针对特定需求的下一代测序技术：从引物设计到复杂的文库构建

《Methods》：Targeted next-generation sequencing techniques: From primer design to sophisticated library construction

　　

马克西姆·科雷尤科夫|雷吉娜·米赫耶娃|安德烈·凯钦

俄罗斯新西伯利亚化学生物学与基础医学研究所，邮编630090

摘要

靶向下一代测序（tNGS）是现代临床诊断和生物研究中的关键技术。tNGS已被临床实验室广泛采用，为全基因组测序提供了一种强大且经济高效的替代方案。尽管应用广泛，但tNGS工作流程中最复杂且最具变数的阶段仍然是目标富集，这一关键步骤确保目标分子相对于背景序列具有足够高的浓度。富集方法主要分为基于PCR的策略和基于杂交的策略，每种方法都有其独特的优势和局限性。本文从tNGS检测设计所固有的计算挑战出发，对这两种方法进行了批判性分析，并综述了现有的和新兴的富集技术，强调了它们在分子研究和临床诊断不同领域的适用性。文章中描述了许多复杂的技术，包括使用非典型氮碱基、线性DNA片段的环化、独特的分子标识符（UMIs）以及部分双链引物等。我们希望这篇综述能够促进靶向下一代测序在快速发展的分子诊断领域中的应用。

引言

下一代测序（NGS）通过实现全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）、表观遗传学分析以及靶向NGS（tNGS）等全面分析，彻底改变了生物研究的许多分支。许多人类疾病（如精神分裂症[1]、糖尿病[2]、抑郁症[3]、肥胖症[4]、心血管疾病和癌症[5]）的复杂性及多因素特性，推动了NGS作为黄金标准诊断方法的快速采用。NGS能够在单次检测中检测多种遗传和表观遗传标记，从而更全面、更深入地理解疾病机制，提高了诊断准确性和研究洞察力。技术和方法的持续进步使得NGS越来越易于使用、成本效益更高，不仅促进了研究领域的应用，也扩展到了临床实践[6]、[7]、[8]。虽然WGS可以检测整个基因组，WES专注于蛋白质编码区域，但在临床和商业环境中最广泛采用的策略是tNGS。与WGS不同，tNGS将分析范围限制在预定义的感兴趣区域（如突变热点或病原体特异性序列），这简化了检测流程，降低了成本和计算负担[9]、[10]、[11]。因此，它催生了众多tNGS文库制备流程以及商业化的即用产品，例如Foundation Medicine的FoundationOne CDx[12]、Thermo Fisher的Oncomine Comprehensive Assay[13]和Illumina的TruSight Oncology[14]。

尽管tNGS文库制备工作流程包括从核酸提取到数据分析的多个步骤，但本文重点关注技术上最复杂且最具变数的目标富集阶段。富集策略决定了检测的关键参数，包括灵敏度、特异性、覆盖深度和成本效益。然而，在计算和方法学层面都存在挑战。多重引物设计的主要计算挑战在于减少交叉杂交、二级结构形成和覆盖不平衡[15]、[16]。为克服这些技术限制，开发了多种富集策略，包括基于PCR的扩增（使用特殊引物结构）、杂交捕获、分子反转探针以及磁珠分离或聚丙烯酰胺凝胶提取等纯化技术。然而，这些实验方法的性能本质上受到引物设计计算挑战的限制[15]。因此，tNGS的发展是一个多维问题，需要创新解决方案。

我们认为，商业化已成为该技术发展的主要驱动力，但由于关键方法的专有性限制，其进步受到了阻碍。适用于小型样本组（<70对引物）的算法与针对数万个标记的商业化样本组之间的差异凸显了透明度的关键缺口。这限制了创新，严重阻碍了该领域的进展。为解决这一缺口，本文批判性地评估了当前的靶向NGS检测设计和文库制备策略，特别强调了它们在诊断多因素疾病的高度多重样本组中的适用性。此外，我们还概述了tNGS固有的主要挑战，并讨论了现有的和新兴的应对方法。

节选

富集步骤是NGS工作流程中的关键组成部分，旨在确保目标区域（ROIs）在测序文库中得到优先表示，并能与背景序列清晰区分。通过选择性地增加目标区域的比例，富集不仅提高了检测的分析性能，还最大化了测序能力的利用率，从而提高了成本效益。总体而言，富集策略

结论

靶向NGS已成为生物研究和临床诊断的基础支柱，能够对复杂的多因素人类疾病进行全面和综合分析。临床实验室和商业机构的广泛采用得益于tNGS在单次检测中检测多种标记的能力，从而提供了对疾病机制的深入理解。

主要的技术瓶颈仍然是目标富集，尤其是基于PCR的富集方法

资金信息

本研究得到了俄罗斯国家资助的ICBFM SB RAS项目（项目编号125041005115–5）的支持。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。