μL） | Intra-assay | Inter-assay | Cq值（平均值 ± 标准差） | 变异系数（%） | Cq值（平均值 ± 标准差） | 变异系数（%）
--- | --- | --- | --- | --- | --- | ---
野生菌株 | 10^6 | 18.63 ± 0.06 | 0.30 | 18.70 ± 0.02 | 0.08
10^5 | 22.35 ± 0.01 | 0.05 | 22.34 ± 0.02 | 0.09
10^4 | 25.81 ± 0.03 | 0.10 | 25.84 ± 0.01 | 0.03

F菌株 | 10^6 | 19.00 ± 0.03 | 0.16 | 18.97 ± 0.03 | 0.16
10^5 | 22.51 ± 0.01 | 0.03 | 22.52 ± 0.02 | 0.09
10^4 | 26.02 ± 0.04 | 0.16 | 26.00 ± 0.02 | 0.07

TS-11菌株 | 10^6 | 20.80 ± 0.05 | 0.24 | 20.74 ± 0.02 | 0.07
10^5 | 24.75 ± 0.06 | 0.25 | 24.88 ± 0.07 | 0.28
10^4 | 27.97 ± 0.07 | 0.25 | 28.00 ± 0.03 |

6/85菌株 | 10^6 | 18.60 ± 0.00 | 6.03 | 18.60 ± 0.02 | 0.08
10^5 | 21.91 ± 0.04 | 0.16 | 21.88 ± 0.03 | 0.12
10^4 | 25.23 ± 0.06 | 0.07 | 25.20 ± 0.03 | 0.12

区分Mycoplasma gallisepticum野生型和疫苗株的双plex qPCR方法
所建立的双plex qPCR检测方法能够同时检测野生型和疫苗株（补充图S3）。为了评估检测方法的性能，使用从10^1到10^7拷贝/μL的系列稀释质粒生成了标准曲线。所有检测方法的检测限均为10拷贝/μL。所有标准曲线均表现出优异的线性（R2 = 0.999），扩增效率在95.02%到105.01%之间，均在可接受范围内（表5）。代表性扩增曲线见补充图S3。

表6. 每种双plex qPCR检测的标准曲线参数（所有R2值为0.999）。

双plex检测 | 目标菌株 | 方程 | 扩增效率
--- | --- | ---
F-36/野生型 | y = -3.26x + 36.19 | 98.29%
F-36 | y = -3.51x + 37.79 | 97.16%
TS-11/野生型 | y = -3.36x + 38.14 | 98.29%
TS-11 | y = -3.39x + 37.94 | 97.16%
6/85/野生型 | y = -3.32x + 36.43 | 100.07%
6/85 | y = -3.26x + 36.07 | 102.60%

临床样本检测
我们共收集了660份来自使用不同活疫苗的农场以及未接种疫苗农场的鼻孔裂隙拭子样本。其中540份样本来自接种了F-36、TS-11和6/85疫苗的鸡群，其余120份样本来自未接种疫苗的鸡群。详细样本信息见表7。当使用F-36、TS-11或6/85菌株的DNA作为模板进行检测时，野生型特异性检测方法和相应的疫苗株特异性检测方法均检测到了阳性信号；而使用未接种疫苗鸡群的DNA进行检测时，仅野生型特异性检测方法检测到了阳性信号（图6）。值得注意的是，没有样本同时对多种疫苗株呈阳性，也没有样本同时对疫苗株和野生型菌株呈阳性。这些结果证实了所开发的双plex qPCR检测方法能够准确、快速且特异性地检测临床样本中的野生型菌株和疫苗株。

图3. 临床样本的双plex qPCR检测扩增曲线。使用从鼻孔裂隙拭子中提取的DNA作为模板。(A) 来自接种TS-11疫苗鸡群的代表性曲线。(B, C) 来自接种F-36疫苗鸡群的代表性曲线。(D, E) 来自接种6/85疫苗鸡群的代表性曲线。(F) 来自未接种疫苗鸡群的代表性曲线。所有接种疫苗的鸡群均检测到阳性信号，而未接种疫苗的鸡群仅通过野生型特异性检测方法检测到阳性信号。

讨论
Mycoplasma gallisepticum（MG）仍然是全球家禽业面临的主要挑战，因为它具有高度传染性、能够建立持续性感染，并对家禽生产性能产生严重影响。目前，控制MG的关键措施包括无Mycoplasma状态、药物治疗和疫苗接种。长期使用抗生素控制MG导致了禽类支原体分离株不同程度的抗菌素耐药性。尽管多个国家的MG分离株对几种常用抗生素的MIC值升高（Bottinelli等人，2022；Zhang等人，2022），但严格的生物安全措施结合活减毒MG疫苗接种可以有效防止病原体的传播。在已有家禽改良计划的国家，有效的流行病学监测提供了指导扑杀感染鸡群、验证根除进展和认证无MG状态所需的数据。通过这些措施，可以逐步实现MG的根除（Feberwee等人，2022）。然而，活减毒MG疫苗的应用使得流行病学监测变得复杂：有效的监测需要能够区分野生型菌株和疫苗株的特异性检测方法。目前可用的MG检测方法主要包括细菌分离和鉴定、血清学检测以及分子检测。血清学检测相对简单，适用于大规模筛查；然而，它无法区分抗体是由疫苗株还是野生型菌株引起的。细菌分离和鉴定被认为是MG检测的金标准，但耗时较长（需要4-30天才能生长），且灵敏度不高。通常，野外分离株在实验室培养基上的生长非常缓慢，限制了其在快速大规模检测中的应用（Khalifa等人，2013）。分子检测方法，包括常规PCR和实时PCR，能够快速检测MG DNA。基于此，已经开发了多种基于株特异性分子标记物的检测方法来区分野生型MG菌株和疫苗株（Xue等人，2024）。实时定量PCR（qPCR）提供了快速且灵敏的检测，非常适合大规模临床样本检测和流行病学调查。在qPCR检测试剂中，MGB探针广泛应用于核酸检测和SNP基因分型。与传统TaqMan探针相比，MGB探针更适合基因分型检测（Navarro等人，2015）。Vaxsafe?MS（MS-H菌株，Bioproperties Ltd.，澳大利亚维多利亚州Ringwood）是唯一在中国获准使用的减毒活MS疫苗。基于MS-H疫苗株与野生型野外分离株之间的遗传差异，研究人员开发了一种MGB探针方法，可以区分野生型MS菌株和MS-H疫苗株（Chen等人，2025）。该方法能够准确区分临床样本中的野生型菌株和疫苗株，有效支持MS-H疫苗的效果评估和野生型MS感染的监测。基于这一已建立的差异检测思路，我们的研究聚焦于Mycoplasma gallisepticum（MG），因为其在菌株区分方面面临更复杂的挑战。尽管MG和MS都使用具有相似保护效果的活减毒疫苗，但MG具有更多种类的商业疫苗，这使得区分野生型菌株和疫苗株更加困难。为了解决这一问题，我们建立了一种双plex qPCR方法，可以区分野生型MG菌株和三种最常用的MG疫苗株。在该方法中，设计了针对株特异性突变位的MGB探针，并通过验证确认了该方法具有优异的特异性。与现有的MG检测方法相比，我们的方法具有明显优势。之前报道的仅检测TS-11菌株的检测方法（Xue等人，2024）只能检测TS-11和非TS-11菌株，而我们的方法涵盖了市场上目前流行的三种活MG疫苗株，应用范围更广。此外，报道的四plex qPCR方法无法特异性地识别野生型MG菌株（Xin等人，2026），而我们的方法可以实现野生型菌株的特异性检测。我们方法的一个局限性是它无法检测澳大利亚野生型菌株Ap3AS，因为该基因型在中国尚未报道，且我们的检测方法在所有中国临床样本上均表现良好，因此我们认为该方法适用于其主要应用。在可能存在Ap3AS相关菌株的地区（例如澳大利亚），建议将我们的检测方法与通用MG qPCR（WOAH，2024）结合使用，以确保全面检测。实验室模拟确认该方法可以检测MG野生型菌株和疫苗株的共感染；然而，在本研究中未发现此类共感染的临床样本。已经证实F-36和TS-11疫苗株可以在鸡群间水平传播（Kleven，1981；Ley等人，1997）。未接种疫苗的鸡群可能通过相邻接种疫苗的鸡群的水平传播而感染，例如通过人员或设备的间接传播（Collett等人，2005）。需要注意的是，仅针对野生型和一种疫苗株的检测策略可能会忽略水平传播的非免疫菌株。这些通常是致病性较低的商业疫苗株，但可以使用相应的疫苗特异性引物-探针组进行识别。此外，我们方法的一个关键特点是能够检测野生型菌株和疫苗株的共感染，这对于可能存在此类复杂情况的农场特别有价值。

本研究开发的四种引物-探针组分别针对野生型Mycoplasma gallisepticum菌株和三种主要疫苗株（F-36、TS-11和6/85）。原则上，通过优化荧光标签，可以建立多重qPCR检测方法，在单次反应中同时检测野生型菌株和所有三种疫苗株。考虑到在生产环境中减毒活疫苗的实际应用，一个农场通常不会同时使用超过两种MG减毒活疫苗。因此，这些农场通常只需要使用相应的疫苗/野生型双plex qPCR检测方法来评估疫苗株定植和监测野生型菌株感染。本研究的目的是开发一种准确、快速且灵敏的区分检测方法，适用于长期临床样本检测。在满足区分检测的基本要求的同时，该方法还必须平衡检测成本和检测效率。包含更多寡核苷酸组分可能会降低检测性能并增加检测成本。因此，在全面评估后，我们选择了双plex qPCR格式进行方法开发。这一选择基于MG减毒活疫苗在生产中的实际应用特点：一个农场通常不会同时使用超过两种MG减毒活疫苗。从成本效益的角度来看，这些农场只需要使用相应的疫苗/野生型双plex qPCR检测方法来评估疫苗株定植和监测野生型菌株感染。对于特殊情况，也有相应的扩展方案。对于使用多种减毒活疫苗或更换了疫苗株的农场，被替换的疫苗株可能仍然会在繁殖区持续存在并传播（Khalifa等人，2014；Ley等人，1993）。对于这种情况，可以使用针对相应疫苗株的单plex方法进行检测，或者通过更换相应的荧光染料构建针对野生型和两种疫苗株的三plex qPCR检测方法。对于使用其他减毒疫苗株（如K5054株）的国家或地区（Ferguson-Noel和Williams，2015；Ferguson等人，2004），通过分析这些疫苗株的全基因组以识别特定目标，可以设计新的特异性引物和探针，并将其与本研究中开发的野生型特异性引物和探针结合使用，以实现区分性检测。该方法能够对野生型和疫苗株进行定性检测和定量分析。该方法的所有标准曲线均表现出优异的线性关系，回归方程的斜率范围为-2.9至-3.8，扩增效率在90%到110%之间，均符合qPCR方法的标准要求（de Gonzalo-Calvo等人，2022）。在灵敏度方面，我们的方法至少比传统PCR高100倍（Kang等人，2023），其性能接近甚至超过了现有的实时qPCR检测方法。与传统PCR相比，该方法无需后续的凝胶电泳步骤，操作更为方便，特别适合高通量临床样本检测。在检测特异性和应用性能方面，不同探针的荧光信号之间没有交叉干扰。除了能够在实验室环境中准确检测纯培养的DNA外，该方法还能准确检测实际临床样本。临床样本检测结果显示，野生型菌株感染存在于多个地理区域。为了验证该方法与不同仪器的兼容性，我们在多种主流实时定量PCR仪器上对其有效性进行了测试，包括ABI 7500实时PCR系统（Thermo Fisher，中国）和Real-Time Quantitative Thermal Cycler FMR3（Vazyme，中国）。所有测试结果均证实，该方法能够在不同平台上成功区分野生型和疫苗株。

本研究测试的大部分临床样本来自大规模养殖场的商业产蛋鸡，只有极少数样本来自种鸡或肉鸡。在样本类型方面，本研究中的样本也相对有限：大多数为鼻孔裂隙拭子，缺乏来自输卵管和大脑等器官的组织样本，而这些器官是鸡毒支原体（MG）引起全身性感染的常见部位。除了鼻孔裂隙拭子外，还测试了少量的泄殖腔拭子和气管组织样本，所有样本均为MG阴性；这些样本未纳入主要分析。现有研究表明，MG感染宿主呼吸道后，可通过血液传播到输卵管和大脑等器官，导致全身性感染，降低宿主的产蛋性能（Nunoya等人，1997），并引发神经系统症状（Wyrzykowski等人，2013）。对于未来的研究，我们提出以下建议：首先，应扩大样本采集的地理范围和宿主范围，包括更多种类的家禽（如火鸡、鸭子）以及不同年龄和品种的鸡，以全面验证本研究建立的检测方法的通用性。其次，还需要进一步评估该方法对同时感染野生型MG株和疫苗株的样本的检测性能，这将有助于全面评估该方法在实际应用中的稳定性和可靠性。

**作者贡献声明：**
- 范鹏城：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、监督、软件、项目管理、方法学、正式分析、数据管理、概念化。
- 刘子晴：项目管理、软件。
- 徐毅：正式分析、数据管理。
- 郭梦娇：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理。
- 张成成：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理。
- 博宗义：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理。
- 吴彦涛：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目管理和资金获取、概念化。
- 张晓荣：撰写——审阅与编辑、资源管理、项目管理和资金获取、概念化。

**致谢：**
- 范鹏城：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
- 刘子晴：软件、资源、方法学。
- 徐毅：验证、正式分析、数据管理。
- 郭梦娇：撰写——审阅与编辑、监督。
- 张成成：撰写——审阅与编辑、软件。
- 博宗义：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学。
- 吴彦涛：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金获取。
- 张晓荣：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理和资金获取。