综述：规范小鼠固有层白细胞的分离方法：为实验研究揭开肠道免疫学的层层奥秘

《Journal of Immunological Methods》：Standardizing murine lamina propria leukocyte isolation: Peeling back the layers of intestinal immunology for experimental approaches

　　安德烈·路易斯·阿莫林·达科斯塔（André Luiz Amorim da Costa）|若昂·维克托·康塞桑·索亚雷斯·德利马（Jo?o Victor Concei??o Soares de Lima）|朱莉安娜·德奥利维拉·里贝罗（Juliana de Oliveira Ribeiro）|洛林·德奥利维拉·达克鲁兹（Lorraine de Oliveira da Cruz）|朱莉安娜·盖德斯·纳西门托（Juliana Guedes Nascimento）|玛丽亚·克拉拉·马丁斯·德马托斯·阿莫林·德萨（Maria Clara Martins de Mattos Amorim De Sá）|杰苏伊诺·拉斐尔·马查多·费雷拉（Jesuíno Rafael Machado Ferreira）|卡米拉·吉马良斯-平托（Kamila Guimar?es-Pinto）|杰弗逊·安东尼奥·莱特（Jefferson Ant?nio Leite）|亚历山德拉·达尔梅达·菲拉迪（Alessandra D'Almeida Filardy）

巴西里约热内卢联邦大学保罗·德戈斯微生物学研究所（Instituto de Microbiologia Paulo de Góes）研究生院（Programa de Pós-Gradua??o em Ciências (Microbiologia)）

摘要：
肠道固有层（lamina propria）中驻留着多样化的先天性和适应性免疫细胞群体，这些细胞的动态调节对于维持黏膜免疫稳态以及对感染或组织损伤的有效炎症反应至关重要。在小鼠模型中准确描述这些细胞群体需要可靠地分离出活细胞，同时保持表面标志物的完整性。然而，固有层异质的细胞组成带来了技术挑战，分离方案的差异性导致了小鼠实验研究中可重复性的问题。特别是，酶消化显著影响细胞活力和表面分子的表达，结果取决于所选择的酶以及是否添加了脱氧核糖核酸酶I（DNase I）和/或二硫苏糖醇（DTT）。因此，标准化分离方法在免疫学领域是必不可少的，以确保能够一致地回收出适合下游分析的活免疫细胞。

为了促进实验室间的可重复性，我们提出了一份精简而全面的报告检查清单，并系统性地概述了影响小鼠固有层白细胞（LPLs）产量、活力和表型完整性的关键实验变量。

1. 引言
肠道黏膜由肠道相关淋巴组织（GALT）、固有层（LP）和上皮组成，这些部位栖息着多种免疫细胞，它们既能抵御病原体和有害抗原，又能促进对饮食成分和微生物群产物的耐受（Cesta, 2006）。肠道固有层中包含大量的先天性和适应性免疫细胞，其中后者主要表现出激活表型（Agace et al., 2000）。在固有层中驻留或被招募的免疫细胞中，专职抗原呈递细胞（APCs）、树突状细胞（DCs）、肠道巨噬细胞（IMs）和B淋巴细胞（B细胞）尤为突出，它们各自具有不同的表型和功能状态。在未成熟状态下，这些细胞表达多种抗原捕获和抗原感应受体；而在成熟状态下，它们则高表达MHC II类分子和共刺激分子。DCs和IMs专门负责抗原的获取，并具备激活幼稚T细胞和扩增效应T细胞群体的细胞机制（Cerovic et al., 2014; Geissmann et al., 2010）。B细胞能够在GALT内与特异性T CD4+细胞相互作用，并更好地产生体液反应，同时也能作为专职APCs（Chesnut & Grey, 1981; Rivera, 2001）。

DCs是关键的哨兵细胞，其独特的星状形态和激活幼稚T细胞的能力使其显得尤为重要（Steinman, 2007）。肠道内的两种主要DC群体是CD103+CD11b?和CD103?CD11b+，两者都来源于骨髓前体细胞（Guilliams et al., 2014）。由于T辅助细胞反应依赖于参与抗原呈现的特定DC亚群，因此研究这些APCs对于理解对肠道病原体的耐受性和免疫机制至关重要（Cerovic et al., 2014）。

IMs是体内数量最多的巨噬细胞群体，它们根据在肠道固有层内的位置及其与间质免疫系统的相互作用执行不同的功能（Filardy et al., 2023）。主要有三种IM群体：上皮下巨噬细胞（SEM）、黏膜下巨噬细胞（SMM）和肌层巨噬细胞（MM）。SEM存在于肠道固有层中，能够吞噬病原体、食物抗原和凋亡细胞，并促进耐受性和组织稳态（Bain et al., 2013）。SMM来源于胚胎前体细胞和早期骨髓前体细胞，支持肠道内的肠道神经元和黏膜下血管系统（De Schepper et al., 2018）。MM位于肌间神经丛中，常表达调节因子并调控肠道运动（Gabanyi et al., 2016）。

由于固有层细胞组成的异质性，标准化分离方法以保持表面分子完整性和细胞活力至关重要。这确保了在正常状态和炎症反应条件下对细胞组成的估计的准确性和代表性。目前的可重复性问题源于酶消化后细胞活力的下降，而这取决于所使用的酶以及是否添加了脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）和/或二硫苏糖醇（DTT）（Stzepourginski et al., 2015）。

本文讨论了如何处理小鼠固有层细胞分离方案及其对下游分析的优势。尽管已经描述了许多从小鼠中分离固有层白细胞的方法，但酶消化、缓冲液组成和组织处理的差异往往导致产量和亚群表示不一致。为此，我们总结了对LPL回收率、活力和表型完整性至关重要的关键变量，并提出了一份最低限度但全面的报告检查清单，以促进实验室间的可重复性。

2. 典型问题
黏膜免疫学中的一个主要未解问题在于，DC和巨噬细胞的功能主要是由发育决定还是由微环境线索决定的。可靠的细胞分离对于解决这一问题至关重要。最近的研究使用空间生物学技术明确了这些细胞在炎症和癌症过程中的空间分布（Monasterio et al., 2024; Parigi et al., 2022）。然而，定义一个表型不仅仅涉及表面标志物的定位，细胞的代谢和转录谱同样重要。

在该领域的研究中观察到了由方案引起的偏差，例如使用胶原酶或Liberase消化后的细胞产量，这对于后续流式细胞术分析的规模和可行性至关重要，尤其是当研究较少见的细胞群体时。此外，关于每种消化技术后表面标志物表达的讨论以及可能因技术问题而被忽略的亚群也引发了关注。

3. 固有层白细胞（LPL）分离方案
LPL的分离是获取用于培养、分选分析和表型/功能检测的肠道免疫细胞的标准化方法。该过程涉及多个关键步骤，这些步骤可能影响下游分析结果，且由于存在变异性而表现出显著异质性。简要而言，需新鲜采集肠道样本，去除粪便内容和多余黏液，然后使用细剪刀纵向打开组织以暴露内腔表面，并在用含HEPES和EDTA的缓冲液洗涤过程中最大化缓冲液的接触。建议在消化前使用DTT以促进上皮层脱离。消化后，在37°C下加入含有蛋白酶和DNAse I的消化液并进行振荡处理。消化完成后，将细胞置于冰上以防止进一步的酶活性并保持其活力；之后将消化后的样品过滤两次，计数活细胞并进行下游分析。

洗涤缓冲液：这些缓冲液通常被认为是不会引起重大偏差的，因为常用的缓冲液如DMEM、RPMI和HBSS总是与EDTA一起使用。这些缓冲液的缓冲性质类似，既能维持中性pH值，又能提供葡萄糖和必需的微量营养素。溶液需保持在37°C以防止洗涤过程中的细胞死亡；这一最佳洗涤温度也与室温或4°C进行了比较，结果显示在37°C时细胞活力更高（Goodyear, 2014）。

EDTA通常以1–5 mM的浓度使用，对于去除上皮细胞至关重要；虽然它没有酶活性，但其螯合特性有助于破坏细胞-细胞和细胞-基质之间的相互作用，从而方便去除上皮细胞并减少固有层制备物的污染（Davies and Parrott, 1981a）。

二硫苏糖醇（DTT）是一种还原剂，能够断裂细胞外基质蛋白和黏液糖蛋白中的二硫键，有助于破坏结肠中的第二层黏液。因此，对于结肠LPL的分离强烈推荐使用DTT（1-2 mM），但对于小肠则不一定必需。DTT必须新鲜配制，因为它在接触氧气时会迅速失去还原活性，从而影响其效果和可重复性（Gracz et al., 2012）。

DNAse I用于降解受损细胞释放的DNA，防止细胞聚集，提高用于下游应用的细胞悬浮液的产量和纯度。必须使用正确的浓度（0.1 mg/mL），因为浓度偏差可能负面影响细胞产量和活力。

酶消化：酶的选择和消化条件是LPL分离过程中变异性的主要来源，因为多种酶相关参数会影响检测结果。大多数研究使用胶原酶进行LPL分离，搅拌时间为30–60分钟；其余研究则使用Liberase，这是一种专为该类型方案优化的商业酶混合物（表1）。

表1. 涉及固有层细胞分离的所有研究中必须报告的主要信息清单。

4. 异质性
固有层的主要异质性来源如下所示，并在图1中进行了示意图说明：
- 图1. 肠道组织处理的关键考虑因素示意图。该图总结了下游分析前肠道组织解离的关键决策点，包括选择肠道段（决定是否添加EDTA的缓冲液）、是否推荐使用二硫苏糖醇（DTT）以及是否加入DNAse等。

不同肠道段的免疫反应存在显著差异（Esterházy et al., 2019），因此根据所用模型的不同，区域的选择和比较可能会影响实验结果。肠道固有层中不同频率的免疫细胞会迁移到效应部位或从效应部位返回。此外，不同肠道段具有不同的物理和生化特性，这些特性有助于防止病原体侵入和肠道渗漏。例如，结肠具有第二层黏液，经验丰富的研究人员认为需要多个洗涤步骤来获得具有代表性的细胞悬浮液（Johansson et al., 2011）。此外，回肠中的Peyer斑块数量多于空肠，导致不同的免疫组成和对病原体的不同反应（Van Kruiningen et al., 2002）。因此，在进行LPL分离时，研究人员必须明确要研究的肠道段并标准化洗涤步骤。

细胞产量和适当的采样受到肠道段大小的影响，因此标准化这些参数对于提高操作的可重复性至关重要。去除脂肪组织也很关键，因为脂肪细胞因子可能调节免疫细胞功能或导致细胞死亡（Shanmugavadivu et al., 2024）。脂肪组织中的免疫细胞具有代谢活性，如果LPL样本中含有这些细胞，可能会影响分析结果。未能有效去除脂肪组织中的CD11b+F4/80+细胞可能导致它们被无意中包含在LPL制备物中，从而夸大细胞计数并可能混淆实验结果。

上皮层的去除：在专注于上皮内淋巴细胞（IEL）的研究中，可以在LPL分离过程中分离上皮层，包括分析其组成、增殖或浸润情况。为此，EDTA通常以最高10 mM的浓度使用，以保持细胞分离，而DTT则作为还原剂在洗涤步骤中帮助细胞从基底膜上脱离。新鲜配制时，DTT作用15分钟通常就足够了；然而，如果DTT被氧化，其还原活性就会丧失（Fachi等人，2025年；Vidal等人，2025年）。酶：Liberase是由多种纯化的中性蛋白酶（如Thermolysin）与Collagenase I（Col G）和II（Col H）混合而成的产品，旨在改进单细胞分离技术。但由于成本较高，其应用范围受到限制（Linetsky等人，1997年）。这种“研究级”配方特别适合流式细胞术，因为它可以减轻单独使用纯化胶原蛋白酶（如Collagenase IV）时可能出现的变化。Liberase根据Thermolysin的含量分为低（TL）、中（TM）和高（TH）三个等级，消化活性相应提高。Collagenase仍然是最常用的酶，因为它价格低廉且容易获取，通常来源于Clostridium histolyticum。不过，它可能含有较高的内毒素水平，这对细胞培养有影响，并且不同批次之间的效果存在显著差异（Dolmans等人，2006年）。对于肠道LPL（淋巴细胞-潘氏集合淋巴结）的研究，最常用的是Collagenase IV，尽管有些实验方案使用Collagenase II处理小肠样本，或者对老年小鼠（>18个月）使用Collagenase VIII，因为这两种酶在致密组织中的蛋白分解活性更强（Shanmugavadivu等人，2024年）。细胞产量并非一个恒定指标，它受到表位降解、细胞脆弱性和分离策略的强烈影响。由于其高纯度和极低的蛋白酶污染，Collagenase D越来越多地被用作Collagenase IV的替代品。在0.5–1 mg/mL的浓度下，它对细胞表面标记物的影响很小，且不会影响体外T细胞的增殖，因此特别适合用于表面蛋白特征的研究（Autengruber等人，2012年）。一些作者提倡仅使用机械力进行分离（Lassoued等人，2024年），因为这种方法能有效地释放出足够的髓系和淋巴系细胞。然而，尽管酶可以在一定程度上影响细胞外表位，但它们也可能影响嵌入细胞外基质或滤泡中的细胞的分选效果。酶的选择会影响髓系与淋巴系细胞的比例：Collagenase D能富集来自小鼠肠道LPL的淋巴细胞，而主要使用Liberase和DNase I的酶解方法更适合从同一组织中获取髓系免疫细胞（Zhu等人，2025年）。另一方面，Shanmugavadivu及其同事在测试了Collagenase D、Liberase TL和Collagenase VIII后发现，没有一种酶对髓系细胞有选择性影响，尽管不同实验中的效果可能有所不同（Shanmugavadivu等人，2024年）。他们还指出Liberase TL会切割CD19和CD8分子，这表明该酶不适合用于B细胞和T细胞的研究（Shanmugavadivu等人，2024年）。Goodyear及其同事发现，在小鼠小肠样本中，Liberase TM和TH会对CD8α和B细胞标记物产生显著影响，并增加CD3、CD45、CD11b、CD11c和CD103组分的含量（Goodyear，2014年）。推荐的使用浓度为：Collagenase D 0.5–1.5 mg/mL；Collagenase VIII 1 mg/mL；Liberase TL 0.1–0.5 mg/mL；DNAse I 0.5 mg/mL。因此，不同分离方法之间的差异会显著影响结果的解释，研究人员必须根据需要研究的细胞类型来选择合适的酶。消化条件：消化步骤的正确标准化非常重要，因为消化不足会降低细胞产量，而过度消化则会破坏表位结构。所有上述酶的最佳工作温度约为37°C，消化时间应在30至60分钟之间。一些研究表明，旋转摇晃可以提高消化效率，通常220 rpm的转速足以使组织分离（Ivanov等人，2006年；Kang等人，2020年；Kim等人，2022年）。消化后的处理：为了去除碎片和未消化的组织，需要用膜或细胞过滤器对消化后的悬浮液进行过滤。最常用的是70 μm的过滤器，因为它既能保证足够的细胞透过率，又能防止组织聚集（Ivanov等人，2006年）。不过也有研究采用40 μm的过滤器进行二次过滤，以进一步提高过滤效率并减少细胞沉淀中的团块形成（da Costa等人，2024年；Filardy等人，2016年；Ivanov等人，2006年）。为了富集细胞悬浮液中的白细胞，建议使用40/80%的密度梯度（例如Percoll/Ficoll/OptiPrep?）来去除上皮细胞和残留的脂肪组织（Davies和Parrott，1981b；Ivanov等人，2006年；Kim等人，2022年；Weigmann等人，2007年）。由于细胞存活率是肠道白细胞分离的主要限制因素，用于分选或测序的细胞应在消化后维持在含有10% FCS的培养基中。小鼠的年龄显著影响LPL分离的效率和新鲜分离细胞的存活率。老年小鼠（>6个月）通常表现出较低的细胞存活率和髓系细胞产量。为了获得最佳结果，建议使用6至12周龄的小鼠进行分离。在处理老年小鼠时，使用Collagenase VIII可能比Collagenase D或Liberase TL更有效，因为已有研究表明这种方法能提高这些小鼠的细胞产量和存活率[参见Shanmugavadivu论文的“故障排除”部分]。下面我们提出了一个最低报告清单，该清单必须包含在任何采用LPL方法的论文的方法部分中。人类样本的应用：专为小鼠组织设计的实验方案不能直接应用于人类样本的研究，因为存在结构（黏液层厚度、上皮组织结构、固有层粗糙度、细胞外基质组成）、免疫学（空间排列、抗原暴露、表面标记物对酶的敏感性）以及微生物学差异（Gibbons，2011年；Nguyen，2015年）等方面的差异。表1提供了一份未来研究的检查清单，列出了使用LPL方法发表的论文方法部分必须包含的强制性信息。此外，还有一列非强制性的但推荐的信息，这些信息对研究也有帮助。5. 结论综上所述，分离方法的标准化对于确保获得适合下游分析的活性免疫细胞至关重要。为了促进实验的可重复性，作者应提供全面的报告清单，并系统地概述影响固有层白细胞产量、存活率和表型完整性的关键实验变量。酶的选择需要根据文献和具体研究背景进行，因为不同的酶可能会使某些细胞群体富集程度不同，从而导致技术偏倚。对于肠道固有层中的髓系细胞，研究人员应使用Collagenase IV（D）或Dispase II结合DNAse I处理；对于淋巴系细胞，Liberase或Collagenase IV + DNAse I可以提高细胞产量和存活率。结肠样本需用DTT和EDTA处理；小肠样本应避免含有派尔集合淋巴结或脂肪组织。这种方法可以提高黏膜免疫学领域的研究一致性和可信度。关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明：在撰写本稿时，作者使用了Quillbot工具辅助语言编辑和提高文本清晰度。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和修改，并对发表文章的内容负全责。作者贡献声明：André Luiz Amorim da Costa：撰写-原始草稿、项目管理、方法设计、实验设计、数据分析、概念化；Jo?o Victor Concei??o Soares de Lima：撰写-原始草稿、方法设计、数据分析；Juliana de Oliveira Ribeiro：实验设计、概念化；Lorraine de Oliveira da Cruz：可视化处理、方法设计、数据分析；Juliana Guedes Nascimento：方法设计、实验设计、数据分析；Maria Clara Martins de Mattos Amorim De Sá：可视化处理、方法设计、数据分析；Jesuíno Rafael Machado Ferreira：可视化处理、数据分析；Kamila Guimar?es-Pinto：撰写-审稿与编辑、监督、项目管理；Jefferson Ant?nio Leite：撰写-审稿与编辑、监督、概念化；Alessandra D'Almeida Filardy：撰写-审稿与编辑、监督、资源获取与资金申请。