植物和土壤中蛋白质的氮含量及天然15N丰度：分析方法及其生物地球化学意义

《Applied Geochemistry》：Nitrogen contents and natural 15N abundance of proteins in plants and soils: Analytical methods and biogeochemical implications

　　李松华|刘学燕
天津大学地球系统科学学院，天津300072，中国

摘要
蛋白质是有机氮（N）的关键物种。蛋白质的产生、积累和消耗机制对于理解陆地氮生物地球化学中有机氮库的性质和作用至关重要。可提取蛋白质（EPN）的氮含量和天然15N丰度（δ15N）可以为植物和土壤中蛋白质的动态提供新的见解，然而这些参数的分析方法尚未建立。在这里，我们为植物和土壤中的EPN建立了一种预处理方案，并在北京西部的东灵山森林进行了实地调查。我们推荐使用碱溶解（pH = 14）和酸沉淀（pH = 2–5）来提取和纯化植物和土壤样本中的蛋白质。在东灵山森林中，叶片和土壤中的EPN平均含量分别为7.19 ± 0.20 mg N g?1 dw和0.15 ± 0.002 mg N g?1 dw，分别占总体氮的56 ± 2%和8 ± 0.2%。叶片和土壤中EPN的δ15N平均值为?3.0 ± 0.1‰和1.6 ± 0.2‰，与相应的总体氮δ15N（?4.5 ± 0.1‰和1.9 ± 0.2‰）不同。进一步分析表明，叶片中的EPN具有较高的流动性，其15N富集是由于氨基酸转氨过程中的15N歧视作用。相比之下，EPN在土壤有机氮库中只占很小的一部分，它们相似的δ15N值反映了有机氮分解过程中的轻微分馏。我们的分析方法和对EPN的新见解为在全球变化背景下进一步探索有机氮生物地球化学中的蛋白质动态提供了基础。

引言
氮（N）是地球上生命必需的营养元素，也是影响生态功能和环境质量的关键因素[1]、[2]、[3]。尽管无机氮（如硝酸盐和铵）在总体氮中所占比例很小（通常在叶片中<5%，在土壤中<2%），但它仍然是植物和土壤系统中研究最深入的氮库[4]、[5]、[6]、[7]。相比之下，有机氮包含结构复杂的多种分子，这对全面研究天然氮成分构成了重大挑战[8]、[9]。在有机氮形式中，可提取蛋白质氮（EPN）被认为是最丰富的氮库，占叶片氮的53–82%和土壤氮的50–90%[10]、[11]。因此，EPN作为陆地有机氮库的关键组成部分，在调节生物地球化学氮循环的动态中起着核心作用。

功能上，蛋白质氮既是游离氨基酸氮（FAAN）的产物，也是其前体；它在植物和微生物中由FAAN合成（执行大多数生物功能），并在土壤中通过胞外酶分解为FAAN[12]、[13]、[14]。尽管蛋白质在土壤中构成了最大的氮库，但由于其大分子尺寸和通过有机-矿物结合的稳定性，它们对植物和微生物的直接生物利用受到限制[15]。因此，胞外酶将蛋白质分解为短肽和游离氨基酸的过程被认为是土壤氮循环和整体氮可用性的“瓶颈”[16]。这一过程的关键限制在于胞外酶的产生与蛋白质底物可用性之间的平衡[17]。大规模模式分析表明，微生物生物量是蛋白质分解的主要驱动因素，而土壤总体氮和气候因素似乎通过调节微生物库间接起作用[18]。除了在生物地球化学转化中的作用外，蛋白质氮还是种子萌发的关键营养来源[19]，并且在雨季期间是林地和落叶季风森林中木质部汁液中运输和储存的主要氮形式[20]。此外，由丛枝菌根真菌产生的胶质相关土壤蛋白被认为是一种新的陆地来源的蓝碳（即储存在沿海和海洋生态系统中的碳）[21]。到目前为止，蛋白质已被认为是红树林湿地中蓝碳的陆地示踪剂[21]、土壤健康的金属生物传感器[22]、[23]，以及基于废水的环境监测中的特定生物指示物（如淀粉酶、白蛋白和免疫球蛋白）[24]。EPN代表了蛋白质库中潜在可利用的部分，而其天然15N丰度（δ15N）特征整合了蛋白质合成、迁移和降解过程的信息，从而提供了地上氮代谢与地下有机氮动态之间的功能联系。鉴于蛋白质氮在植物-土壤系统中的核心作用，量化EPN库及其δ15N为深入理解蛋白质周转和氮循环提供了独特的机会。

最近在生态系统氮循环模型方面的进展在预测碳封存方面取得了优异的结果[25]。然而，当前的地球系统模型仍然简化了氮循环的复杂性[26]，例如简化了植物对养分的吸收偏好和植物-微生物之间的养分竞争，以及土壤有机氮库分类与碳储存的完全耦合。这些简化在全球变化背景下可能会变得特别问题重重，因为包括温度、降水量和CO2浓度在内的全球变化因素被发现可以调节土壤蛋白质的分解[18]、植物对氮的偏好[27]以及植物蛋白质的稳态[28]、[29]。因此，这一差距限制了在全球变化情景下开发稳健的陆地氮循环模型和预测能力。

植物和土壤中EPN的含量及其天然15N丰度（δ15N）可以提供直接的信息来填补上述知识空白，但目前仍缺乏测量这些参数的标准化方案。从天然植物和土壤样本中提取和纯化蛋白质的方法学难度仍然存在。到目前为止，可以通过多种方法确定蛋白质浓度，包括紫外吸收[30]、凯氏定氮法[31]、染料结合测定[32]以及酸水解后的氨基酸分析[33]等。紫外吸收在HPLC分析之外的适用性有限[34]，而凯氏定氮法无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮[35]。染料结合测定是最常用的方法，但它们受到共提取的土壤腐殖质和植物代谢物（多糖、酚类和生物碱）的干扰[36]、[37]。虽然通过酸水解定量蛋白质似乎是一种相对可靠的方法，但由于水解后氨基酸回收不完全[38]，以及来自非蛋白质来源（如肽聚糖、腐殖质、短肽和游离氨基酸）的额外氨基酸释放[39]，仍存在显著不确定性。因此，减少蛋白质浓度分析中的不确定性应集中在优化提取程序上。常用的蛋白质提取剂包括水、盐（如磷酸钠）、碱（如氢氧化钠，NaOH）和有机溶剂（如苯酚）[40]、[41]。不同的提取剂会提取蛋白质的不同部分，可能会扭曲环境宏蛋白质组的解释[42]、[43]。此外，蛋白质提取的产量受到提取剂性质（化学性质、浓度和pH值）、提取时间和固液比[44]、[45]的严重影响。粗碱提取物不可避免地含有酚类和腐殖质等杂质[46]，这些杂质会强烈干扰蛋白质浓度和δ15N的测量[37]。因此，基于蛋白质和杂质之间的不同物理化学性质，已经开发了几种纯化技术，包括沉淀、膜分离（超滤和透析）、电泳和色谱[47]。其中，沉淀和超滤在去除干扰方面特别有效[48]、[49]，为环境应用提供了有希望的基础。然而，对这些技术进行系统评估和优化以适应复杂的植物和土壤基质仍然很少。

本研究旨在探讨提取剂和沉淀剂对植物和土壤样本中蛋白质提取和纯化的效果（图1）。使用最佳方法，我们首先测量了天然叶片和土壤样本中EPN的浓度和δ15N值，并探讨了它们对植物-土壤系统中氮循环的生物地球化学意义。我们研究了北京西部东灵山森林中的中国松（Pinus tabuliformis）及其根际土壤。该物种是华北生态安全的主要造林植物，所研究的森林是中国第四大森林类型[50]。这项工作的核心目标是通过（1）开发分析EPN含量和δ15N值的最佳预处理方案，以及（2）研究简化植物-土壤系统中的EPN库和动态来阐明EPN在植物-土壤氮动态中的作用。

研究地点、样本收集和预处理
东灵山位于北京西部的门头沟区（图S1）。研究地点具有温暖温带大陆性季风气候，年平均温度和降水量分别为5°C和612毫米[51]。主要植被为落叶阔叶次生林，优势物种包括Quercus wutaishanica、Betula platyphylla、B. dahurica、P. tabuliformis和Populus davidiana。主要土壤类型为Alfisol，土壤剖面深度为50–120厘米[52]。

基于不同提取和沉淀方法的蛋白质氮含量
试剂空白组的蛋白质氮含量低于检测限（数据未显示）。对于植物和土壤，使用pH 14的碱提取方法得到的EPN含量最高（图2）。基于100%的碱提取，使用水、盐和苯酚提取的方法得到的蛋白质氮含量分别为0.7%、0.8%和55%（对于植物），以及4%、17%和27%（对于土壤）（图2）。pH 2–5的酸性条件显示出植物和土壤中蛋白质提取物的最大沉淀率。

植物和土壤中蛋白质的最佳提取和纯化
与基于水、盐和苯酚提取的方法相比，碱提取方法得到的较高蛋白质氮含量（图2a）表明提取更为完全，且蛋白质在植物和土壤样本中的碱溶性更高。类似地，在豌豆和海藻中提取的植物蛋白也观察到了较高的碱溶性[55]、[57]。主要原因归因于蛋白质的两性性质[58]。简而言之，当溶液的pH值增加时……

结论
本研究建立了一种稳健的蛋白质提取和纯化方法，用于分析天然植物和土壤中EPN的含量和δ15N值（图4）。pH 14的碱溶解和pH 2–5的酸沉淀显示出最高的回收率，因此代表了最佳的预处理方案。将这种方法应用于所研究的森林揭示了植物-土壤氮动态的关键见解。研究植物的EPN含量表明，叶片分配了大部分总体氮……

作者贡献声明
刘学燕：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、概念化。
李松华：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、方法学、调查、正式分析。

数据可用性
本研究生成和分析的数据集将在本文接受后通过Li & Liu, (2026) https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30947810提供。

利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（42330505, 42125301）的支持。我们感谢陈崇娟博士、杨克通、闫雅欣、顾白涛、秦婉晓、李慧荣、罗琳、吕友然、段超凡在本研究中的野外和实验协助。