一种可扩展的PDMS提取方法，用于分析真菌挥发性化合物

《Fungal Biology and Biotechnology》：A scalable PDMS extraction method for profiling fungal volatile compounds

　　摘要
背景
真菌挥发性有机化合物（FVOCs）在真菌生态学、生理学和生物技术应用中扮演着关键角色，但不一致的采样和分析方法限制了生物学解释和跨研究的可比性，这突显了需要一个标准化、经过验证的工作流程的必要性。

结果
我们开发并验证了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的挥发性有机化合物分析工作流程，并在其关键方法学维度上评估了其性能，包括溶剂提取偏差、静态与动态采样、吸附剂重复使用、时间发射分辨率以及生理状态的区分能力。溶剂的选择（二氯甲烷对比乙醚）影响了单个化合物的定量回收率，但并未影响检测到的整体FVOC组成。静态PDMS采样和动态推拉采样产生了不同的但互补的挥发性谱图，不同化合物类别存在方法特定的富集现象。经过重新处理的PDMS管在多次使用中表现与新鲜管相当，没有观察到化合物回收率和多变量结构的显著下降。连续96小时的采样清晰地捕捉到了Trichoderma atroviride和Grosmannia clavigera的时间发射模式，揭示了与代谢阶段一致的物种特异性发射轨迹。应用优化后的工作流程进一步区分了T. atroviride的两种形态类型（白色对比绿色），这些形态类型在不同时间保持了不同的挥发性特征，并在关键化合物中表现出形态类型特异性的发射动态。

结论
本文提出的基于PDMS的工作流程为FVOC分析提供了一个稳健且可重复的框架，有效解决了方法学偏差问题，解析了时间发射动态，并区分了不同的生理状态。标准化PDMS采样和提取方法显著提高了FVOC数据的生物学可解释性和可比性，使其在真菌生态学、生理学和生物技术中的应用更加广泛和可靠。

背景
真菌挥发性有机化合物（FVOCs）在真菌生态学、生理学和生物技术应用中扮演着关键角色，但不一致的采样和分析方法限制了生物学解释和跨研究的可比性，这突显了需要一个标准化、经过验证的工作流程的必要性。

结果
我们开发并验证了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的挥发性有机化合物分析工作流程，并在其关键方法学维度上评估了其性能，包括溶剂提取偏差、静态与动态采样、吸附剂重复使用、时间发射分辨率以及生理状态的区分能力。溶剂的选择（二氯甲烷对比乙醚）影响了单个化合物的定量回收率，但并未影响检测到的整体FVOC组成。静态PDMS采样和动态推拉采样产生了不同的但互补的挥发性谱图，不同化合物类别存在方法特定的富集现象。经过重新处理的PDMS管在多次使用中表现与新鲜管相当，没有观察到化合物回收率和多变量结构的显著下降。连续96小时的采样清晰地捕捉到了Trichoderma atroviride和Grosmannia clavigera的时间发射模式，揭示了与代谢阶段一致的物种特异性发射轨迹。应用优化后的工作流程进一步区分了T. atroviride的两种形态类型（白色对比绿色），这些形态类型在不同时间保持了不同的挥发性特征，并在关键化合物中表现出形态类型特异性的发射动态。

结论
本文提出的基于PDMS的工作流程为FVOC分析提供了一个稳健且可重复的框架，有效解决了方法学偏差问题，解析了时间发射动态，并区分了不同的生理状态。标准化PDMS采样和提取方法显著提高了FVOC数据的生物学可解释性和可比性，使其在真菌生态学、生理学和生物技术中的应用更加广泛和可靠。

背景
真菌在其代谢过程中可以产生多种多样的挥发性有机化合物（FVOCs），这些化合物在生态学、生理学和生物技术中起着重要作用[1]。这些低分子量代谢物作为信息化学物质（由生物体产生的携带信息的化学物质），介导种内和种间信号传递，影响宿主定殖策略，并塑造真菌环境的化学特性[2]。FVOCs来源于多种生物合成途径，包括萜类、聚酮类、醇类、酮类、酯类和芳香族化合物，在从个体到物种再到群落的各个真菌组织层次上都表现出高度动态的变化[3,4,5,6,7]。这种可塑性使FVOCs成为真菌生理状态的强大指标，但它们的生物学解释受到研究中方法学不一致性的严重限制。

气相色谱-质谱（GC-MS）提供了必要的分辨率来研究复杂的挥发性谱图，但分析精度受到包括样品采集和提取在内的多个预分析步骤的深刻影响，这些步骤包括吸附和脱附[8,9,10]。尽管动态推拉采样因其灵敏度高而被广泛使用，但它引入了技术性和生物学上的伪影，包括顶空稀释、底物干燥以及长时间采样期间挥发性平衡的干扰[11]。因此，基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的被动采样成为一种有吸引力的替代方法，它结合了低成本、可重复性和对疏水性挥发物的有效富集[12,13]。尽管PDMS基挥发性有机化合物分析的应用日益增多，但该方法缺乏标准化，溶剂提取、吸附剂重复使用和采样配置（静态对比动态）存在显著異质性，限制了研究之间的可重复性。

这些方法学挑战加之真菌挥发性产物的本质动态性——生长阶段、底物利用、次级代谢的激活以及形态分化的快速变化[14,15]，使得FVOCs作为真菌生理状态的指标的作用更加复杂。然而，PDMS很少被用于能够捕捉FVOC通量的时间分辨采样，而这正是将挥发性谱图结构与生理过程联系起来的关键要求。随着真菌生物技术越来越多地依赖于表型筛选和代谢谱分析，迫切需要能够可靠区分生理和形态变异的分析工作流程[16,17,18]。在没有标准化的时间分辨方法的情况下，跨研究比较仍然薄弱，机制推断也受到限制。

在这里，我们通过开发和验证一种标准化的、可扩展的基于PDMS的真菌挥发性有机化合物分析工作流程来应对这些限制。我们系统地评估了预分析变异性的关键来源，提出了三个主要问题：(1) 核心的采集和处理参数如何影响FVOC谱图的准确性？具体来说：(a) 溶剂选择是否会影响提取效率和PDMS的偏差？(b) 静态PDMS采集是否能够捕获与动态推拉采样相同的挥发性谱图？(c) 重复使用PDMS管是否会降低回收率或改变FVOC谱图？(2) PDMS是否可以用于短期和长期的连续采样，以跟踪随时间变化的FVOC排放？(3) 优化的甲工作流程是否能够区分处于不同生理状态的真菌的挥发性谱图？

我们使用两种在系统发育和代谢上不同的真菌来测试这个框架。Trichoderma atroviride Y145因其快速生长、遗传可操作性以及从营养菌丝体到产孢绿色菌落的明确定义的发育转变而被选中，这种形态转变反映了潜在的代谢变化[19]。相比之下，Grosmannia clavigera EL035是一种生长缓慢的协同菌，与山松甲虫（Dendroctonus ponderosae）有关，它产生的挥发性谱图以醇类为主，这为在化学性质不同和排放量低的条件下测试PDMS管的性能提供了严格的挑战[20]。通过解决方法学不确定性并展示生物学敏感性，这项研究建立了一个可重复的挥发性有机化合物分析框架，增强了真菌生态学和生物技术中FVOC分析的解释和比较能力。

实验设置
PDMS管（内径1毫米，壁厚0.5毫米，外径2毫米，硬度65 A）购自McMaster-Carr（美国）。长PDMS管被切成1厘米长的段，并浸泡在100%甲醇中最多24小时[12]，然后放入玻璃小瓶中，并使用改良的热蒸发器（Pierce加热模块，Fisher Scientific）在120°C下用纯化氮气进行15分钟的调节（图S1a）。

本研究中使用的所有真菌分离株（Trichoderma atroviride Y145；两种形态类型，绿色和白色，以及G. clavigera EL035）都在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上培养[21]。生长七天后，从活性生长边缘获取菌块进行传代培养。传代培养的真菌平板放置在473毫升的VOC收集室内。在真菌平板下方放置一根无菌铜线（15厘米），使两端弯曲成90度角，并位于平板表面上方3厘米处。根据实验设计，将1厘米长的PDMS管段放置在铜线的任意一侧（图S1b）。

顶空挥发性物质的收集使用基于已知方法的改良推拉系统进行[21]。含有真菌处理的培养皿放置在473毫升的玻璃室内，并用金属盖和特氟龙胶带密封。每个盖子上安装了两对黄铜旋塞（通过Swagelok连接），以便于气流的连续流通。使用真空/压力泵（Cole-Parmer Canada Inc., Montreal, QC, CAN）和特氟龙管，以450毫升/分钟的速率将过滤后的空气（通过800毫克活性炭；6-14目；Fisher Sci., Hampton, NH, USA）推入室内并同时抽出。经过最初的24小时平衡期以允许挥发性物质积累后，收集4小时内的顶空样本。这些挥发性物质被收集在装有150毫克活性炭（6-14目）的特氟龙管中，并用玻璃棉密封（图S1c）。

FVOC提取
对于使用推拉系统收集的样本，将每个收集管中的活性炭转移到含有1毫升二氯甲烷（DCM）和0.002%十三烷的内部标准的2毫升微量离心管中。混合物振荡30秒，超声波处理10分钟，然后在4℃下以12,700rpm离心15分钟，之后将1毫升分离出的有机相转移到2毫升的玻璃气相色谱（GC）小瓶中。

从PDMS管中提取FVOC的方法是将收集到的PDMS管直接放入2毫升的GC小瓶中，然后加入0.5毫升溶剂并振荡30秒。接着使用 Pasteur 移液管将溶剂通过PDMS管冲洗10次。最初，超声波处理和离心按照活性炭提取的方法进行；然而，省略这些步骤后未观察到化合物回收率的定量差异。因此，后续提取过程中不再包括这些步骤。提取后，GC小瓶在-40℃下保存，直到进行GC-MS分析。

最初评估了乙醚（DiE）和DCM作为提取溶剂。然而，我们发现DCM的回收率更高，因此在后续实验中仅使用DCM以确保比较的一致性。所有实验变量、样本量和重复次数如表1所示。

表1 用于评估和验证基于PDMS的真菌挥发性有机化合物分析工作流程的实验设计概述

使用GC-MSS进行样本分析
样品使用配备DB-5MS UI毛细管柱（30 米长 x 0.25 毫米内径 x 0.5 微米膜，目录编号：122-5532UI；Agilent Tech, Santa Clara, CA, USA）的GC仪器进行分析，该毛细管柱连接到质谱仪（GC-7890 A，MS：5975 C，Agilent Tech）。使用氦气作为载气，流速为1毫升/分钟。GC烤箱温度程序设定为初始温度40℃（保持3分钟），然后以每分钟5℃的速率升高至210℃，随后以每分钟60℃的速率升高至300℃（保持2分钟）。样品（1微升）在220℃的进样温度下以不分流模式注入。化合物鉴定使用NIST 2017 Mass Spectral Library（版本2.3）进行。检测到的挥发性有机化合物的定量，包括单萜类和倍半萜类，基于可用的分析标准：d-柠檬烯（化学纯度：>99%）、exo-brevicomin、s-醉草酮、醉草醇、2-甲基-1-丁醇、苯乙基醇（>99%）、α-蒎烯、3-甲基-1-丁醇（>98%）、Bornyl acetate、isoamyl acetate（>97%）、acetoin（>96%）、β-石竹烯（>80%）和α-菲兰德rene（>75%）。所有标准品均来自Sigma Aldrich，除了exo-brevicomin和醉草醇来自Contech Enterprises Inc.，β-菲兰德rene（>99%）标准品来自TRC Canada。

统计分析
我们根据相应的研究问题对每个实验数据集应用了选择性的统计分析。在所有分析中，我们都遵循了下面概述的标准统计程序。首先检查数据的分布正态性和方差齐性，然后根据需要采用参数或非参数测试。我们使用预定的比较方法回答研究问题（表1）：

问题1：核心的采集和处理参数如何影响FVOC谱图的准确性？
a. 溶剂影响：从1小时采集的数据使用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析，随后使用Fisher的LSD检验进行多重比较。4天采集的数据使用Mann-Whitney秩和检验进行分析，然后进行Holm-?idák校正以进行多重比较（α=0.05）。
b. 采集方法：此实验的数据在对数转换和自动缩放后进行PCA分析，分别针对每种真菌物种进行。然后应用倍数变化分析结合Mann-Whitney检验，随后进行Benjamini–Hochberg（BH）校正以进行多重比较。结果以火山图的形式可视化，显示了不同采集方法之间的相对浓度变化。
c. 可重复性：对于这项实验，我们使用了T. atroviride Y145的绿色形态类型。之前使用的PDMS管按照上述方法重新处理，并在48小时、4天、8天和12小时时收集顶空FVOCs。为了得到处理水平的总结，我们计算了每种化合物和每个时间窗口的VOC回收率，即重复使用管中的平均丰度除以新鲜管中的平均丰度。回收率为1.0表示回收效果相当，而比率<0.8或>1.2分别被解释为潜在的回收效率损失或增加。这些比率通过条形图进行了可视化，并使用带有1:1参考线的散点图检查了处理之间的整体一致性。为了确定重复使用是否影响整体的VOC谱型而不是个别化合物，我们进行了PERMANOVA（adonis2，vegan包）测试，以检测新鲜和重复使用处理之间的VOC谱型差异，既包括所有时间窗口的组合，也包括每个时间窗口内的差异。然后使用PCA对中心和标准化的VOC丰度进行了排序，并绘制了前两个主成分图，以可视化处理之间的采样聚类。在化合物水平上，我们应用Wilcoxon秩和检验来比较每个采样窗口内的新鲜和重复使用的管子，同时使用BH程序控制误发现率。

问题2：PDMS能否用于短期和长期的连续采样，以跟踪FVOC的排放情况？为了评估T. atroviride Y145和G. clavigera EL035的VOC排放谱型随时间的变化，我们使用PDMS管在三个连续的4天窗口内收集VOCs：真菌生长的第0-4天、第4-8天和第8-12天。每次PDMS部署代表一个独立的96小时采样周期，并在每个时间点更换陷阱。对于每种真菌，通过将测量浓度除以96小时的部署时间，将VOC浓度（μg mL?1）转换为排放通量（μg mL?1 h?1）。每种真菌的浓度数据首先使用单因素ANOVA进行分析，然后进行适当的多重比较测试，以解释采样周期之间的差异。数据随后被重塑为对数格式，保留至少在一个样本中检测到的化合物。

问题3：优化的 Workflow能否区分处于不同生理状态的真菌的挥发组？在相同的条件下培养了两种不同的T. atroviride Y145形态（白色和绿色形态），其中白色形态代表营养生长期，绿色形态代表孢子形成期。收集计划和采样周期遵循问题2中描述的说明。浓度数据（μg mL?1）通过将每次测量的浓度除以相应的采样窗口持续时间（第2天的48小时，第4、8和12天的96小时）转换为近似排放通量（μg mL?1 h?1）。分析集中在由时间分层PCA（每个时间点的PC1和PC2上的主要负载）识别的驱动VOCs上。对于每种化合物，计算了每种形态×时间组合的平均通量±标准误差，并使用带有误差棒的线图可视化时间轨迹。使用Wilcoxon秩和检验在每个时间窗口内比较不同形态之间的个别化合物，同时使用BH校正进行校正。

代谢组数据分析平台Metaboanalyst 6.0用于最终FVOC浓度数据的可视化的多变量统计分析（网址：http://www.metaboanalyst.ca，访问日期为2025年9月）。所有其余的统计分析都是使用R-studio（版本2025.09.2 Build 418）进行的。

结果

溶剂影响

我们比较了使用溶剂提取与DiE和DCM从PDMS管中回收FVOC的效果。我们发现溶剂的类型对回收到的FVOC的数量有明显的影响，尽管这种影响的程度因化合物和收集时间而异。对于1小时的收集周期，两种溶剂都回收到了两种化合物；但是DCM回收的量显著高于DiE，最小二乘平均差异为0.109 μg mL?1（95% CI：0.0066–0.2114）。这两种化合物——6-氨基-α-吡酮（t = 2.25，p = 0.04，Fishers’ LSD）和β-菲兰德rene（t = 2.25，p = 0.04，Fishers’ LSD）——使用DCM回收的浓度显著更高（图1a）。

图1

溶剂类型对Trichoderma atroviride Y145的FVOC提取效率的影响。FVOCs分别在（a）第4天的1小时和（b）4天内收集。从PDMS管中的提取使用二氯甲烷（DCM）或乙醚（DiE）进行，并通过GC-MS进行量化。统计差异分别使用（a）双因素ANOVA后跟Fisher’s LSD和（b）Mann–Whitney秩和检验进行检验，使用Holm–?idák校正（p < 0.05）。条形图显示了平均值±标准误差（n = 5）。这里，6AP = 6-氨基-α-吡酮，β-Phel = β-菲兰德rene，D-Lim = D-柠檬烯，α-Phel = α-菲兰德rene。

相比之下，4天的收集周期回收了四种化合物（α-菲兰德rene、β-菲兰德rene、d-柠檬烯和6-氨基-α-吡酮）。我们没有发现两种溶剂在α-菲兰德rene和6-氨基-α-吡酮之间的差异（调整后的p > 0.05）。然而，DCM回收的d-柠檬烯和β-菲兰德rene的浓度显著更高（U = 0，调整后的p = 0.031）。总体而言，我们没有发现两种溶剂之间的任何质量差异（图1b）。

捕获方法

对于这两种真菌，PCA显示活性炭push-pull样本与PDMS提取样本在PC1上有明显的聚类（图2a，b）。在两种情况下，PERMANOVA都确认了方法驱动的强分离（G. clavigera：F = 49.56，R2 = 0.86，p = 0.007；T. atroviride：F = 50.14，R2 = 0.86，p = 0.016）。在两种真菌中，载荷向量表明分离主要是由中等到高挥发性的醇、酮和萜类化合物驱动的，这些化合物在动态push-pull收集中始终更为丰富（图2）。

图2

使用push–pull和PDMS被动采样方法收集（a）Grosmannia clavigera EL035和（b）Trichoderma atroviride Y145的4小时头空间挥发物。收集时间是从4天龄的培养物开始。彩色椭圆表示基于收集方法因素的显著聚类（PERMANOVA，p < 0.05）。

接下来，我们应用了 fold-change分析（log?FC）结合Mann–Whitney检验和BH-FDR校正，以识别在不同方法之间差异回收的化合物（图S2 a和b）。对于G. clavigera，碳push–pull采样显著富集了多种萜类化合物和高挥发性化合物（例如α-蒎烯、o-二甲苯、乙基己醇、1-丁醇衍生物；log?FC > 3–7；BH调整后的p < 0.05）。相比之下，PDMS提取只富集了少数化合物，最显著的是β-石竹烯（log?FC < -2.5；p < 0.05），这可能反映了其较低的挥发性和较高的疏水性（图S2a）。

对于T. atroviride，活性炭过滤器再次产生了大量的低分子量醇和萜类化合物（d-柠檬烯、1-丁醇衍生物、3-庚酮、α-蒎烯；log?FC = 3–10）。PDMS仅富集了少数低丰度的化合物（例如6-氨基-α-吡酮；log?FC ≈ -2；p < 0.05），这与其对非极性、半挥发性代谢物的亲和力一致（图S2b）。

重用性

重新处理的PDMS管在所有采样窗口（2天、4天、8天、12天；每种处理n = 3）中捕获T. atroviride的FVOCs的效率与新鲜管相当。对于每种化合物×时间组合，我们计算了回收率，即重复使用PDMS中的平均丰度除以新鲜PDMS中的平均丰度。大多数比率集中在1.0左右（中位数≈1.1），表明重复使用和新鲜采样器的性能大致相似（图3a）。少数低丰度化合物显示出了更大的变异性，但这种偏差在时间上并不系统，也没有一致地表明重复使用会导致回收率降低。

图3

PDMS管重复使用对FVOC回收效率的影响。 (a) T. atroviride Y145在收集间隔（2天、4天、8天、12天）内释放的14种挥发性化合物的平均FVOC回收率（重复使用/新鲜PDMS）。比率接近1.0表示重复使用和新鲜管的性能相当，而比率<0.8或>1.2分别表示回收不足或过度回收（虚线参考线）。 (b) 比较新鲜和重复使用PDMS管收集的平均FVOC丰度的散点图。落在1:1虚线上的点表明提取效率高度一致。

散点图比较了新鲜和重复使用的FVOC丰度，进一步证实了这种模式（图3b）。在所有采样窗口中，数据点紧密遵循1:1参考线，特别是对于主要化合物如6-氨基-α-吡酮、2-庚酮和2-壬酮。在早期时间点（2天和4天）的略微分散可能反映了低浓度时的相对测量噪声较高，而不是处理效果的一致性。

为了测试重复使用是否改变了整体的化学谱型，我们使用多变量分析比较了新鲜和重复处理的结果。VOC矩阵的PCA显示在每个时间点沿前两个主成分有分离的趋势，但95%置信椭圆有显著的重叠（图S3）。基于Bray–Curtis差异的PERMANOVA没有检测到处理的显著效果（F = 0.26，R2 = 0.012，p = 0.642），表明PDMS的重复使用仅解释了总组成方差的一小部分。

在化合物水平上，我们应用Wilcoxon秩和检验来比较每个采样窗口内的新鲜和重复使用的管子，同时使用BH程序控制误发现率。经过FDR校正后，没有化合物显示出显著差异（所有调整后的p > 0.45），包括主要挥发性化合物如6-氨基-α-吡酮、2-庚酮、2-壬烯、α-和β-菲兰德rene以及2-戊基呋喃（表S1）。

PDMS可以稳健地解析FVOC排放的时间序列动态

对于G. clavigera EL035，连续96小时窗口内部署的PDMS采样器捕获了FVOC丰度的明显时间变化（图4，a-e）。对浓度数据（μg mL?1）进行单因素ANOVA显示，倍半萜β-石竹烯和较高分子量的醇2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙基醇在第1-4天的窗口达到峰值，然后随时间急剧下降（字母“a > b > c”分别对应第4天、8天和12天）。相比之下，乙基戊-4-烯碳酸酯在所有采样窗口中的浓度都很低，并且在第12天显示出轻微的增加趋势，时间窗口之间没有显著差异。

图4

使用PDMS管捕获的真菌头空间FVOCs的时间分辨生产谱型。从（a–e）G. clavigera和（f–i）T. atroviride的4天龄培养物中收集了4小时的头空间挥发物，使用活性炭push–pull采样（红色）和PDMS管（绿色）。彩色椭圆表示基于收集方法因素的显著聚类（PERMANOVA，p < 0.05）。

接下来，我们应用了fold-change分析（log?FC）结合Mann–Whitney检验和BH-FDR校正来识别在不同方法之间差异回收的化合物（图S2 a和b）。对于G. clavigera，碳push–pull采样显著富集了几种萜类化合物和高分子量化合物（例如α-蒎烯、o-二甲苯、乙基己醇、1-丁醇衍生物；log?FC > 3–7；BH调整后的p < 0.05）。相比之下，PDMS提取仅富集了少数化合物，最显著的是β-石竹烯（log?FC < -2.5；p < 0.05），这可能反映了其较低的挥发性和较高的疏水性（图S2a）。

对于T. atroviride，活性炭过滤器再次产生了大量的低分子量醇和萜类化合物（d-柠檬烯、1-丁醇衍生物、3-庚酮、α-蒎烯；log?FC = 3–10）。PDMS仅富集了一些低丰度化合物（例如6-氨基-α-吡酮；log?FC ≈ -2；p < 0.05），这与其对非极性、半挥发性代谢物的亲和力一致（图S2b）。

对于T. atroviride，活性炭过滤器再次产生了大量的低分子量醇和萜类化合物（d-柠檬烯、1-丁醇衍生物、3-庚酮、α-蒎烯；log?FC = 3–10）。PDMS仅富集了少数低丰度化合物（例如6-氨基-α-吡酮；log?FC ≈ -2；p < 0.05），这与其对非极性、半挥发性代谢物的亲和力一致（图S2b）。

可重复性

重新处理的PDMS管在所有采样窗口（2天、4天、8天、12天；每种处理n = 3）中捕获T. atroviride的FVOCs的效率与新鲜管相当。对于每种化合物×时间组合，我们计算了回收率，即重复使用PDMS中的平均丰度除以新鲜PDMS中的平均丰度。大多数比率集中在1.0左右（中位数≈1.1），表明重复使用和新鲜采样器的性能大致相似（图3a）。少数低丰度化合物显示出更大的变异性，但这种偏差在时间上并不系统，也没有一致地表明重复使用会导致回收率降低。

图3

PDMS管重复使用对FVOC回收效率的影响。 (a) T. atroviride Y145在收集间隔（2天、4天、8天、12天）内释放的14种挥发性化合物的平均FVOC回收率（重复使用/新鲜PDMS）。比率接近1.0表示重复使用和新鲜管之间的性能相当，而比率<0.8或>1.2分别表明回收不足或过度回收（虚线参考线）。 (b) 比较新鲜和重复使用PDMS管收集的平均FVOC丰度的散点图。沿着1:1虚线排列的点表明提取效率高度一致。

散点图比较了新鲜和重复使用的FVOC丰度，进一步证实了这一模式（图3b）。在所有采样窗口中，数据点紧密跟随1:1参考线，特别是对于主要化合物如6-氨基-α-吡酮、2-庚酮和2-壬酮。在早期时间点（2天和4天）的略微分散可能反映了低浓度时的相对测量噪声较高，而不是处理效果的一致性。

为了测试重复使用是否改变了整体的化学谱型，我们使用多变量分析比较了新鲜和重复处理的结果。VOC矩阵的PCA显示在每个时间点沿前两个主成分有分离的趋势，但95%置信椭圆有显著的重叠（图S3）。基于Bray–Curtis差异的PERMANOVA没有检测到处理的显著效果（F = 0.26，R2 = 0.012，p = 0.642），表明PDMS的重复使用仅解释了总组成方差的一小部分。

在化合物水平上，我们应用Wilcoxon秩和检验来比较每个采样窗口内的新鲜和重复使用的管子，同时使用BH程序控制误发现率。经过FDR校正后，没有化合物显示出显著差异（所有调整后的p > 0.45），包括主要挥发性化合物如6-氨基-α-吡酮、2-庚酮、2-壬烯、α-和β-菲兰德rene以及2-戊基呋喃（表S1）。

PDMS能够稳健地解析FVOC排放的时间序列动态

对于G. clavigera EL035，连续96小时窗口内部署的PDMS采样器捕获了FVOC丰度的明显时间变化（图4，a-e）。对浓度数据（μg mL?1）进行的单因素ANOVA显示，倍半萜β-石竹烯和较高分子量的醇2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和苯乙基醇在第1-4天窗口达到峰值，然后随时间急剧下降（字母“a > b > c”分别对应第4天、8天和12天）。相比之下，乙基戊-4-烯碳酸酯在所有采样窗口中的浓度都很低，并在第12天显示出轻微的增加趋势，时间窗口之间没有显著差异。

图4

使用PDMS管捕获的真菌头空间FVOCs的时间分辨生产谱型。从（a–e）G. clavigera和（f–i）T. atroviride的PDMS提取物中量化了三个连续时间窗口（第4天、8天和12天）内的主要FVOCs浓度，以评估挥发性排放的时间动态。通过单因素ANOVA进行显著性差异评估，然后使用Tukey’s HSD进行检验。条形图表示平均值±标准误差（n = 5），条形图上方的不同字母表示时间点内化合物之间的统计显著差异（p < 0.05）。

对于T. atroviride Y145，时间模式几乎相反（图4，f-i）。单萜β-菲兰德rene仅在第1-4天窗口被检测到，而在后续窗口中低于检测限（第8天和12天），这与Kruskal-Wallis检验结果一致（H = 13.29，p < 0.001）。相比之下，酮类2-庚酮和2-壬酮以及聚酮6-氨基-α-吡酮随在每个采样时间点（第2天、第4天、第8天和第12天）单独进行的PCA分析显示，在FVOC谱图中（图5a），两种形态类型得到了清晰的分离。在第2天，白色和绿色样本沿着PC1轴形成了两个明确的簇，表明在早期阶段，这两种形态的挥发性有机化合物（VOCs）的化学成分已有显著差异。这种分离在第4天仍然明显，并持续到第8天和第12天，每个时间点上，两种形态类型在排序空间中占据了不同的区域。PCA加载结果识别出了一组驱动这种分离的化合物，包括2-戊基呋喃、6-戊基-α-吡酮、α-和β-菲兰дрен、顺式胡椒醇、苯甲醇、2-庚醇、2-庚酮、2-壬酮和2-癸酮，尽管它们之间的相对贡献随时间有所变化。

图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了Trichoderma atroviride Y145中FVOC谱型随时间和形态类型的变化：(a) 使用PDMS管子在四个时间点（2天、4天、8天和12天）收集的顶空气FVOC谱的主成分分析（PCA）。点代表白色和绿色形态类型的生物样本，面板对应于不同的采样时间点。(b) 来自相同样本的PCA加载FVOCs的时间通量动态。通量（μg/mL·h?1）是通过对FVOC丰度进行归一化计算得出的。

PCA加载结果揭示了特定形态类型的排放轨迹：在早期采样窗口（第2-4天），单萜类和芳香化合物占主导地位，尤其是α-和β-菲兰дрен、2-戊基呋喃、苯甲醇和顺式胡椒醇的排放量有明显的脉冲现象。在前两个采样窗口中，这些挥发性化合物在不同形态类型之间的通量大小存在显著差异，这与第2天和第4天的PCA排序结果一致。随着培养物的成熟，排放谱型转向酮类和仲醇类：2-庚酮、2-庚醇、2-壬酮和2-癸酮在第8天和第12天的通量峰值明显，且绿色形态类型的通量始终较高。相比之下，苯甲醇和3-乙基phenol的通量在两种形态类型中均有所下降或保持较低水平，这表明这些酚类化合物主要在菌落早期发育阶段活跃。综合这些通量轨迹，可以看出绿色形态在FVOC产生方面表现出更早的开始和更强的后期增长，尤其是在酮类丰富的谱型中；而白色形态则在整个过程中保持较低的排放水平。

对每种化合物在每个时间点的浓度进行成对比较（使用多重检验校正的未配对t检验；图S5）仅发现少数挥发性化合物在特定时间点存在形态类型间的显著差异，主要体现在早期单萜类和后期酮类化合物之间。尽管由于样本量小和零膨胀效应，正式的统计显著性有限，但这些单变量结果与多变量排序和通量分析结果完全一致。这些发现共同表明，PDMS-溶剂萃取方法能够可靠地捕捉到Trichoderma atroviride Y145的白色和绿色形态类型之间持续的、随时间变化的FVOC差异，其中最大的效应出现在早期萜类化合物的脉冲期和后期酮类化合物的峰值期。

**讨论**
挥发性有机化合物（VOCs）在真菌生态学和相互作用中扮演着重要角色[4, 22]，但方法学上的不一致性仍然限制了不同研究之间的可比性。在这里，我们使用Trichoderma atroviride和G. clavigera作为模型系统，对影响真菌挥发性组学数据的关键方法学因素进行了全面评估。通过系统地研究溶剂效应、方法等效性（push-pull与PDMS）、吸附剂的可重复使用性、时间释放动态以及生理状态的敏感性，我们建立了一个稳健且可扩展的基于PDMS的工作流程。

溶剂的选择显著影响了从PDMS管中定量回收FVOCs的能力，但不影响其定性特征。二氯甲烷和乙醚回收了相同的可检测化合物集合，但DCM在关键单萜类化合物（特别是d-柠檬烯和β-菲兰дрен）的回收浓度上更为显著，而对6-戊基-α-吡酮的影响较弱且具有时间依赖性。这种化合物特异性的偏差与更广泛的VOC和天然产物萃取研究结果一致，这些研究表明溶剂极性和溶质理化性质决定了从吸附剂相中的解吸效率[23,24,25,26]。由于溶剂的选择改变了浓度估计值，而没有改变挥发性组成的分布，其主要影响在于定量解释而非化合物检测。这些结果强调了溶剂选择在基于PDMS的FVOC工作流程中的关键作用，并表明即使是高分辨率的GC–MS也无法弥补上游提取带来的偏差。

直接比较动态push-pull采样和静态PDMS采样方法发现，这两种方法提供了互补的、而非矛盾的真菌挥发性组学信息[27, 28]。push-pull采样方式更倾向于捕获高挥发性化合物，而PDMS则更有效地富集了低挥发性、疏水性的代谢物，这反映了气流制度和吸附动力学的根本差异[26, 30]。此外，我们的分析表明PDMS管可以在多次使用中重复使用而不引入显著的定性或定量偏差。任何重复使用带来的影响都很微弱，主要局限于低丰度化合物，并且相对于Trichoderma atroviride的自然排放变化来说可以忽略不计。因此，通过甲醇浸泡和氮气干燥进行的严格再处理有效地消除了“记忆效应”（残留化学痕迹），并防止了采样周期中的回收损失[29, 30]。我们关于PDMS耐用性和可重复性的观察结果与之前基于硅胶的微萃取应用一致，这些应用强调了该材料在捕获植物衍生天然产物方面的成本效益和可靠性[31]。

顺序PDMS采样方法检测到两种测试真菌物种的挥发物随时间的变化，且不同物种之间的变化类型也有所不同[32, 33]。早期生长阶段以单萜类和醇类化合物为主，这些化合物通常与初级代谢活动和活跃的菌丝扩展有关[33,34,35]。随着培养物的成熟，排放谱型转向酮类、大环内酯类和芳香衍生物，这与次级代谢激活和孢子形成过程相吻合[4, 33]。值得注意的是，这些变化模式具有物种特异性。Grosmannia clavigera的总VOC通量随时间显著下降，这可能与其与树皮甲虫的共生关系有关[36]。相比之下，Trichoderma atroviride的FVOC通量持续增加，其中6-戊基-α-吡酮占主导地位，这与它的竞争性腐生和拮抗策略相符[4, 14]。这些模式证实，FVOC排放不是生长过程的静态副产物，而是与真菌生理和生命史（即生长速度）紧密耦合的动态特征[37]。

优化的研究流程成功区分了Trichoderma atroviride的生理不同形态类型（白色菌丝体和绿色孢子形成体）。PCA分析中的清晰分离以及6-戊基-α-吡酮和β-菲兰др恩等化合物的形态类型特异性通量差异表明，形态发育阶段留下了可重复的化学特征[14, 33]。这确立了FVOC谱分析作为一种非破坏性的、化学信息明确的工具，可用于表征真菌的生理状态，对生物控制、发酵和代谢物发现具有直接意义[17]。

总体而言，这项工作验证了一种基于PDMS的挥发性组学方法，解决了FVOC研究中主要的分析前变异性问题。一个关键的限制是排放率是相对于采样时间而非生物量进行归一化的；结合生长或生物量指标将进一步增强生态学和代谢学的解释能力。此外，虽然我们证明了形态类型与挥发性组学之间的强相关性，但要明确因果关系还需要结合转录组学和靶向代谢组学方法。基于这些发现，我们建议：(1) 标准化溶剂萃取协议，其中DCM适用于广泛的化合物检测；(2) 在需要准确量化高挥发性化合物的同时，采用push-pull和PDMS采样作为互补方法；(3) 采用时间分辨采样设计来捕捉代谢动态；(4) 明确报告吸附剂处理和重复使用协议以确保结果的可重复性。这些建议共同提升了真菌挥发性组学的可靠性、可解释性和生物学相关性，为其在真菌生态学、进化和生物技术中的广泛应用奠定了基础。

**结论**
本研究建立了一个统一的、经过实证验证的真菌挥发性组学框架，将方法学严谨性与生物学解释相结合。我们证明了基于PDMS的采样方法具有稳健性、可重复性且信息丰富，同时溶剂选择和捕获策略系统性地影响了FVOC的定量回收方式。时间分辨分析显示，真菌揮发性组学是动态的、严格受调控的，并且具有很强的物种特异性，而不是生长的静态副产物。重要的是，FVOC谱型可靠地反映了真菌的生理状态，证明了它们作为敏感且非破坏性的发育和代谢转变指标的实用性。这些发现共同加强了真菌挥发性组学的方法学基础，并扩展了其在真菌生物学和生物技术领域的应用范围。